代谢综合征患者的利尿钠肽和脂连蛋白的制作方法

专利名称：代谢综合征患者的利尿钠肽和脂连蛋白的制作方法
代谢综合征患者的利尿钠肽和脂连蛋白本发明涉及根据患者样品中的利尿钠肽和脂连蛋白的测定结果来预测患有代谢 综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险的方法。此外，本发明涉及根据前述标志 物的测定结果来鉴定对提高患者的脂连蛋白水平的疗法敏感的患者的方法。本发明还包括 适于实施本发明方法的试剂盒和装置。代谢综合征与能量摄取与能量储存能力之间的失衡有关，并导致脂质在内脏 脂肪、肝、骨骼肌、胰β细胞和血管壁的异位沉积(Smith(2006)0beSity，第14卷增刊， 128S-134S)。它是一组代谢起因的相互关联的风险因子，被认为直接促进动脉粥样硬化性 心血管疾病和2型糖尿病的发生/发展(Grundy等(2005) Circulation 112,2735-2752)。据推测，该综合征主要的潜在风险因素是腹型肥胖、胰岛素抵抗。与代谢综合征有 关的其它情况可能是身体缺乏活动和激素失调。代谢综合征可发生在肥胖和非肥胖患者 中。在非肥胖患者中，脂质贮存在内脏贮库中。一旦这些贮库填满，脂质也会贮存于其它组 织和器官中。尤其是在内脏肥胖症存在时，发展成2型糖尿病和心血管疾病的风险显著提 高。一般认为，代谢综合征驱动全球性糖尿病和心血管疾病二者的增加。据推测，工业化国 家的代谢综合征的发生率约为人口的20%至25%之间。参与代谢综合征发生的主要激素是脂连蛋白。脂连蛋白是由脂肪细胞分泌的最丰 富的脂肪因子(adipokine)。脂肪细胞是释放游离脂肪酸的内分泌细胞，而且除脂连蛋白以 外，还产生若干种细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF) α、瘦蛋白和白介素。一般认为，脂连蛋白使机体对胰岛素敏感。在糖尿病和代谢综合征患者中观察到 脂连蛋白水平降低，并被认为在胰岛素抵抗中起关键作用(参见例如Han等，Journal of the American College of Cardiology，第 49 卷(5)531—8)。在过去十年间，对人体中脂连蛋白的代谢作用，特别是对有关心血管疾病和2型 糖尿病进行了广泛研究。然而，科技文献中有关脂连蛋白水平与结果之间的关系的数据 极不一致。虽然一些小组报告了脂连蛋白水平低的患者患心血管事件的风险降低，但其 它小组却报告了脂连蛋白的量升高的患者患心血管事件的风险增加。例如，Pischon等人 (JAMA, 2004 ；291 :1730-1737)发现，在6年随访期间，在既往无心血管疾病的男性中，高 血浆脂连蛋白水平使得发生心肌梗死的风险降低。Kumada等人(Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003 ;23 :85-89)的研究表明，患有低脂连蛋白血症(低于4.0g/ml)的男性 患者的CAD发生率增加2倍，与众所周知的CAD风险因子无关。与Kumada和Pischon — 致，Inoue 等人(Am J Cardiol. 2007Aug 15 ； 100 (4) :569-74)指出，低 HMW 脂连蛋白水 平预测了 7年随访期内的心血管事件。然而相反地，Pilz等人(Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(11) :4277-4286)指出，高脂连蛋白独立预测了冠状动 脉疾病(CAD)患者全因心血管和非心血管死亡率。同样，Tamura等人(Circ. J. 2007 ；71 623-630)指出，高脂连蛋白水平是充血性心力衰竭患者的死亡率的独立预测因子。Kistorp 等人的研究(Circulation, 2005 ；112，1756-1762)表明，脂连蛋白和NT-proBNP水平升高 与心力衰竭患者的死亡率升高有关。此外，Haugen等人的研究(International Journal of Cardiology, 2008,125 :216-219)表明，在超过70岁的患有严重心力衰竭的患者中，脂连蛋白和 NT-proBNP 水平升高。同样，Tsutamoto 等人(European Heart Journal, 2007, 28 :1723-1730)指出，高分子量脂连蛋白、总的脂连蛋白和NT-proBNP是慢性心力衰竭患 者的独立预测因子。