用于检测流感病毒的装置的制作方法

专利名称：用于检测流感病毒的装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测或定量流感病毒的装置、用于检测或定量流感病毒的试剂 盒、用于检测或定量流感病毒的方法、人类抗A型流感病毒核蛋白抗体和人类抗B型流感病 毒核蛋白抗体。
背景技术：
使用抗原-抗体反应的免疫测量方法被广泛用于测量样品中的待测量物，并且已 开发大量测量方法，例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、化学发光 酶免疫分析法、散射免疫比浊法和使用表面等离子体共振(SPR)的测量方法。最近，从简便性和速度的观点来看，免疫层析受到关注，许多基于这种技术的产品 已在市场上出现。免疫层析根据测量原理被分成直流型和侧流型；但是，侧流型免疫层析在 近年已变成主流。对于侧流型免疫层析而言，已报道的装置包含下列区域带有以允许迁移 的方式保持在支持物上的被标记抗体的区域，被标记抗体是以允许迁移的方式保持在支持 物上的抗体，其与被测量物结合并在其上结合有标记物；以及带有固定化的与被测量物结 合的抗体的区域。从古时起，流感就已在世界范围内周期性重复流行，并且每次都引起大量死亡；但 是，在1931年才检测到作为病因的病毒并发现阐明病因的方式。流感的致病性病毒，根据 在病毒内部发现的可溶性核蛋白(在后文中简称NP)的抗原性分成三种类型A型、B型和 丙型。此外，根据病毒表面上存在的两种包膜糖蛋白，红细胞凝集素(简称HA)和神经氨酸 酶(简称NA)将其分成亚型。从1972年起，已使用醚处理后用福尔马林失活的疫苗用于预防流感。近年中，除 了用于预防的疫苗之外，抗流感药剂已被发现并广泛用作治疗药剂。这些治疗药剂是例如 适用于B型流感病毒的盐酸金刚烷胺和适用于A型流感病毒和A型的扎那米韦和磷酸奥司 他韦。在选择这些治疗药剂时，重要的是检测样品中的流感病毒并确定感染是否由流感 病毒引起，以及病毒的类型是A型还是B型。此外，A型流感病毒与B型流感病毒相比具有 更强的传染性并引起更严重的症状；因此，确定所感染病毒的类型对于早期治疗是重要的。常规情况下，流感病毒的检测使用抗流感病毒抗体进行。已知的针对流感病毒的 抗体是识别HA区的抗体、识别NA区的抗体、识别基质蛋白(例如Ml)的抗体、识别非结构 蛋白(例如NSl)的抗体、特异性识别NP的抗体等。此外，在非专利文献1和非专利文献2 中描述的抗体被称为人类抗A型流感病毒核蛋白抗体。近些时候，已经开发了用于容易和快速检测流感病毒的免疫层析装置[参见专 利文献1到14]，并且大量产品已经供应市场[例如“ESPLINE Influenza A&B-N，，(由 Fujirebio Inc.制 造)；"QuickVueRapid SP influ，，(由 DS Pharma Biomedical Co. , Ltd.制造)；"POCTEMInfluenza A/B，，(由 Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd.禾口 SysmexCorporation 制造)；"Clearview-Influenza A/B，，(由 Sanwa Kagaku Co.Ltd制造)；"Quick S-Influ Α/Β “Seiken""(由 Denka Seiken Co. Ltd 制造)；"Quick Ex-Flu‘、eiken，，，，(由 Denka Seiken Co. Ltd 制造)；"Rapid Testa FLU stick，，(由 Daichi Pure Chemicals Co. Ltd 制造)；"Capilia Flu A ;B，，(由 Alfresa Pharma Corporation 制 造)以及 ‘‘QuickChaser Flu A，B” (由 Mizuho Medy Co. Ltd.制造)]。现有技术文献专利文献专利文献1 :W0 2005/007697，小册子专利文献2 =WO 2005/007698，小册子专利文献3 日本实用新型登记号No. 3088698专利文献4 日本专利申请公开公布号No. (JP-A) 2004-279208(未经审查的出版 的日本专利申请)专利文献5 JP-A (Kokai) 2004-279158专利文献6 JP-A (Kokai) 2006-189317专利文献7 JP-A (Kokai) 2006-194687专利文献8 JP-A (Kokai) 2006-194688专利文献9 JP-A (Kokai) 2007-93292专利文献10 JP-A (Kokai) 2007-33293
专利文献 11 JP-A (Kokai) 2006-153523专利文献12 JP-A (Kokai) 2006-67979专利文献13 JP-A (Kokai) 2000-55918专利文献14 JP-A (Kokai) 2007-33293非专利文献非专利文献1 Journal of General Virology, Vol. 64，p. 697-700(1983)非专利文献2 =Nature Vol. 453，p. 667-672 (2008)发明简述[本发明待解决的问题]但是，在这些装置中使用的抗体都是非人类抗体，使得对于应用来说灵敏性不够， 对重复突变的流感病毒的特异性也不足。因此，需要开发用于检测或定量流感病毒的装置、 用于检测或定量流感病毒的试剂盒、产生足够的灵敏性并具有广泛特异性的用于检测或定 量流感病毒的方法，以及适合于检测或定量流感病毒的抗体。[解决问题的手段]为了解决这些问题，本发明人进行了专门研究，结果发现，人类抗流感病毒核蛋白 抗体可用于检测或定量流感病毒的装置和检测或定量流感病毒的试剂盒。此外，他们发现 可以从接种流感疫苗的人类获取的淋巴细胞中获得具有高亲和力的抗体，因此他们完成了 本发明。因此，本发明涉及下列[1]到[37][1] 一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含带有固定化在 支持物上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的检测区、样品供应区和样品迁移区；[2] 一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含带有固定化在 支持物上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)的检测区、样品供应区和样品迁移区，其中从样品供应区提供带有与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合的标记物的标记抗体，并且其 中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[3] 一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含带有固定化在 支持物上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)的检测区、以允许迁移的方式保持在支持物上 的带有与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合的标记物的标记抗体的标记试剂区、样品供 应区和样品迁移区，其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[4] [2]或[3]的装置，其还包含至少一个选自展开溶液供应区、过量液体吸收区 和样品供应验证区的区域；[5] [1]到[4]任一项的装置，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感 病毒核蛋白抗体；[6] [5]的装置，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病毒核蛋 白单克隆抗体，其与A型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应；[7] [6]的装置，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基 酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗 体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一个的氨基酸序列；[8] [1]到[4]任一项的装置，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感 病毒核蛋白抗体；[9] [8]的装置，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病毒核蛋 白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应；[10] [9]的装置，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的轻链 可变区的氨基酸序列包含SEQ IDNO 28的氨基酸序列；[11] 一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含有固定在载体上的人类抗流 感病毒核蛋白抗体的固相；[12] 一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含有固定在载体上的抗流感病 毒核蛋白抗体(抗体1)的固相和含有抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻的试剂，并且其中 抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[13] 一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和含有标记抗体的试 剂，所述固相中抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)固定在载体上，所述标记抗体中的标记物 与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合，并且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗 流感病毒核蛋白抗体；[14] 一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和含有标记的抗原类似 物的试剂，所述固相中人类抗流感病毒核蛋白抗体固定在载体上，所述标记的抗原类似物 中的标记物与流感病毒核蛋白抗原类似物结合；[15] 一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和含有标记抗体的试 剂，所述固相中流感病毒核蛋白抗原类似物固定在载体上，所述标记抗体中标记物与人类 抗流感病毒核蛋白抗体结合；[16] [11]到[15]任一项的试剂盒，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型 流感病毒核蛋白抗体；
[17] [16]的试剂盒，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，其与A型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反 应；[18] [17]的试剂盒，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单克 隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一个的氨基酸序列；[19] [11]到[15]任一项的试剂盒，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型 流感病毒核蛋白抗体；[20] [19]的试剂盒，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反 应；[21] [20]的试剂盒，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的轻 链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列；[22] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的人类抗流感病毒核蛋白抗体反应；以及(2)测量在步骤(1)中产生的物理变化；[23] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上 形成抗体1/流感病毒核蛋白复合物；(2)将步骤(1)中在载体上形成的复合物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻进行 反应；以及(3)测量在步骤O)中产生的物理变化；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[24] [22]或[23]的方法，其中物理变化是浊度变化或质量变化；[25] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上 形成抗体1/流感病毒核蛋白复合物；(2)将步骤(1)中在载体上形成的复合物与标记抗体(标记的抗体2)进行反应， 所述标记的抗体的标记与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合以在载体上形成抗体1/流 感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物中的 标记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[26] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与标记抗体(标记的抗体2、反应，所述标记抗体中标记物与抗流感病 毒核蛋白抗体(抗体2、结合，以形成标记的抗体2/流感病毒核蛋白复合物；(2)将步骤(1)中形成的复合物与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上形成抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物中的 标记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体；[27] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)在同时存在抗原类似物的情况下将样品与固定在载体上的人类抗流感病毒核 蛋白抗体反应，以在载体上形成人类抗流感病毒核蛋白抗体/流感病毒核蛋白复合物和人 类抗流感病毒核蛋白抗体/标记的抗原类似物复合物，所述标记的抗原类似物中标记物与 流感病毒核蛋白抗原类似物结合；(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物；[28] 一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)在同时存在标记抗体的情况下将样品与固定在载体上的流感病毒核蛋白抗原 类似物反应，以在载体上形成流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物，所述标记抗 体中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结合，；(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物；[29] [22]到[28]任一项的方法，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流 感病毒核蛋白抗体；[30] [29]的方法，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，其与A型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反 应；[31] [30]的方法，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆 抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一个的氨基酸序列；[32] [22]到[28]任一项的方法，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流 感病毒核蛋白抗体；[33] [32]的方法，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反 应；[34] [33]的方法，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的轻链 可变区的氨基酸序列包含SEQID NO 28的氨基酸序列；[35] 一种人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与A型流感病毒核蛋白特异 性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 8到13任一个的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 22到27任一个的 氨基酸序列；[36] 一种人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应；以及[37] 一种人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异 性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列。本发明的效果本发明提供了用于检测或定量流感病毒的装置、用于检测或定量流感病毒的试剂 盒、高度灵敏并具有广泛特异性的检测或定量流感病毒的方法，以及适用于检测或定量流 感病毒的抗体。附图简述

图1显示了本发明的装置的反应(免疫层析反应)模式。(a)样品供应区；(b)标 记试剂区；(c)检测区；(d)样品迁移区；(e)展开溶液供应区；(f)样品供应验证区；以及 (g)过量液体吸收区。(1)显示了本发明的装置的反应模式，其包含样品供应区、标记试剂 区、样品迁移区和检测区。(2)显示了本发明的装置的反应模式，其中(1)的样品供应区也 起到标记试剂区的作用。(3)显示了本发明的装置的反应模式，其中(1)还包含展开溶液供 应区、样品供应验证区和过量液体吸收区。图2-a显示了本发明的使用人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的装置(实施例1的 装置)的免疫层析图。图2-a显示了使用各种不同的用于检测区(在图中标为“固相”)的 抗体和用于标记(在图中标为“标记物”)的抗体的组合的装置的免疫层析图。图2-b显示了本发明的使用人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的装置(实施例1的 装置)的免疫层析图。图2-b显示了使用23G268作为用于检测区(在图中标为“固相”) 的抗体和23G285作为用于标记(在图中标为“标记物”)的抗体的装置的免疫层析图。图3显示了本发明的使用人类抗B型流感病毒核蛋白抗体的装置(实施例1的装 置)的免疫层析图。图4_a显示了在本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体的生产中使用的抗体Y链 表达载体和抗体λ链表达载体。图4-a显示了用于表达抗体重链的载体。图4_b显示了在本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体的生产中使用的抗体Y链 表达载体和抗体λ链表达载体。图4-b显示了用于表达抗体轻链的载体1。图4-C显示了在本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体的生产中使用的抗体Y链 表达载体和抗体λ链表达载体。图4-c显示了用于表达抗体轻链的载体2。图5-a显示了本发明的人类抗A型流感病毒核蛋白抗体对流感病毒核蛋白抗原的 竞争性抑制分析(特异性结合分析)的结果。图5_b显示了本发明的人类抗B型流感病毒核蛋白抗体对流感病毒核蛋白抗原的 竞争性抑制分析(特异性结合分析)的结果。图6显示了本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体的特异性。图7显示了本发明的人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的组合与灵敏性以及特异性 之间的关系。图8显示了本发明的人类抗B型流感病毒核蛋白抗体和可商购的小鼠抗B型流感 病毒抗体与灵敏性以及特异性之间的关系。图9-a是传感图，显示了可商购的小鼠抗A型流感病毒核蛋白抗体M322211与流感病毒的结合能力。图9-b是传感图，显示了本发明的人类抗A型流感病毒核蛋白抗体23G272与流感 病毒的结合能力。图9-c显示了每种本发明的抗体结合的流感病毒的量。图10显示了每种本发明的抗A型流感病毒核蛋白抗体的抗原结合能力。图11-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G268的H链的编码DNA(SEQ ID NO :1)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图11-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G268的L链的编码DNA(SEQ ID NO 15)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图11-c显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G268的H链的氨基酸序列 (SEQ ID NO :8)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图11-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G268的L链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:22)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图12-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G272的H链的编码DNA(SEQ ID NO :2)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图12-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G272的L链的编码DNA(SEQ ID NO 16)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图12-C显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G272的H链的氨基酸序列 (SEQ ID NO :9)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图12-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G272的L链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:23)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图13-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G285的H链的编码DNA(SEQ ID NO :3)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图13-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G285的L链的编码DNA(SEQ ID NO 17)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图13-c显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G285的H链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:10)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图13-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G285的L链的氨基酸序列 (SEQ ID NO 24) 0下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图14-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G312的H链的编码DNA(SEQ ID NO 4)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图14-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G312的L链的编码DNA(SEQ IDNO 18)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图14-c显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G312的H链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:11)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图14-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G312的L链的氨基酸序列 (SEQ ID NO 25) 0下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图15-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G447的H链的编码DNA(SEQ ID NO :5)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图15-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G447的L链的编码DNA(SEQ ID NO 19)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图15-c显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G447的H链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:12)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图15-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G447的L链的氨基酸序列 (SEQ ID NO 26) 0下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图16-a显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G494的H链的编码DNA(SEQ ID NO :6)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图16-b显示了人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G494的L链的编码DNA(SEQ ID NO 20)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图16-c显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G494的H链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:13)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图16-d显示了对应于人类抗A型流感病毒蛋白抗体23G494的L链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:27)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图17-a显示了人类抗B型流感病毒蛋白抗体23G327的H链的编码DNA(SEQ ID NO :7)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、 2和3的DNA序列。图17-b显示了人类抗B型流感病毒蛋白抗体23G327的L链的编码DNA(SEQ ID NO 21)。下划线部分标出了对应于框架1、2和3的DNA序列，加框部分标出了对应于CDR 1、2和3的DNA序列。图17-c显示了对应于人类抗B型流感病毒蛋白抗体23G327的H链的氨基酸序列 (SEQ ID N0:14)。下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。图17-d显示了对应于人类抗B型流感病毒蛋白抗体23G327的L链的氨基酸序列 (SEQ ID NO 28) 0下划线、双下划线和波形线分别标出了 CDR 1、2和3。执,行本发明的方式[用于检测或定量流感病毒的装置]本发明的用于检测或定量流感病毒的装置是能够用于检测或定量流感病毒的装