然而，Lawlor等人指出脂连蛋白根本无法预测女性的冠心病(J Clin Endocrinol Metab 2005 ；90 :5677-5683)。脂连蛋白水平因为肥胖而降低，并且代谢综合征患者的水平显著低于健康个体的 /K平(Salmenniemi U 等，Multiple abnormalities in glucose and energy metabolism and coordinated changes in levels of adiponectin, cytokines, and adhesion molecules in subjects with metabolic syndrome (代谢综合征受治疗者的葡萄糖和能 量代谢的多种异常以及脂连蛋白、细胞因子和黏着分子的水平的协调变化Circulation 2004 ；110 :3842-3848)。在许多研究中，都已经将脂连蛋白与代谢综合征的若干异常关联 起来。研究表明，当腹型肥胖、血浆葡萄糖、血红蛋白Alc和胰岛素抵抗增加时，脂连蛋白水 平降低(Lara-Castro 等，Current Opinion in Lipidology，2007，18 :263-270)。研究表明，脂连蛋白水平升高是用于治疗胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病 的有前景的治疗策略(参见例如Kadowaki等人Q006)Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome (月夷 岛 素抵抗、糖尿病和代谢综合征中的脂连蛋白和脂连蛋白受体).J Clin Invest. 116(7) 1784-1792)。最近，证实了噻唑烷二酮类显著提高脂连蛋白水平。该效应是噻唑烷二酮类 药物作用的重要组成(参见Lara-Castro等，出处同上)。然而，尚不清楚患者是否普遍可 获益于旨在提高脂连蛋白水平的疗法。利尿钠肽(特别是脑利尿钠肽)是已十分确定的心脏病(特别是慢性心力衰竭) 的标志物。一般来讲，BNP和/或NT-proBNP的浓度越高，后果越差。WO 02/083913公开 了脑利尿钠肽(BNP)及其变体可用于预测已患心力衰竭的患者的近期死亡率和发病率。在 试图诊断心血管疾病、特别是心肌缺血中，WO 02/089657也公开了各种生物标记，所述标记 在诊断所述疾病和紊乱后用来预测其预后。其中，提到BNP作为合适的生物标记。此外， Hutfless等人根据心脏手术后患者血液中的BNP浓度表明了这一点，它可能预测所述手 术后30天时间内的发病率或死亡率(Hutfless 2004，Utility of B-type natriuretic peptide in predicting postoperative complications and outcomes in patients undergoing heart surgery (B型利尿钠肽在预测进行心脏手术的患者中的手术后并发症 和结果中的用途).J Am Coll Cardiol 43:1873-9. J Am Coll Cardiol 45:1043-50)。非常需要早期鉴定出死亡率或心血管事件风险增加的患有代谢综合征的患者。然 而，还没披露过用于鉴定具有这些风险患者的可靠方法。本发明所要解决的技术问题可视为提供满足前述需要的手段和方法。通过在权利 要求书和下文中表征的实施方案解决了该技术问题。因此，本发明涉及用于预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的 风险的方法，所述方法包括以下步骤，a)测定所述患者样品中的脂连蛋白的量，b)测定所述患者样品中的利尿钠肽的量，c)将步骤a)和b)测定的量与参比量进行比较，和d)根据步骤C)获得的信息，预测所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险。