13置，具体来说，它们是适合于免疫层析等的装置。本发明的装置可以是直通型或侧流型的。本发明的用于检测或定量流感病毒的装置的实施方案，包括包含检测区、样品供 应区和样品迁移区的装置，其中检测区中的支持物在其上固定化有人类抗流感病毒核蛋白 抗体。装置适合石英晶体微天平OiCM)传感器或碳纳米管(CNT)传感器。在向样品供应区 供应样品后，样品展开通过样品迁移区，在检测区中发生抗体与样品中存在的流感病毒核 蛋白之间的反应，并且在这之后，在检测区中发生了物理变化。物理变化的实例包括浊度变 化和质量变化。通过测量这样的物理变化，可以对样品中的流感病毒核蛋白进行检测或定 量。因为流感病毒核蛋白存在于流感病毒中，因此流感病毒核蛋白的检测或定量能够检测 或定量流感病毒。本发明的用于检测或定量流感病毒的装置的另一个实施方案，包括含有检测区、 样品供应区和样品迁移区的装置，其中在检测区中，抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)被固 定化在构成该区的支持物上，从样品供应区供应带有与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)结 合的标记物的标记抗体，并且抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。 尽管这些装置不包含标记试剂区，但标记抗体与样品一起从样品供应区供应。通过标记抗 体与样品中的流感病毒核蛋白之间的反应所产生的流感病毒核蛋白/标记抗体复合物，通 过样品迁移区到达检测区。复合物与检测区中固定化的抗体1反应，并在检测区中产生抗 体1/流感病毒核蛋白/标记抗体复合物。通过在产生的抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗 体复合物中检测标记物，可以对流感病毒进行检测或定量。本发明的用于检测或定量流感病毒的装置的另一个实施方案，包括含有检测区、 样品供应区、样品迁移区和标记试剂区的装置，其中在检测区中，抗流感病毒核蛋白抗体 (抗体1)被固定化在构成该区的支持物上，带有与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合的 标记物的标记抗体以允许迁移的方式保持在标记试剂区中，并且抗体1和抗体2中的至少 一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。在这种装置中，供应到样品供应区的样品展开通过样 品迁移区并达到标记试剂区。在标记试剂区中，样品中的流感病毒核蛋白与标记抗体反应 并产生流感病毒核蛋白/标记抗体复合物。产生的复合物通过样品迁移区进一步展开并到 达检测区。在检测区中发生这些复合物与固定化的抗体1之间的反应，并在检测区中产生 抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体复合物。在产生的抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体 复合物中标记物的检测，能够检测或定量样品中的流感病毒。在这种装置中，样品供应区也 可以起到标记试剂区的作用[参见图1(1)和1(2)]。此外，本发明的用于检测或定量流感病毒的装置还包括含有带有固定化到支持物 上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的检测区、样品供应区和样品迁移区的装置，其中从样品 供应区供应标记的抗原类似物，所述的标记的抗原类似物中标记物与流感病毒核蛋白抗原 结合；以及含有带有固定化到支持物上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的检测区、标记试剂 区、样品供应区和样品迁移区的装置，所述标记试剂区有标记的抗原类似物，所述标记的抗 原类似物中标记物与流感病毒核蛋白抗原结合，所述流感病毒核蛋白抗原以允许迁移的方 式保持在支持物上。此外，本发明的用于检测或定量流感病毒的装置还包括包含在支持物上固定化有 流感病毒核蛋白抗原类似物的检测区、样品供应区和样品迁移区的装置，其中从样品供应 区供应标记抗体，所述标记抗体中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结合；以及包含在支持物上固定化有流感病毒核蛋白抗原类似物的检测区、具有标记抗体的标记试剂区、样 品供应区和样品迁移区的装置，所述标记抗体中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结 合，所述人类抗流感病毒核蛋白抗体以允许迁移的方式保持在支持物上。对于在使用本发明的装置检测或定量流感病毒中使用的样品没有具体限制，只要 它们是从人类收集的可能含有流感病毒的样品即可，其实例包括生物样品例如鼻腔拭子、 鼻腔吸出物、咽拭子和漱口物。在本发明中，这些生物样品可以原样使用，并且也可以使用 预处理的生物样品。对于用于预处理的预处理药剂没有具体限制，只要它们是破坏流感病 毒的核并能够与抗流感病毒核蛋白抗体反应的预处理药剂即可，其实例包括表面活性剂。 表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性 离子表面活性剂，优选的是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的实例是聚氧乙烯类型 的表面活性剂(例如Nonidet P-40)。此外，如果需要，在预处理药剂中可以包含水性溶剂、 缓冲液、防腐剂、盐类、糖类、金属离子、蛋白质等。水性溶剂的实例包括去离子水、蒸馏水和 膜过滤水。缓冲液的实例包括乳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓 冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、赖氨酸缓冲 液、巴比妥酸缓冲液、咪唑缓冲液、苹果酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐 缓冲液、碳酸盐缓冲液和Good缓冲液。Good缓冲液的实例包括Tris [三(羟甲基)氨基甲 烷]缓冲液、MES (2-吗啉乙磺酸)缓冲液、Bis-Tris [双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基) 甲烷]缓冲液、ADA [N-乙酰胺)亚氨基二乙酸]缓冲液、PIPES [哌嗪-N，N’ -双O-乙 磺酸)]缓冲液、ACES {2-[N-乙酰胺)氨基]乙磺酸}缓冲液、MOPSO (3-吗啉-2-羟基 丙磺酸)缓冲液、BES {2-[N，N-双O-羟乙基)氨基]乙磺酸}缓冲液、MOPS (3-吗啉丙磺 酸)缓冲液、TES<2-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸>缓冲液、HEPES[N-(2-羟 乙基)-N，-(2-磺乙基)哌嗪]缓冲液、DIPSO {3-[N, N-双(2-羟乙基)氨基]_2_羟基 丙磺酸}缓冲液、TAPSO <2-羟基-3-{[N-三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸>缓冲液、 POPSO [哌嗪-N，N，-双(2-羟基丙烷-3-磺酸)]缓冲液、HEPPSO [N- (2-羟乙基)-N，- (2-羟 基-3-磺丙基)哌嗪]缓冲液、EPPS[N-(2-羟乙基)-N’ -(3-磺丙基)哌嗪]缓冲液、 Tricine[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]缓冲液、Bicine[N，N-双羟乙基)甘氨酸]缓 冲液、TAPS{3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸}缓冲液、CHES[2-(N-环己基氨基)乙 磺酸]缓冲液、CAPSO [3-(N-环己基氨基)-2-羟基丙磺酸]缓冲液和CAPS [3-(N-环己基 氨基)丙磺酸]。防腐剂的实例包括叠氮钠和抗生素。盐类的实例包括碱金属卤化物盐例如氯 化钠和氯化钾。糖类的实例包括甘露糖醇、山梨糖醇和蔗糖。金属离子的实例包括镁离 子、锰离子和锌离子。蛋白质的实例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、Block Ace (由 DainipponPharmaceutical 制造)禾口云力物血清。下面，在图1(1)的基础上对本发明的装置的实例进行解释。当向样品供应区加入样品时，样品通过毛细作用在支持物上展开并到达标记试剂 区。在该标记试剂区中，样品中的流感病毒核蛋白与标记抗体2反应，在标记试剂区中产生 流感病毒核蛋白/标记抗体复合物(复合物1)，在标记抗体2中，标记物与抗流感病毒核 蛋白抗体(抗体2)结合。产生的复合物1通过毛细作用在支持物上进一步展开，并到达检 测区。到达检测区的复合物1与该区域中固定化的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，并产生了固定化在支持物上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物(复合物2)。 接下来，通过测量产生的复合物2的标记物，可以对样品中的流感病毒进行检测或定量。在 此，抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。抗体1和抗体2的组合 的实例包括人类抗流感病毒核蛋白抗体/非人类抗流感病毒核蛋白抗体组合、非人类抗流 感病毒核蛋白抗体/人类抗流感病毒核蛋白抗体组合，以及人类抗流感病毒核蛋白抗体/ 人类抗流感病毒核蛋白抗体组合。作为检测或定量目标的流感病毒的实例包括A型流感病毒和B型流感病毒。因为 流感病毒核蛋白是存在于流感病毒的核中的蛋白并因而是流感病毒的一个组成成分，因此 通过测量流感病毒核蛋白能够检测或定量样品中的流感病毒。当使用本发明的装置检测或定量A型流感病毒时，抗A型流感病毒核蛋白抗体 (抗体Al)被用作抗体1，抗A型流感病毒核蛋白抗体(抗体似)被用作抗体2。抗体Al和 抗体A2中的一个是人类抗体，更具体来说是人类抗A型流感病毒核蛋白抗体。抗体Al和 抗体A2的组合的实例包括人类抗A型流感病毒核蛋白抗体与人类抗A型流感病毒核蛋白 抗体的组合、人类抗A型流感病毒核蛋白抗体与非人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的组合， 以及非人类抗A型流感病毒核蛋白抗体与人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的组合。人类抗 A型流感病毒核蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下是单克隆抗体。 在单克隆抗体的情况下，A型流感病毒核蛋白中被抗体Al识别的区域和A型流感病毒核蛋 白被抗体A2识别的区域可以是相同的，也可以不同，并且优选是不同的。当使用本发明的 装置检测或定量A型流感病毒时，在标记试剂区中产生了 A型流感病毒核蛋白/标记抗体 A2的移动复合物(复合物Al)，并在检测区中产生了抗体A1/A型流感病毒核蛋白/标记抗 体A2的固定化的复合物(复合物A2)。当使用本发明的装置检测或定量B型流感病毒时，抗B型流感病毒核蛋白抗体 (抗体Bi)被用作抗体1，抗B型流感病毒核蛋白抗体(抗体B2)被用作抗体2。抗体Bl和 抗体B2中的一个是人类抗体，更具体来说是人类抗B型流感病毒核蛋白抗体。抗体Bl和 抗体B2的组合的实例包括人类抗B型流感病毒核蛋白抗体与人类抗B型流感病毒核蛋白 抗体的组合、人类抗B型流感病毒核蛋白抗体与非人类抗B型流感病毒核蛋白抗体的组合， 以及非人类抗B型流感病毒核蛋白抗体与人类抗B型流感病毒核蛋白抗体的组合。人类抗 B型流感病毒核蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下是单克隆抗体。 在单克隆抗体的情况下，B型流感病毒核蛋白中被抗体Bl识别的区域和B型流感病毒核蛋 白被抗体B2识别的区域可以是相同的，也可以不同，并且优选是不同的。当使用本发明的 装置检测或定量B型流感病毒时，在标记试剂区中产生了 B型流感病毒核蛋白/标记抗体 B2的移动的复合物(复合物B 1)，并在检测区中产生了抗体B1/B型流感病毒核蛋白/标 记抗体B2的固定化的复合物(复合物B2)。人类抗A型流感病毒核蛋白抗体的实例包括下面所述的人类抗A型流感病毒核蛋 白抗体。人类抗B型流感病毒核蛋白抗体的实例包括下面所述的人类抗B型流感病毒核蛋 白抗体。本发明的用于检测或定量流感病毒的装置还可以包含一个或多个选自展开溶液 供应区、过量液体吸收区和样品供应验证区的区域。添加到展开溶液供应区的展开溶液通 过毛细作用在支持物上展开，并使样品迁移到标记试剂区，也使在标记试剂区中产生的复合物1(复合物Al ；复合物Bi)迁移到检测区。展开溶液供应区也可以起到样品供应区的 作用。不包括在检测区中产生的复合物2 (复合物A2;复合物B2)的过量液体在过量液体 吸收区中被吸收。此外，样品的加入可以通过提供含有固定化在支持物上的抗人类IgG抗 体的样品供应验证区来验证。-支持物对于本发明装置中的支持物没有具体限制，只要它是允许溶液在样品迁移区中展 开的材料即可，实例包括玻璃纤维、纤维素、尼龙、交联葡聚糖、各种类型的层析纸、硝酸纤 维素以及金属例如金。该支持物的尺寸没有限制，优选的是宽度在3mm到IOmm左右、长度 在30mm到IOOmm左右的条板。可以使用厚度为100 μ m到Imm的支持物。此外，支持物可 以在用例如蔗糖、酪蛋白或动物血清例如牛血清白蛋白(BSA)和酪蛋白阻断部分或全部支 持物后使用，以防止在测量时来自样品的蛋白非特异性吸附到支持物上。-检测区抗流感病毒核蛋白抗体被固定化在本发明的装置的检测区中。检测区可以与支 持物分开形成，但在优选情况下它形成在支持物上。固定化在检测区中的抗流感病毒核蛋 白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并优选是单克隆抗体。固定化在检测区中的抗流 感病毒核蛋白抗体和形成了以允许迁移的方式保持在标记试剂区中的标记的抗流感病毒 核蛋白抗体的抗流感病毒核蛋白抗体中的至少一个是人类抗体，并且两种抗体优选都是单 克隆抗体。固定化在检测区中的抗流感病毒核蛋白抗体的实例包括下面描述的人类抗A 型流感病毒核蛋白抗体、人类抗B型流感病毒核蛋白抗体以及这些人类抗体的片段[Fab， F(ab，)2，F(ab，)]。用于将抗流感病毒核蛋白抗体固定化到检测区的方法的实例，包括将抗流感病毒 核蛋白抗体直接物理吸附到支持物上的方法和通过化学键例如共价键将抗体固定到支持 物上的方法。此外，可以将抗流感病毒核蛋白抗体与不溶性载体粒子结合，并将它们包含在 支持物中。不溶性载体粒子的实例包括聚苯乙烯乳胶粒子、磁性粒子和玻璃纤维。用于将 抗流感病毒核蛋白抗体与不溶性载体粒子结合的方法的实例，包括上述的物理吸附和化学
纟口口。检测区位于标记试剂区、样品供应区、样品迁移区和展开溶液供应区的下游，并位 于过量液体吸收区的上游。-标记试剂区在本发明的装置的标记试剂区中，标记抗体以允许迁移的方式保持，所述标记抗 体中，标记物与抗流感病毒核蛋白抗体结合。标记试剂区可以与支持物分开形成，但在优选 情况下它形成在支持物上。形成了以允许迁移的方式保持在标记试剂区中的标记的抗流感 病毒核蛋白抗体的抗流感病毒核蛋白抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并优选为单 克隆抗体。以允许迁移的方式保持在标记试剂区中的抗流感病毒核蛋白抗体的实例，包括 下面描述的人类抗A型流感病毒核蛋白抗体、人类抗B型流感病毒核蛋白抗体以及这些人 类抗体的片段[Fab，F(ab’)2，F(ab’)]。用于构建标记试剂区的方法的实例包括将含有标 记抗体的试剂点样到支持物上的方法，以及将浸渍有含标记抗体试剂的吸水性衬垫层化在 支持物上的方法。吸水性衬垫的实例包括用于下面所述的样品供应区中的吸水性衬垫。形成标记抗体的标记物的实例包括酶例如过氧化物酶、碱性磷酸酶和β -D-半乳糖苷酶、金属胶体粒子例如金胶体粒子和硒胶体粒子、有色乳胶粒子、发光物质和荧光物 质。用于制备标记抗体的方法的实例，包括通过共价键将标记物和抗体连接的方法以 及通过非共价键将标记物和抗体连接的方法。具体来说，实例包括已知方法例如戊二醛方 法、高碘酸方法、马来酰亚胺方法、吡啶基-二硫化物方法，以及使用各种不同类型交联剂 的方法[参见Tanpakushitsu Kakusan Koso (蛋白质、核酸禾口醇(Protein，Nucleic Acidand Enzyme)), (31 Supp 1), pp. 37-45 (1985) ] 0可以使用的交联剂的实例包括N-琥珀酰亚胺 基-4-马来酰亚胺基丁酸酯(GMBQ、N-琥珀酰亚胺基-6-马来酰亚胺基己酸酯和N-琥珀 酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯。在利用共价键的方法中，可以使 用抗体上存在的官能团，并且可以通过常规方法引入例如官能团例如氨基、羧基、羟基、巯 基，然后可以通过上面提到的方法制备标记抗体。此外，通过非共价结合的方法的实例包括 物理吸附方法。-样品供应区本发明的装置中的样品供应区位于检测区的上游，并且通过该区域供应样品。样 品供应区形成在支持物中，并且该区域也可以通过将吸水性衬垫层化在支持物上来形成。 支持物和形成样品供应区的吸水性衬垫在适合情况下可以包含盐类、表面活性剂等。盐类 和表面活性剂的实例包括上面提到的盐类和表面活性剂。吸水性衬垫的实例包括例如玻璃 纤维、纤维素、无纺布和聚乙烯醇。此外，样品供应区也可以起到上面提到的标记试剂区的作用，并且在这种情况下， 通过将浸渍有含标记抗体试剂的吸水性衬垫层化在支持物上，可以有效地吸收样品。对于 吸水性衬垫没有具体限制，只要它是吸收标记抗体和流感病毒核蛋白并显示出低的吸附性 的材料即可，其实例包括上面描述的那些。-样品迁移区本发明的装置的样品迁移区存在于整个支持物上，并且是样品、标记抗体和下面 描述的展开溶液迁移的区域。供应到样品供应区的样品与标记抗体一起运输通过样品迁移 区到检测区。此外，样品可以由从下述展开溶液供应区供应的展开溶液运输通过样品迁移 区到检测区。-展开溶液供应区本发明的装置中的展开溶液供应区被提供在支持物的一个末端，是供应展开溶液 的区域。通过使已经向样品供应区供应了样品的装置的展开溶液供应区浸透展开溶液，样 品可以由于展开溶液的作用在支持物上迁移，并通过样品迁移区运输到检测区。在此过程 中，样品中的流感病毒核蛋白与在标记试剂区中的标记抗体反应，产生的移动的标记抗体/ 流感病毒核蛋白复合物进一步运输到检测区，并在检测区中产生抗流感病毒核蛋白抗体/ 流感病毒核蛋白/标记抗体复合物。样品可以不使用展开溶液在支持物上展开，并且通过 使用展开溶液，样品可以有效展开。展开溶液是使样品在支持物上展开的水性溶剂；此外， 如果需要，该水性溶剂可以包括添加剂，例如上面提到的缓冲液、表面活性剂、防腐剂、盐 类、糖类、金属离子和蛋白质。-样品供应验证区本发明的装置中的样品供应验证区提供在过量液体吸收区上游，是用于确定验证样品已被加到装置的样品供应区的区域。在使用两种抗体(抗体1和抗体幻的本发明的装置中，当样品供应到样品供应区 时，未反应的标记抗体和通过样品中的流感病毒核蛋白与标记抗体(标记的抗流感病毒核 蛋白抗体)之间的反应形成的流感病毒核蛋白/标记抗体复合物一起，展开通过样品迁移 区。因此，当样品确实供应时，未反应的标记抗体展开通过样品迁移区。样品供应验证区是 捕获这些未反应的标记抗体的区域，并且可以通过固定化和固定针对标记抗体的抗体来构 建。与标记抗体反应的抗体的实例包括针对抗流感病毒核蛋白抗体的抗体和针对标记物的 抗体。用于固定化与标记抗体反应的抗体的方法的实例，包括上面提到的在检测区中固定 化抗体的方法。此外，样品供应验证区也可以通过固定化和固定针对样品中共同包含的物 质(例如酶)的抗体来构建(参见图1的(3))。同样地，在使用单个抗体的本发明的装置中，可以通过固定化和固定针对样品中 共同包含的物质(例如酶)的抗体、针对标记的抗原类似物(标记的流感病毒核蛋白抗原 类似物)的抗体或针对标记抗体(标记的人类抗流感病毒核蛋白抗体)的抗体，来构建样 品供应验证区。-过量液体吸收区本发明的装置中的过量液体吸收区被提供在支持物上的最下游。概括来说，与展 开溶液一起在支持物上展开的样品和标记抗体被捕获在检测区中以产生抗流感核蛋白抗 体/流感核蛋白/标记抗体复合物，而该区域用于在复合物产生后吸收过量液体。过量液 体吸收区可以从支持物形成，它也可以通过向支持物附加吸水性物质来形成，或者它也可 以通过将吸水性物质层化在支持物上来形成。吸水性物质的实例包括高度吸水性滤纸和海 绵。[使用装置检测和定量流感病毒]使用本发明的装置检测和定量流感病毒，可以如下所示进行。-实施方案1供应到样品供应区的样品展开通过检测迁移区并到达检测区。在检测区，样品中 的流感病毒核蛋白与人类抗流感病毒核蛋白抗体反应形成流感病毒核蛋白/人类抗流感 病毒核蛋白抗体复合物。通过测量与该复合物形成相伴的物理变化，可以对流感病毒进行 检测和定量。本文中的物理变化的实例包括质量变化。-实施方案2供应到样品供应区的样品和标记抗体(标记的抗流感病毒核蛋白抗体)展开通过 检测迁移区并到达检测区。在供应或展开步骤过程中产生的流感病毒核蛋白/标记抗体复 合物与检测区中的抗流感病毒核蛋白抗体反应，产生抗流感病毒核蛋白抗体/流感病毒核 蛋白/标记抗体复合物。通过测量检测区中产生的这些抗流感病毒核蛋白抗体/流感病毒 核蛋白/标记抗体复合物中的标记物，可以对流感病毒进行检测或定量。-实施方案3供应到样品供应区的样品在标记试剂区中与标记的抗流感病毒核蛋白抗体(标 记抗体2、反应并产生流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物(复合物1)。然后，展开通过样 品迁移区到检测区的复合物1与检测区中的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，在检测 区中产生固定化形式的抗体1/抗流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物(复合物2~)，并通过测量过检测区中产生的复合物2的标记物，可以对流感病毒进行检测或定量。在这里，抗体 1和构成标记的抗流感病毒核蛋白抗体(标记抗体幻的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2) 中的至少一种是人类抗体。展开溶液也可以用于供应到样品供应区的样品的展开以及在标 记试剂区中产生的复合物1向检测区的展开。-实施方案4供应到样品供应区的样品和标记的抗原类似物(标记的流感病毒核蛋白抗原类 似物)展开通过检测迁移区并到达检测区。在检测区中，样品中的流感病毒核蛋白抗原与 标记的抗原类似物竞争性地与人类抗流感病毒核蛋白抗体反应，导致产生人类抗流感病毒 核蛋白抗体/流感病毒核蛋白抗原复合物和人类抗流感病毒核蛋白抗体/标记的抗原类似 物复合物。通过测量在检测区中产生的这些复合物中的标记物，可以对流感病毒进行检测 或定量。-实施方案5供应到样品供应区的样品展开通过样品迁移区并到达标记试剂区。到达标记试剂 区的样品与标记的抗原类似物(标记的流感病毒核蛋白抗原类似物)进一步展开通过样品 迁移区，并到达检测区。在检测区中，样品中的流感病毒核蛋白抗原与标记的抗原类似物竞 争性地与人类抗流感病毒核蛋白抗体反应，导致产生人类抗流感病毒核蛋白抗体/流感病 毒核蛋白抗原复合物和人类抗流感病毒核蛋白抗体/标记的抗原类似物复合物。通过测量 在检测区中产生的这些复合物中的标记物，可以对流感病毒进行检测或定量。-实施方案6供应到样品供应区的样品和标记抗体(标记的人类抗流感病毒核蛋白抗体)展开 通过检测迁移区。在供应或展开步骤过程中产生的流感病毒核蛋白/标记抗体复合物与未 反应的标记抗体一起到达检测区。在检测区中，未反应的标记抗体与流感病毒核蛋白抗原 类似物反应产生流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物。通过测量在检测区中产生 的这些流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物中的标记物，可以对流感病毒进行检 测或定量。-实施方案7供应到样品供应区的样品展开通过样品迁移区并到达标记试剂区。在标记试剂区 中，流感病毒核蛋白与标记抗体(标记的人类抗流感病毒核蛋白抗体)反应并产生流感病 毒核蛋白/标记抗体复合物。产生的复合物与未反应的标记抗体进一步展开通过样品迁移 区并到达检测区。在检测区中，未反应的标记抗体与流感病毒核蛋白抗原类似物反应，产生 流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物。通过测量在检测区中产生的这些流感病毒 核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物中的标记物，可以对流感病毒进行检测或定量。在本文中，在检测区中产生的复合物中的标记物可以使用已知方法测量。当标记 物是金胶体粒子或有色乳胶粒子时，可以通过测量由于复合物的产生而在支持物上产生的 条带的吸光度，来进行测量。当标记物是酶时，可以通过允许酶的底物在酶上作用来测量标 记物。检测方法可以根据使用的酶和酶的底物来选择。酶的底物可以包含在展开溶液中，它也可以允许迁移的方式承载在装置中提供的 底物试剂区中。当酶是过氧化物酶时，其底物的实例包括发色底物和发光底物。发色底 物的实例包括无色型发色团与过氧化氢的组合，以及过氧化氢与包含两种化合物的组合的偶联型发色团的组合。无色型发色团的实例包括2，2’_连氮基-双(3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、二氨基联苯胺(DAB)、10-N-羧甲 基氨甲酰基-3，7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)UO-N-甲基氨甲酰基-3，7-双 (二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’ -双(二甲基氨基)二 苯基胺钠盐(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3，7_双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪钠盐 (DA-67)、4，4’_双(二甲基氨基)二苯基胺和双[3-双(4-氯苯基)甲基_4_ 二甲基氨基 苯基]胺(BCMA)。含有两种化合物的组合的偶联型发色团的实例包括偶联剂与苯胺或苯 酚的组合。偶联剂的实例包括4-氨基安替比林G-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。 苯胺的实例包括N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰基乙二胺(EMSE)、N_(3，5_ 二甲 氧基苯基)-N’ -琥珀酰基乙二胺钠盐(DOSE)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)_3_甲 基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、 N-(3-磺基丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5- 二甲基苯胺、N-乙 基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、 N-乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯 胺钠盐二水化物(TOOS)、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺、N- (2-羟 基-3-磺基丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺钠盐(HSDA)、N-乙基-N- (2-羟基-3-磺基丙基)-3， 5-二甲基苯胺、N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺和N-乙 基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺钠盐(F-DAOS)。