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本发明的方法优选为体外方法。此外，它可包括上文明确提到的步骤以外的步骤。 例如，其它步骤可涉及样品预处理或对所述方法获得的结果进行评价。本发明的方法还可 用于监测、确认和分类。所述方法可以通过手工实施和/或辅以自动化。步骤(a)、(b)、(c) 和/或(d)优选可全部或部分辅以自动化，例如，通过合适的自动和传感设备用于步骤(a) 和/或(b)中的测定或者步骤(c)中计算机执行的比较。本文使用的术语“患者/个体”涉及动物，优选哺乳动物，更优选人。然而，本发明 设计患者可患有代谢综合征。术语“代谢综合征”为本领域技术人员所熟知。这里使用的术语优选涉及一组 风险因子，包括高甘油三酯血症、腹型肥胖、动脉高压(arterial hypertony)以及包括血 脂异常(dyslipidaemia)和高血糖症在内的各种代谢紊乱。在本领域中，已知代谢综合 征的不同术语，例如X代谢综合征、X综合征、胰岛素抵抗综合征和Reaven氏综合征。此 外，已知鉴定患有代谢综合征的个体的各种标准。本文使用的代谢综合征优选按照以 下标准定义WH0(World Health Organization(世界卫生组织)，另参见Definition， Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications；Part 1 :Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Geneva :WH0 Department of Noncommunicable Disease Surveillance ； 1999)定义的标准，或者按照 EGIR(European Group for the Study of Insulin Resistance(欧洲胰岛素抵抗研究小组))定义的标准，
NCEP (National Education Program Adult Treatment Panel 111( MM^CWtYMS^ 人治疗小组ΠΙ)、通常亦称ATP III标准)的标准，或者按照AHA/NHLBI标准(American Heart Association/Updated NCEP (美国心脏协会/最新NCEP))。这些标准中，更优选EG^ 标准，而对于代谢综合征的诊断最优选ATP III标准。本领域已知由所述组织定义的各种 标准(有关综述参见&0 M-Grundy 等，Circulation ；2005 (112) :27；35_2752，有关所述 的公开内容通过引用其整体结合到本文中)。在本发明的情况下，符合本文提及的各个组织 定义的具体标准的患者患有代谢综合征，因此，已发展成为代谢综合征。按照WHO的标准(1999)，对于诊断患者为代谢综合征，要求存在下列因素之一确 立的胰岛素抵抗糖尿病、葡萄糖耐量减低、空腹葡萄糖升高，或者对于正常空腹葡萄糖水 平(< 110mg/dL)的患者，在血胰岛素增高、血糖正常的条件下，其葡萄糖摄取低于所研究 的背景人群的最低四分位数(the lowest quartile)。除胰岛素抵抗以外，需要存在至少两 种以下情形a)血压≥140mmHg收缩压或≥ 90mmHg舒张压(或高血压治疗中)b)血浆甘油三酯(TG)≥1. 695mmol/L且高密度脂蛋白胆固醇(HDL C) ≤ 0. 9mmol/L(对于男性患者)，≤1. 0mmol/L (对于女性患者)c)腰髋比> 0. 90(对于男性患者)；> 0. 85(对于女性患者)，和/或体重指数 (BMI) > 30kg/m2d)尿白蛋白排泄率≥20 μ g/分钟，或白蛋白与肌酸肝之比≥30mg/g。根据美国国家胆固醇教育计划成人治疗组III [ATP-III/NCEP，2001，另参见 Expert Panel on Detection， Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education Program(NCEP) Expert Panel on Detection，Evaluation, And Treatment ofHigh Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel111), JAMA 2001 ；285 2486-97 ；或参见National Cholesterol Education Program(NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol In Adults(Adult Treatment Panel III)Third report of the National Cholesterol Education Program(NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterolin Adults(Adult Treatment Panel III)final report, Circulation 2002 ； 106 :3143-3421]要求，存在以下中的至少三项才能确定存在/诊断代谢综合征a)腹型肥胖，其定义为腰围彡102cm(对于男性患者)，彡88cm(对于女性患者)b)血菜甘油三酯彡 1. 