苯酚的实例包括 苯酚和3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸。发色底物的实例包括鲁米诺与过氧化氢的组合和异 鲁米诺与过氧化氢的组合。当酶是碱性磷酸酶时，其底物时例如发色底物、荧光底物或发光底物。可以通过 当底物是发色底物时测量吸光度、当底物是荧光底物时测量荧光强度、当底物是发光底物 时测量发光强度来进行检测或定量。发色底物的实例包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸 酯(BCIP)和4-硝基苯基磷酸酯。荧光底物的实例包括4-甲基伞酮基磷酸酯(4MUP)和 用于β -D-半乳糖苷酶的4-甲基伞酮基苯基-β -D-半乳糖苷(4MUG)。发光底物的实例 包括3-(2’ -螺金刚烷)-4-甲氧基_4-(3’ -磷酰氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷二钠盐 (AMPPD)、2-氯-5-{4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3，2，-(5，-氯)三环[3. 3. 1. 13， 7]癸]_4_基}苯基磷酸二钠盐(CDP-MarTM)、3-{4-甲氧基螺[1，2-二氧杂环丁烷-3， 2，-(5，-氯)三环[3. 3. 1. 13，7]癸]_4_基}苯基磷酸二钠盐(CSPD )和[10-甲 基-9 (IOH)-亚吖啶基]苯氧基甲基磷酸二钠盐(Lumigen APS-5)。当酶是β-D-半乳糖苷酶时，该酶的底物的实例包括发光底物例如3- ’-螺金刚 烷)-4-甲氧基-4-(3”-i3-D-吡喃半乳糖基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷(AMGPD)。此外，本发明的装置应该只包含人类抗流感病毒核蛋白抗体作为其组分，并且对 于检测区中的检测方法没有具体限制。不仅可以使用上面提到的发色方法(吸光度方法)、 荧光方法和发光方法作为检测方法，检测质量变化的方法也可以使用。用于检测质量变 化的方法的实例包括表面等离子体共振(SPR)方法和使用压电振动器的方法(参见例如 W02005/015217 公开)。使用本发明的装置对样品中的流感病毒定量可以如下进行。首先，使用从流感病 毒制备的具有已知浓度的流感病毒核蛋白作为样品，将这些样品供应到本发明的装置的样品供应区，在检测区测量信息(例如吸光度)，并产生显示出流感病毒浓度与信息的量之间 的关系的校正曲线。然后，使用实际目标样品进行类似测量，并将获得的信息量与以前制备 的校正曲线相关联，以确定浓度。[用于检测或定量流感病毒的方法]本发明的用于检测或定量流感病毒的方法是在其中使用至少一种或者多种人类 抗流感病毒核蛋白抗体的方法。流感病毒可以使用将在下面描述的本发明的用于检测或定 量流感病毒的试剂盒进行检测或定量。本发明的用于检测或定量流感病毒的方法没有具体限制，只要它们是能够检测或 定量流感病毒的方法即可，其实例包括放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、酶联免 疫吸附分析(ELISA)、均相酶免疫分析、荧光免疫分析(FIA)、免疫荧光分析(IFMA)、荧光偏 振分析、化学发光免疫分析(CLIA)、化学发光酶免疫分析(CLEIA)、比浊免疫分析和表面等 离子体共振(SPR)方法。本发明的用于检测或定量流感病毒的方法包括如下所示的方法。-方法1一种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的人类抗流感病毒核蛋白抗体反应；以及(2)测量在步骤(1)中产生的物理变化。在本方法中物理变化的量中的物理变化的实例包括浊度变化和质量变化。该方法 可以应用于测量伴随着抗原抗体反应出现的反应溶液的浊度变化的比浊免疫分析，或应用 于测量伴随着抗原抗体反应出现的质量变化的表面等离子体共振(SPR)方法。-方法2一种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上 形成抗体1/流感病毒复合物；(2)将在步骤(1)中在载体上形成的复合物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)反 应；以及(3)测量在步骤O)中诱导的物理变化；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。抗体1和抗体2可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选二者都是单克隆抗体。在本方法中物理变化的量中的物理变化的实例包括浊度变化和质量变化。该方法 可以应用于测量伴随着抗原抗体反应出现的反应溶液的浊度变化的比浊免疫分析，或应用 于测量伴随着抗原抗体反应出现的质量变化的表面等离子体共振(SPR)方法。步骤(1)和 步骤(2)可以同时进行。-方法3一种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上 形成抗体1/流感病毒核蛋白复合物；(2)将在步骤⑴中在载体上形成的复合物与标记抗体(标记抗体2)反应，以在 载体上形成抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物，所述标记抗体中标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物中的标 记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。上述方法是夹心方法的一种实施方案。对于上述方法中的抗体1和抗体2来说，流 感病毒核蛋白被相应抗体识别的区域可以相同或不同，并且优选情况下区域是不同的。此 外，上述方法中的抗体1和抗体2可以各自是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下二 者都是单克隆抗体。在上述方法中，当源自于步骤中产生的复合物中的标记物的信息的量与源自 于在步骤O)中反应系统中存在的未反应标记抗体中的标记物的信息的量之间的差异显 著时，步骤(3)的清洗步骤可以省略(均相方法)。此外，步骤(1)和步骤( 可以同时进 行，并且清洗步骤可以插入到步骤(1)与步骤⑵之间。用于测量上述方法的步骤中的标记物的方法的实例，包括上面提到的方法。-方法4一种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)将样品与标记抗体(标记抗体2)反应，以形成标记抗体2/流感病毒核蛋白复 合物，所述标记抗体中，标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合；(2)将步骤(1)中形成的复合物与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体 1)反应，以在载体上形成抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记抗体2复合物中的标 记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。上述方法是夹心方法的另一种实施方案。对于上述方法中的抗体1和抗体2来说， 流感病毒核蛋白被相应抗体识别的区域可以相同或不同，并且优选情况下区域是不同的。 此外，上述方法中的抗体1和抗体2可以各自是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下 二者都是单克隆抗体。在上述方法中，当源自于步骤O)中产生的复合物中的标记物的信息的量与源自 于在步骤O)中反应系统中存在的未反应标记抗体中的标记物的信息的量之间的差异显 著时，步骤(3)的清洗步骤可以省略(均相方法)。此外，步骤(1)和步骤( 可以同时进 行，并且清洗步骤可以插入到步骤⑴与步骤⑵之间。用于测量上述方法的步骤中的标记物的方法的实例，包括上面提到的方法。-方法5一种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)在同时存在标记抗原类似物的情况下，将样品与固定在载体上的人类抗流感 病毒核蛋白抗体反应，以在载体上形成人类抗流感病毒核蛋白抗体/流感病毒核蛋白复合 物和人类抗流感病毒核蛋白抗体/标记的抗原类似物复合物，所述标记抗原类似物中标记 物与流感病毒核蛋白抗原类似物结合；
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(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物。上述方法是竞争方法的一个实施方案。上述方法中的人类抗流感病毒核蛋白抗体 可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下它是单克隆抗体。用于测量上述方法的步骤(3)中的标记物的方法的实例，包括上面提到的方法。-方法6—种用于检测或定量流感病毒的方法，其包含下列步骤(1)在同时存在标记抗体的情况下，将样品与固定在载体上的流感病毒核蛋白抗 原类似物反应，以在载体上形成流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物，所述标记 抗体中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结合；(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物。上述方法是竞争方法的另一个实施方案。上述方法中的人类抗流感病毒核蛋白抗 体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下它是单克隆抗体。用于测量上述方法的步骤(3)中的标记物的方法的实例，包括上面提到的方法。本发明的方法中的反应条件可以由本技术领域的专业人员适当地设置，例如，反 应温度为0°c到50°C、优选为4°C到40°C，反应时间是1分钟到M小时、优选为3分钟到12 小时。此外，当包含清洗步骤时，载体的清洗可以使用例如磷酸盐缓冲的盐水(PBQ进行。在本发明的方法中使用的固相具有固定化并固定在载体上的抗流感病毒核蛋白 抗体或标记的抗原类似物。对于载体没有具体限制，只要它能够允许抗流感病毒核蛋白抗 体或标记的抗原类似物的固定化和固定、并且不溶于水即可，其实例包括聚苯乙烯板例如 微量滴定板、由玻璃或合成树脂制成的粒状物质(珠子)、由玻璃或合成树脂制成的球状物 质(球)、乳胶、磁性粒子、硝酸纤维素膜、尼龙膜和由合成树脂制成的管。用于将抗流感病 毒核蛋白抗体或标记的抗原类似物固定化和固定在载体上的方法的实例，包括直接方法和 间接方法。直接方法的实例包括通过共价键将载体上的官能团与抗流感病毒核蛋白抗体或 标记的抗原类似物中的官能团相连的方法。这里，载体上的官能团与抗流感病毒核蛋白抗 体或标记的抗原类似物中的官能团的组合的实例，包括氨基-羧基和羧基-氨基。间接方法的实例包括通过连接物将载体上的官能团与抗流感病毒核蛋白抗体或 标记的抗原类似物中的官能团间接相连的方法，以及使用物质之间的相互作用的方法。在 这里，载体上的官能团与抗流感病毒核蛋白抗体或标记的抗原类似物中的官能团的组合的 实例，包括氨基-氨基、氨基-羧基、氨基-巯基、羧基-氨基、羧基-羧基和羧基-巯基 等。官能团可以通过化学修饰导入。利用物质之间的相互作用的方法的实例包括利用亲和 素-生物素相互作用的方法和利用糖-凝集素相互作用的方法。当利用亲和素-生物素相 互作用例如通过将吸附有亲和素的载体与生物素化的抗流感病毒核蛋白抗体或生物素化 的标记的抗原类似物进行反应时，可以将抗流感病毒核蛋白抗体或标记的抗原类似物固定 化并固定在载体上。此外，通过用牛血清白蛋白、酪蛋白等进一步阻断其上带有固定化并固定的抗流 感病毒核蛋白抗体或标记的抗原类似物的载体而制备的固相，可以用作在本发明的方法中 使用的固相。
在本发明的方法中使用的人类抗流感病毒核蛋白抗体的实例包括下面描述的人 类抗A型流感病毒核蛋白抗体和人类抗B型流感病毒核蛋白抗体。在本发明的方法中使用的标记物的实例包括上面提到的标记物。用于在本发明的 方法中测量标记物的方法的实例，包括上面提到的用于测量标记物的方法。在本发明的方法中使用的标记的抗流感病毒核蛋白抗体，可以按照上面描述的方 法从标记物和抗流感病毒核蛋白抗体制备。在本发明的方法中使用的流感病毒核蛋白抗原类似物是与样品中的流感病毒核 蛋白竞争与固定在载体上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的反应的物质，其实例不仅包括流 感病毒核蛋白本身，而且还包括含有在流感病毒核蛋白中发现的被抗流感病毒核蛋白抗体 识别的表位的物质。在本发明的方法中使用的标记的抗原类似物(标记的流感病毒核蛋白抗原类似 物)，可以通过与上述用于制备标记抗体的方法类似的方法来制备。[用于检测或定量流感病毒的试剂盒]本发明的用于检测或定量流感病毒的试剂盒，是用于本发明的检测或定量流感病 毒的方法的试剂盒。本发明的用于检测或定量流感病毒的试剂盒的实例包括下面描述的试剂盒。-试剂盒1一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含通过将人类抗流感病毒核蛋白抗 体固定到载体上而产生的固相。人类抗流感病毒核蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本试剂盒适用于方法例如比浊免疫分析和表面等离子体共振(SPR)方法。-试剂盒2一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含通过将抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)固定到载体上而产生的固相，以及含有抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)的试剂，并且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。抗体1和抗体2可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下二者都是单克 隆抗体。本试剂盒适用于方法例如比浊免疫分析和表面等离子体共振(SPR)方法。-试剂盒3一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含通过将抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)固定到载体上而产生的固相，以及含有标记抗体的试剂，所述标记抗体中标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)
纟口 I=I，并且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。抗体1和抗体2可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且优选情况下二者都是单克 隆抗体。本试剂盒适用于基于夹心方法的免疫分析方法。-试剂盒4
一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含通过将人类抗流感病毒核蛋白抗 体固定到载体上而产生的固相，以及含有标记的抗原类似物的试剂，所述标记的抗原类似物中的标记物与流感病毒核 蛋白抗原类似物结合。本试剂盒适用于基于竞争方法的免疫分析方法。-试剂盒5一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含通过将流感病毒核蛋白抗原类似物固定到载体上而产生的固相，以及含有标记抗体的试剂，所述标记抗体中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结合。本试剂盒适用于基于竞争方法的免疫分析方法。在本发明的用于检测或定量流感病毒的试剂盒中使用的固相的实例，包括上面提 到的固相。在本发明的试剂盒中使用的人类抗流感病毒核蛋白抗体的实例包括下面描述的 人类抗A型流感病毒核蛋白抗体和人类抗B型流感病毒核蛋白抗体。在本发明的试剂盒中使用的标记物的实例包括上面提到的标记物。用于测量本发 明的试剂盒中的标记物的方法和实例，包括上面提到的用于测量标记物的方法。根据需要，本发明的试剂盒不仅可以包括上面提到的水性溶剂，而且可以包括上 面提到的添加剂例如缓冲液、表面活性剂、防腐剂、盐类、糖类、金属离子和蛋白。这些添加 剂可以用作独立于固相和构成本发明试剂盒的试剂的含添加剂试剂，它们也可以通过包含 在固相和构成本发明试剂盒的试剂中的任一或二者中来使用。[人类抗流感病毒核蛋白抗体]本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体是用于本发明的检测或定量流感病毒的装 置、本发明的检测或定量流感病毒的试剂盒和本发明的检测或定量流感病毒的方法的抗 体。其实例包括人类抗A型流感病毒核蛋白抗体和人类抗B型流感病毒核蛋白抗体。此外， 本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且它们优选为单 克隆抗体。本发明的人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体优选是与A型流感病毒核蛋白特 异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应的抗体。此外，本发明的人类抗B型流感病毒 核蛋白单克隆抗体优选是与B型流感病毒核蛋白特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白 反应的抗体。-用于产生人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗体的方法如上所述，本发明的人类抗流感病毒核蛋白抗体优选为人类抗流感病毒核蛋白单 克隆抗体。人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗体可以通过已知的单克隆抗体生产方法来生产 [杂交瘤方法(参见例如In VitroCell Dev Biol. (1985)21(10) :593-596)，病毒感染方法 (参见例如 J. gen. Virol. (1983)，64，697-700)，噬菌体展示方法(参见例如 W02001/062907 公开)，淋巴细胞微阵列方法等]，并且淋巴细胞微阵列方法是优选的。淋巴细胞微阵列方法是与单克隆抗体生产方法相关的技术，由富山大学 (University of Toyama)和SC World, Inc.联合开发[日本专利申请公开出版号(JP-A) 2004-173681 (未经审查的已公布日本专利申请)JP-A(Kokai) 2004-187676 ； JP-A (Kokai) 2005-261339 ； JP-A (Kokai) 2007-14267 ；Anal. Chem. 77 (24), p.8050-8056(2005) ；Cytometry A71 (11), p. 961-967(2007) ；Cytometry A 71(12)， p. 1003-1010 (2007)]，并包括下列步骤[1]从人类血液制备B淋巴细胞的步骤；[2]筛选与测量物反应的B淋巴细胞的步骤；[3]从筛选到的B淋巴细胞获得与测量物反应的抗体的相关基因的步骤；[4]使用获得的基因表达抗体的步骤；以及[5]筛选具有所需性质的抗体的步骤。在后文中，描述了每个上面提到的与人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗体的生产相 关的步骤。[1]从人类血液制备B淋巴细胞的步骤人类B淋巴细胞可以从人类外周血制备，具体来说，它们可以从具有流感病毒感 染史或流感疫苗接种史、在血清中可以证实流感病毒核蛋白抗体的存在的人类外周血制 备。理想情况下，通过在流感疫苗接种后经过一段时间、优选为1到30天、更优选5到10 天后收集血液来制备它们。制备方法的具体实例包括使用密度梯度离心、细胞分拣器、磁珠 等的方法。[2]筛选与测量物反应的B淋巴细胞的步骤特异性针对抗原的单一 B淋巴细胞的筛选，可以通过例如使用微孔阵列芯片的方 法来进行。在例如使用微孔阵列芯片的方法中，向用于抗原特异性B淋巴细胞检测的微孔 阵列芯片的每个微孔加入抗原，所述芯片具有多个微孔，各含有单个测试B淋巴细胞，然后 检测与抗原反应的B淋巴细胞，并通过从微孔收集检测到的抗原特异性B淋巴细胞，可以获 得特异性针对抗原的单个B淋巴细胞。在后文中，将更详细地描述该方法。可以使用具有多个微孔并且其中每个微孔可以包含单个测试B淋巴细胞的微孔 阵列芯片。通过在每个微孔中包含单个测试B淋巴细胞，可以在细胞水平上鉴定抗原特异 性B淋巴细胞。也就是说，当使用该微孔阵列芯片时，包含在微孔中的测试B淋巴细胞是单 个细胞；因此，可以鉴定到作为单个细胞的与抗原反应的测试B淋巴细胞，因此可以检测到 作为单个细胞的抗原特异性B淋巴细胞。然后，收集检测到的单个抗原特异性B淋巴细胞 并克隆其基因。对于微孔的形状或维度没有具体限制，微孔的形状可以是例如圆柱形，或 除此之外它可以是立方形、倒圆锥形、倒棱锥(倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱锥、 具有七个或以上侧面的倒多棱锥)形，或者它可以是由两种或以上这些形状组合产生的形 状。例如，一部分可以是圆柱形，剩余部分可以是倒圆锥形。此外，在倒圆锥或倒棱锥的情况 下，底面是微孔的开口 ；但是，形状可以是其中倒圆锥或倒棱锥的一部分顶端被截去的形状 (在这种情况下微孔的底部将是平的)。对于圆锥和立方体来说，微孔的底部一般是平的， 但是它也可以是曲面(凸面或凹面)。对于其中倒圆锥形或倒棱锥的一部分顶端被截去的 形状来说，微孔的底部也可以制造成曲面。测试B淋巴细胞与培养溶液一起储存在微孔中。 培养溶液的实例包括下列任一种1. 137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，1. 8mmol/L CaCl2, lmmol/LMgCl2, lmg/mL葡萄 糖，lmg/mL BSA,20mmol/L HEPES (pH7. 4)
2.含10% FCS (胎牛血清)的RPMI1640培养基3.含 lmg/mL BSA 的 RPMI1640 培养基4.含 10% FCS (胎牛血清)的 Dulbecco，s MEM 培养基5.含 lmg/mL BSA 的 Dulbecco，s MEM 培养基与抗原反应的细胞的检测可以如下进行。例如，当抗原与B淋巴细胞的抗原受体(免疫球蛋白)结合时，首先发生细胞内信 号转导，然后发生细胞增殖和抗体生产。因此，通过用各种不同方法检测细胞内信号传导、 细胞增殖或抗体产生，可以检测与抗原反应的细胞。通过检测细胞内信号传导检测与抗原 反应的细胞，可以通过例如使用Ca离子依赖性荧光染料观察细胞内Ca离子浓度的变化来 进行。细胞内Ca离子浓度的变化使用Fura-2、Fluo-3或Fluo-4作为荧光染料、荧光显微 镜或微阵列扫描仪作为检测装置进行观察。[3]从筛选到的B淋巴细胞获得与测量物反应的抗体的相关基因的步骤使用细胞裂解试剂溶解收集到的抗原特异性B淋巴细胞，然后使用PCR克隆抗原 特异性免疫球蛋白(抗体)基因。作为细胞裂解试剂，可以使用已知是细胞裂解试剂的物 质，其实例包括下列Ix 第一链缓冲液[GIBC0-BRL,随 SuperScriptII 提供]，0. 2mmo 1/LdNTP，0. 25% NP-40,0. lmg/mL BSA, 10mmol/L DTT，随机引物 0. 05 μ mol/L，IU/μ L RNasin0B淋巴细胞中的抗原受体基因与抗体基因相同，作为蛋白，它被称为免疫球蛋白。 抗原受体存在于B淋巴细胞表面上(膜类型免疫球蛋白)，而抗体一般作为分泌蛋白(分 泌型免疫球蛋白)产生。它们的区别在于蛋白的C-端一侧。膜类型免疫球蛋白具有埋在 细胞膜中的膜结构域和伸出到胞质一侧的部分。分泌型免疫球蛋白也从同样基因产生。但 是，由于可能的剪接，分泌型免疫球蛋白白C-端一侧与膜类型免疫球蛋白的蛋白C-端一侧 不同，使得分泌型免疫球蛋白不具有任何膜结构域。结果，分泌型免疫球蛋白作为分泌蛋白 产生，并且这两种蛋白的抗原结合位点是相同的。因此，在B淋巴细胞的情况下，抗体基因 的克隆和抗原受体基因的克隆是相同的。使用通过使用细胞裂解试剂溶解收集到的抗原特异性B淋巴细胞而获得的溶液， 通过反转录酶进行cDNA的制备。接下来，通过DNA聚合酶在cDNA的3’ -端进行加尾反应，以执行腺嘌呤、鸟嘌呤、 胞嘧啶或胸腺嘧啶向cDNA 3’ -端的加尾。可以通过使用用于免疫球蛋白基因的引物混合物进行两次PCR，来扩增所需抗原 特异性免疫球蛋白基因。通过反转录酶制备cDNA可以通过通用步骤来进行[例如Sambrook J,Russell Dff 《分子克隆实验指南》(第三版)(MolecularCloning :A Laboratory Manual 3rd ed) (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York,2001)]。在本发明中，优选使用细胞裂解液直接进行RT反应，来代替使用从细胞提取和纯 化的RNA进行反转录反应。(通过PCR方法扩增抗体基因)在通过PCR方法进行的抗体基因扩增中，优选通过执行两次PCR反应来扩展抗体 基因的V区基因。
抗体分子由H链和L链的组合构成，并且在生殖细胞系中，人类抗体基因的H链由 约200种类型的V-区基因片段、约20种类型的D-片段和6种类型的J-片段构成。在分 化成B淋巴细胞后，各一种类型的V-、D-和J-片段通过基因重排(V/D/J重排)组合形成 了单个抗原结合位点。对于L链来说也是同样。每个B淋巴细胞在细胞表面上表达一种类型的抗体分子。为了从抗原特异性B淋 巴细胞扩增抗原特异性抗体，需要使用与每个V-片段序列匹配的引物。[4]使用获得的基因表达抗体的步骤如上所述，使用遗传工程技术从细胞获得编码抗体重链(H)和轻链(L)的cDNA，产 生了将获得的cDNA插入到用于抗体表达的载体的启动子下游中的重组载体，并通过将该 载体导入宿主细胞获得抗体表达细胞。通过将这些细胞在适合培养基中培养，或通过将它 们给药于动物以将细胞转化成腹水肿瘤，并分离和纯化培养溶液或腹水液，可以制备抗体。 这种用于抗体表达的载体是用于动物细胞的表达载体，其整合有作为人类抗体的恒定区(C 区)的重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的编码基因，并通过将人类抗体的CH和CL的 每个编码基因插入到用于动物细胞的表达载体中来构建。作为人类抗体C区，CYl和CY4可用于人类抗体H链，C κ可用于人类抗体L链。 作为编码抗体C区的基因，可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA，并且可选地，也 可以使用cDNA。作为用于动物细胞的表达载体，可以使用任何载体，只要它能够整合并表达 编码抗体C区的基因即可。载体的实例包括pAGE107[Cytotechnology，3，133(1990)]、pAGE103[J. Biochem, 101,1307(1987)]、pHSG274 [Gene, 27，223 (1984) ]、pKCR[Proc. Natl.，Acad. Sci.，78， 1527 (1981)]和 pSGl β d2_4 [Cytotechnology，4，173 (1990)]。在载体中使用的用于在动 物中表达的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子[J. Biochem，101， 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子[Biochem. Biophys. Res. Comun.，149，960 (1987)]以及免疫球蛋白H链的启动子[Cell，41，479 (1985)]和增强子 [Cell,33,717(1983)]ο对于用于表达的载体来说，可以使用其中抗体H链基因和L链基因存在于分开的 载体上的类型，或其中基因存在于同一个载体上的类型(串联类型)。可以通过将上面提到的表达载体导入适合的宿主细胞来获得稳定生产抗体的转 化株。