695mmol/L(150mg/dl)c) HDL-C < 40mg/dL (男性患者)，< 50mg/dL (女性患者)d)血压彡 130/ 彡 85mmHge)空腹血浆葡萄糖彡 6. lmmol/L(110mg/dl)。对于代谢综合征的诊断/存在，欧洲胰岛素抵抗研究小组(EGIR)要求胰岛 素抵抗定义为非糖尿病个体中空腹胰岛素值的前25%，并且存在以下中的两种或更多 禾中情况[另参见 Balkau B, Charles MA, European Group for the Study of Insulin Resistance(EGIR)Comment on the provisional report from the WHO consultation(欧 洲胰岛素抵抗研究小组(EGIR)有关WHO咨询会议临时报告的评论)，Diabet Med 1999 ；16 442-443]a)向心性肥胖腰围彡94cm(男性)，彡80cm(女性)和/或体重指数(BMI) > 30kg/m2b)血浆甘油三酯彡150mg/dL和/或HDL-C < 39mg/dL (或接受血脂异常治疗)c)高血压血压> 140/90mm Hg (或抗高血压药物治疗)d)空腹血浆葡萄糖彡6. lmmol/L。对于代谢综合征的存在/ 诊断，AHA/NHLBI 标准(American Heart Association/ Updated NCEP (美国心脏协会 / 最新 NCEP)，另参见 Grundy SM, Brewer HB, Cleeman JI, Smith SC, Lenfant D, for the Conference Participants. Defnition of metabolic syndrome :report of the National, Heart, Lung, and Blood Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to definition(代 谢综合征的定义国家心肺和血液研究所报告/美国心脏协会会议有关定义的科学议 题).Circulation. 2004 ； 109 :433-438)要求至少以下中的三项腰围加大(男性等于或 大于102cm，女性等于或大于88cm)；甘油三酯升高(等于或大于150mg/dl) ；HDL胆固醇降 低(男性小于40mg/dL ；女性小于50mg/dL)；血压升高(等于或大于130/85mm Hg或使 用高血压药物治疗)；空腹葡萄糖升高(等于或大于100mg/dL(5.6mmol/L)或使用针对高 血糖的药物治疗)。本文使用的术语“预测”是指评价患有代谢综合征的患者在未来的定义时间窗 (预测窗)内发生死亡(例如心力衰竭引起的死亡)和/或发生心血管事件(优选急性心 血管事件，例如急性冠状动脉综合征(ACS))的概率。预测窗是指按照预测概率患者将发 生心血管事件或可能死亡的时间间隔。预测窗可以是用本发明的方法分析后患者的整个 后期生命段。然而，预测窗优选是实施本发明的方法后(更优选和准确地讲，是获得将用本发明的方法进行分析的样品之后)1个月、6个月或1年、2年、3年、4年、5年、8年或10 年的时间。最优选所述预测窗为8年的时间。本领域技术人员知道，这类评价往往并非对 100%接受分析的患者都是正确的。然而，该术语要求所述评价应对接受分析的患者中的统 计显著性部分的患者是有效的。本领域技术人员可以容易地应用各种众所周知的统计评价 工具确定某一部分患者是否是统计显著性的，例如测定置信区间、测定P值、斯图登t检验 (Student' s t-test)、曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)等。详情可参见 Dowdy 和 ffearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区 间为至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。ρ值优选为0. 1,0. 05,0. 01、 0. 005或0. 0001。优选本发明的概率使得预计/预测对于给定组群患者中的至少60%、至 少70%、至少80%或至少90%的患者是正确的。