用于将表达载体导入宿主细胞的方法包括电穿孔方法[JP-A(Kokai)H02-257891， Cytotechnology, 3,133 (1990) ]0对于用于导入表达载体的宿主细胞来说，可以使用 任何细胞，只要它们是能够表达抗体的宿主细胞即可。实例包括小鼠SP2/0-iVg细胞 (ATCCCRL1581)、小鼠P!3X63-Ag8. 653细胞(ATCC CRL1580)、其中缺陷了二氢叶酸还原酶基 因(在后文中称为 DHFR 基因)的 CHO 细胞[Proc. Natl. Acad. Sci.，77,4216 (1980)]，以及 大鼠 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 细胞(ATCC CRL1662，在后文中称为 YB2/0 细胞)。[5]筛选具有所需性质的抗体的步骤在上述步骤中获得的抗体可以使用蛋白A柱从转化株的培养上清液纯化(《抗体》 (第八章)(Antibodies，Chapter 8))。此外，其他用于普通蛋白的纯化方法例如凝胶过滤、 离子交换层析和超滤，可以分开或组合使用。纯化的重组抗体H链或L链或完整抗体分子 的分子量，通过聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE) [Nature, 227,680 (1970) ] ,Western印迹(《抗体》(第 12 章)(Antibodies, Chapter 8))等测定。该培养上清液中的抗体与流感病毒核蛋白结合的能力，使用流感病毒核蛋白包被 的96孔板通过ELISA方法测量。通过ELISA进行的测量可以如下进行。具体来说，将在 PBS中稀释的流感病毒核蛋白(10yg/mL)以每孔50 μ L的量分发到96孔板中，将其在4°C 下留置过夜进行吸附。将孔用PBS清洗以除去非特异性结合，每孔400 μ L的量分发含有 3% BSA、0. 05%吐温-20的PBS，并使其在室温下反应2小时进行阻断。也制备了没有吸附 抗原的阻断的孔作为阴性对照孔。然后，将孔用含有0. 吐温-20的PBS(PBS-T)清洗，以 每孔50 μ L的量分发上面提到的细胞的培养上清液，并使其在室温下反应2小时。将 孔用PBS-T清洗，以每孔50 μ L的量分发稀释1000倍的碱性磷酸酶(ALP)标记的抗人类免 疫球蛋白抗体，并使其在室温下反应2小时。将孔用PBS-T清洗，以每孔50 μ L的量分发溶 解在用于ALP底物的缓冲液[lOOmmol/L氯化钠，5mmol/L氯化镁，IOOmmol/L Tris缓冲液 (PH9.5)]中的lmg/mL对硝基苯基磷酸酯(ALP底物)，并在室温下反应20分钟后，在微孔 板读板器上测量405nm处的吸光度。此外，为了检查本发明的单克隆抗体与抗原结合的特异性，当向孔加入含有抗体 的细胞培养上清液时，将可溶性流感病毒核蛋白与培养上清液预温育。将该混合溶液加 到孔中，以检查抗体与吸附在孔上的重组核蛋白的结合是否被可溶性重组核蛋白竞争性抑 制。本发明中的人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的具体实例，包括其中重链可 变区的氨基酸序列包含SEQ ID NOs :8到13任一个的氨基酸序列、并且轻链可变区的氨基 酸序列包含SEQ ID NOs :22到27任一个的氨基酸序列的人类抗A型流感病毒核蛋白单克 隆抗体。优选实施方案是例如这样的人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其包含的重 链可变区和轻链可变区由选自具有下列SEQ ID NO的氨基酸序列的组合的氨基酸序列的组 合构成-重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQID NO 8和 22,SEQ ID NO 9 和 23,SEQ ID NO 10 和 24,SEQID NO 11 和 25,SEQ ID NO 12 和 26 以及 SEQ ID NO 13 和 27。本发明的人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的优选实施方案的实例是包括 含有SEQ ID NO 14的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO 的氨基酸序列的轻链 可变区的人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体。如上所述，当在本发明中使用两种抗流感病毒核蛋白抗体时，非人类抗流感病毒 核蛋白抗体可以与人类抗流感病毒核蛋白抗体一起使用。非人类动物的实例包括小鼠、大 鼠、兔等。非人类抗流感病毒核蛋白抗体可以是单克隆或多克隆抗体，并且它优选是单克隆 抗体。非人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗体可以通过例如上面提到的已知单克隆抗体生产 方法来生产。非人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗体的实例包括小鼠抗A型流感病毒核蛋白 单克隆抗体、小鼠抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体、大鼠抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗 体、大鼠抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体、兔抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体和兔抗B 型流感病毒核蛋白单克隆抗体。在本发明中，不仅可以使用通过上面提到的已知单克隆抗 体生产方法生产的单克隆抗体，而且可以使用商业化产品作为非人类抗流感病毒核蛋白单 克隆抗体。可商购产品的具体实例包括M322211和M2110169(其由Fitzgerald制造)和
30ATCC HB-65，它们是可商购的小鼠抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体，以及M2110171(由 Fitzgerald制造)和41027 (由Capricorn制造)，它们是可商购的小鼠抗B型流感病毒核 蛋白单克隆抗体。所有在本文中引用的现有技术文献在本说明书中引为参考。在本文下面，将参考实施例对本发明进行具体描述，但本发明不应该解释为仅限 于这些实施例。
实施例[实施例1]用于检测或定量流感病毒的装置-碱性磷酸酶标记的抗体的制备碱性磷酸酶标记的抗体使用碱性磷酸酶标记试剂盒(由DojindoLaboratories 制造)以及在下面描述的实施例4中获得的两种类型的人类抗流感病毒核蛋白单克隆抗 体[23G285(A型)和23G327 (B型)]和两种类型的小鼠抗流感病毒核蛋白单克隆抗体 [M2110169(A 型由 Fitzgerald 制造)和 M2110171(B 型；由 Fitzgerald 制造)]来制备。-用于使用碱性磷酸酶标记的抗体检测或定量A型流感病毒的装置将小鼠抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体M2110169和M322211 (由Fitzgerald 制造)以及人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体23G268的PBS溶液各自滴到切成 5cmx0. 5cm的滤纸(由Millipore制造)的区域上，单克隆抗体被固定，并将其用作检测区。 从滤纸的下侧(样品供应区)，将下列溶液以所述次序展开使用含有NonidetP-40的用于 反应的溶液稀释的A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)；碱性磷酸酶标记的小鼠 抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体M2110169或碱性磷酸酶标记的人类A型流感病毒核蛋 白单克隆抗体23G285的Tris溶液；以及BCIP/NBT(氯化硝基四氮唑蓝)溶液(由Sigma 制造)。结果显示在图2-a中。具体来说，在使用人类抗流感病毒核蛋白抗体的固相抗体 (固定化在检测区中的抗体)和标记抗体(用于标记的抗体)的组合中，在检测区中观察到 了显著的蓝斑。由此显示，人类抗A型流感病毒核蛋白抗体可用于通过免疫层析检测A型 流感病毒，并且人类抗A型流感病毒核蛋白抗体可用于A型流感病毒的高灵敏性检测。此外，使用包含固定化并固定有人类抗A型流感病毒核蛋白抗体23G268的检测 区和位于滤纸下侧的样品供应区的装置(图2-b)，检查了本发明装置的性能。将在含有 Nonidet P-40的用于反应的溶液中稀释的A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)、 在含有NonidetP-40的用于反应的溶液中稀释的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和在含有Nonidet P_40的用于反应的溶液中稀释的B型流感病毒溶液 (B/Victoria/504/00)作为样品各自从样品供应区提供。然后，将其中碱性磷酸酶与人类抗 A型流感病毒核蛋白抗体23G285结合的碱性磷酸酶标记的抗体的Tris溶液，在每个装置的 样品供应区中展开，并将BCIP/NBT(氯化硝基四氮唑蓝)溶液从展开溶液供应区进一步展 开。结果，如图2-b中所示，只有在使用A型流感病毒溶液(H3N2 :A/Panama/2007/99)和A 型流感病毒溶液(Hmi :A/Beijing/262/95)的情况下，才能在检测区中检测到蓝斑。因此， 这表明通过使用人类抗A型流感病毒核蛋白抗体23G268和人类抗A型流感病毒核蛋白抗 体23G285，可以特异性检测A型流感病毒。
-用于使用碱性磷酸酶标记的抗体检测或定量B型流感病毒的装置将小鼠抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体M2110171(由Fitzgerald制造)和 41027(由Capricorn制造)的PBS溶液各自滴到切成5cmx0. 5cm的滤纸(由Millipore 制造)的区域上，单克隆抗体被固定，并将其用作检测区。从滤纸的下侧(样品供应 区)，将使用含有NonidetP-40的用于反应的溶液稀释的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和使用含有Nonidet P_40的用于反应的溶液稀释的B型流感病毒溶液 (B/Victoria/504/00)作为样品各自提供。然后，将其中碱性磷酸酶与人类抗B型流感病毒 核蛋白抗体23G327结合的碱性磷酸酶标记的抗体的Tris溶液，提供到每个装置的样品供 应区。然后将BCIP/NBT (氯化硝基四氮唑蓝)溶液从展开溶液供应区展开。结果显示在图 3中。只有在使用B型流感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情况下才能在检测区中观察 到蓝斑。此外，当人类抗B型流感病毒核蛋白抗体23G327被用作固定化在检测区中 的抗体，并且其中碱性磷酸酶与小鼠抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体M2110171(由 Fitzgerald制造)结合的碱性磷酸酶标记的抗体被用作标记抗体时，也只有在使用B型流 感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情况下才能在检测区中观察到蓝斑。当小鼠抗B型流感病毒核蛋白抗体41027(由Capricorn制造)被用作固定 化在检测区中的抗体，并且其中碱性磷酸酶与小鼠抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体 M2110171 (由Fitzgerald制造)结合的碱性磷酸酶标记的抗体被用作标记抗体时，同样只 有在使用B型流感病毒溶液(B/Victoria/504/00)的情况下才能在检测区中观察到蓝斑。从上述结果显示，人类抗B型流感病毒核蛋白抗体可用于通过免疫层析检测B型 流感病毒。[实施例2]金胶体标记的抗体的制备使用在下面描述的实施例4中获得的两种类型的人类抗A型流感病毒核蛋白单 克隆抗体[23G272和23G447]以及一种类型的小鼠抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体 [M322211 (由Fitzgerald制造)]作为标记的抗体，制备了金胶体标记的抗体。具体来说， 将这些抗体的PBS溶液各自用Tris缓冲液替换，以制备这些抗体的Tris溶液，然后将其与 40nm金胶体(由BBhternational制造)混合并反应15分钟。在反应后和用含有BSA 的Tris溶液阻断后，通过离心除去未结合的单克隆抗体，并将得到的物质用作金胶体标记 的抗体。A型流感病毒的检测使用金胶体标记的抗体检测或定量A型流感病毒的装置将抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体[23G312、23G494和M2110169(由 Fitzgerald制造)]作为固相抗体固定在切成5cmx0. 5cm的滤纸(由Millipore制造)区 域上，并将其用作检测区。具体来说，将这些抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的PBS溶 液各自滴加并固定，以制备检测区。从滤纸的下侧(样品供应区)展开0. ImL溶液，其中 混合有等量的使用含有Nonidet P-40的反应用溶液稀释的A型流感病毒溶液(Hmi =A/ Beijing/262/95)和上面制备的金胶体标记抗体的Tris溶液。结果，使用所有抗体组合(固 相抗体和标记抗体的组合)时在检测区中观察到了明显的红色斑点。当对允许目测观察斑点的时间进行比较时，在使用人类抗体作为固相抗体和标记抗体的组合中，与使用小鼠抗 体作为固相抗体和标记抗体的组合相比，所有组合的时间快大约两倍。此外，为了检查检测灵敏度，将以各种不同浓度制备的A型流感病毒溶液(Hmi A/Beijing/262/95和H3N2 :A/Panama/2007/99)和金胶体标记的抗体，使用例如在表1和 表2中显示的固相抗体和标记抗体组合展开，并目测观察斑点的颜色。[表 1]
权利要求
1.一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含检测区、样品供应区 和样品迁移区，所述检测区中人类抗流感病毒核蛋白抗体固定化在支持物上。
2.一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含检测区、样品供应区 和样品迁移区，所述检测区中抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)固定化在支持物上，其中从 样品供应区提供标记抗体，所述标记抗体中标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)结 合，并且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。
3.一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，所述装置包含检测区、标记试剂区、 样品供应区和样品迁移区，所述检测区中抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)固定化在支持物 上，所述标记试剂区中标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合的标记抗体以允许迁 移的方式保持在支持物上，其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗 体。
4.权利要求2或3的装置，其还包含至少一个选自展开溶液供应区、过量液体吸收区和 样品供应验证区的区域。
5.权利要求1到4任一项的装置，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感 病毒核蛋白抗体。
6.权利要求5的装置，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病毒核 蛋白单克隆抗体，所述人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体与A型流感病毒核蛋白特异 性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应。
7.权利要求6的装置，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆 抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一个的氨基酸序列。
8.权利要求1到4任一项的装置，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感 病毒核蛋白抗体。
9.权利要求8的装置，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病毒核 蛋白单克隆抗体，所述人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体与B型流感病毒核蛋白特异 性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应。
10.权利要求9的装置，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的轻链 可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
11.一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相，所述固相中人类抗流感病毒 核蛋白抗体固定在载体上。
12.一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和试剂，所述固相中抗流感病 毒核蛋白抗体(抗体1)固定在载体上，所述试剂含有抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)，并 且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。
13.一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和试剂，所述固相中抗流感病 毒核蛋白抗体(抗体1)固定在载体上，所述试剂含有标记抗体，所述标记抗体中标记物与 抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻结合，并且其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流 感病毒核蛋白抗体。
14.一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和试剂，所述固相中人类抗流感病毒核蛋白抗体固定在载体上，所述试剂含有标记的抗原类似物，所述标记的抗原类似 物中标记物与流感病毒核蛋白抗原类似物结合。
15.一种用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含固相和试剂，所述固相中流感病毒 核蛋白抗原类似物固定在载体上，所述试剂含有标记抗体，所述标记抗体中标记物与人类 抗流感病毒核蛋白抗体结合。
16.权利要求11到15任一项的试剂盒，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型 流感病毒核蛋白抗体。
17.权利要求16的试剂盒，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病 毒核蛋白单克隆抗体，所述人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体与A型流感病毒核蛋白 特异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应。
18.权利要求17的试剂盒，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区 的氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单 克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一个的氨基酸序列。
19.权利要求11到15任一项的试剂盒，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型 流感病毒核蛋白抗体。
20.权利要求19的试剂盒，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病 毒核蛋白单克隆抗体，所述人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体与B型流感病毒核蛋白 特异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应。
21.权利要求20的试剂盒，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区 的氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的 轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
22.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的人类抗流感病毒核蛋白抗体反应；以及(2)测量在步骤(1)中产生的物理变化。
23.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上形成 抗体1/流感病毒核蛋白复合物；(2)将步骤(1)中在载体上形成的复合物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体幻反应；以及(3)测量在步骤O)中产生的物理变化；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。
24.权利要求22或23的方法，其中物理变化是浊度变化或质量变化。
25.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反应，以在载体上形成 抗体1/流感病毒核蛋白复合物；(2)将步骤(1)中在载体上形成的复合物与标记抗体(标记的抗体幻反应以在载体上 形成抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物，所述标记抗体(标记的抗体幻中，标 记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2、结合；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物中的标记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。
26.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)将样品与标记抗体(标记的抗体幻反应，以形成标记的抗体2/流感病毒核蛋白复 合物，所述标记抗体(标记的抗体幻中标记物与抗流感病毒核蛋白抗体(抗体2)结合；(2)将步骤(1)中形成的复合物与固定在载体上的抗流感病毒核蛋白抗体(抗体1)反 应，以在载体上形成抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物；(3)在步骤(2)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(4)测量步骤C3)后载体上的抗体1/流感病毒核蛋白/标记的抗体2复合物中的标记物；其中抗体1和抗体2中的至少一种是人类抗流感病毒核蛋白抗体。
27.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)在同时存在标记的抗原类似物的情况下将样品与固定在载体上的人类抗流感病毒 核蛋白抗体反应，以在载体上形成人类抗流感病毒核蛋白抗体/流感病毒核蛋白复合物和 人类抗流感病毒核蛋白抗体/标记的抗原类似物复合物，所述标记的抗原类似物中标记物 与流感病毒核蛋白抗原类似物结合；(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物。
28.一种用于检测或定量流感病毒的方法，所述方法包含下列步骤(1)在同时存在标记抗体的情况下，将样品与固定在载体上的流感病毒核蛋白抗原类 似物反应，以在载体上形成流感病毒核蛋白抗原类似物/标记抗体复合物，所述标记抗体 中标记物与人类抗流感病毒核蛋白抗体结合；(2)在步骤(1)后清洗载体以除去未与载体结合的物质；以及(3)在步骤( 后测量载体上的复合物中的标记物。
29.权利要求22到观任一项的方法，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流 感病毒核蛋白抗体。
30.权利要求四的方法，其中人类抗A型流感病毒核蛋白抗体是人类抗A型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，所述人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体与A型流感病毒核蛋白特 异性反应但是不与B型流感病毒核蛋白反应。
31.权利要求30的方法，其中人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的 氨基酸序列包含SEQ ID NO :8到13任一个的氨基酸序列，人类抗A型流感病毒核蛋白单克 隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一个的氨基酸序列。
32.权利要求22到观任一项的方法，其中人类抗流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流 感病毒核蛋白抗体。
33.权利要求32的方法，其中人类抗B型流感病毒核蛋白抗体是人类抗B型流感病毒 核蛋白单克隆抗体，所述人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体与B型流感病毒核蛋白特 异性反应但是不与A型流感病毒核蛋白反应。
34.权利要求33的方法，其中人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :14的氨基酸序列，人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体的轻 链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
35.一种人类抗A型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与A型流感病毒核蛋白特异性反应 但是不与B型流感病毒核蛋白反应，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID N0:8到13 任一个的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :22到27任一个的氨基酸 序列。
36.一种人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应 但是不与A型流感病毒核蛋白反应。
37.一种人类抗B型流感病毒核蛋白单克隆抗体，其与B型流感病毒核蛋白特异性反应 但是不与A型流感病毒核蛋白反应，其中重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID N0:14的氨 基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO :28的氨基酸序列。
全文摘要
一种用于检测或定量样品中的流感病毒的装置，其包含带有固定化在支持物上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的检测区、样品供应区和样品迁移区；以及用于检测或定量流感病毒的试剂盒，其包含带有固定在载体上的人类抗流感病毒核蛋白抗体的固相。
文档编号G01N33/543GK102112878SQ200980130489
公开日2011年6月29日 申请日期2009年6月5日 优先权日2008年6月6日
发明者守田和树, 小泽龙彦, 小野仁, 岸裕幸, 村口笃, 池本守, 鹈泽耕治 申请人:SC World株式会社, 协和梅迪克斯株式会社, 国立大学法人富山大学