本文使用的术语“死亡率/死亡(mortality) ”是指任何原因(优选因心血管并发 症或心血管事件)引起的死亡率/死亡。本文使用的术语“心血管事件”是指心血管系统 的任何紊乱，优选包括任何急性心血管事件。急性心血管事件优选为稳定型心绞痛(SAP) 或急性冠状动脉综合征(ACS)。ACS患者可能具有不稳定型心绞痛(UAP)或心肌梗死(MI)。 MI可以是ST升高的MI (STEMI)或非ST升高的MI (NSTEMI)。本文使用的NSTE-ACS包括 UAP和NSTEMI。发生MI后接着可能出现左心室功能障碍(LVD)、心力衰竭甚至死亡。更多 优选的心血管事件包括心脏缓慢心律失常或快速心律失常，包括心源性猝死和中风(脑血 管事件或意外)。同样，死亡率/死亡还可指死亡率或死亡人数与给定患者人群之比。本文使用的表述“预测死亡和/或心血管事件风险”是指将用本发明方法分析的 患者是归入具有发生急性心血管事件或死亡的正常(即平均水平)风险的人群的患者组， 或者是归入风险增加的患者组，或者是归入风险降低的组。当本发明提及风险增加时，优选 是指相对于患者(患有代谢综合征)人群中心血管事件或心源性死亡的平均风险水平，在 预定的预测窗内患者发生心血管事件的风险或死亡的风险显著升高(即显著增加)。当本 发明提及风险降低时，优选是指相对于患有代谢综合征的患者人群中心血管事件或心源性 死亡的平均风险水平，在预定的预测窗内患者发生心血管事件的风险或死亡的风险显著降 低。具体来讲，风险的显著增加或降低是被视为对预后有意义的风险大小的增加或降低， 特别是所述增加或降低被视为有统计显著性的。术语“有意义(的)”和“有统计显著性 (的)”为本领域技术人员所知。因此，可由本领域技术人员应用各种众所周知的统计评价 工具容易地测定风险的增加或降低是否有意义或是否有统计显著性。对于8年的预测窗，死亡的平均风险水平优选在10. 0%和19. 0%的范围内，更优 选在12. 0% -7. 0%的范围内，最优选在14. 0% -16. 0%范围内。本文使用的死亡的风险降 低，优选就8年的预测窗而言，优选是指小于10%的风险，更优选风险在5. 0%和10. 0%的 范围内。因此，本文使用的死亡的风险升高和增加，优选是指就8年的预测窗而言，风险大 于19 %，甚至更优选大于20 %，最优选风险在20. 0 %和30. 0 %的范围内。术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或者组织或器官样品。体液样品可通过 众所周知的技术获得，并优选包括血液、血浆、血清或尿液的样品，更优选血液、血浆或血清 的样品。组织或器官样品可通过例如活组织检查由任何组织或器官获取。分离细胞可通过 分离技术(例如离心或细胞分选)由体液或者组织或器官获取。细胞样品、组织样品或器 官优选由表达或产生本文所述肽的细胞、组织或器官获取。
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术语“利尿钠肽”包括心房利尿钠肽(Atrial Natriuretic E印tide，ANP)型肽 和脑利尿钠肽(Srain Natriuretic Peptide, BNP)型肽及其具有相同预测潜力的变体。 本发明的利尿钠肽包括ANP型和BNP型肽及其变体(参见例如Bonow，1996，Circulation 93 1946-1950)。ANP 型肽包括 pre-proANP、proANP、NT-proANP 和 ANP。BNP 型肽包括 pre-proBNP>proBNP>NT-proBNP 和 BNP。pre-pro 肽(在 pre-proBNP 的情况下为 134 个氨 基酸)包括短信号肽，其被酶裂解释放出肽原(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。肽 原被进一步裂解成N端肽原(在NT-proBNP的情况下，NT-肽原为76个氨基酸)和活性 激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为观个氨基酸)。本发明的利尿 钠肽优选为NT-proANP、ANP,更优选为NT-proBNP、BNP及其变体。ANP和BNP是活性激素 并且具有比其它相应无活性对应物NT-proANP和NT-proBNP短的半寿期。BNP在血液中代 谢，而NT-proBNP作为完整分子在血液中循环，并按原样从肾中清除。NTproBNP的体内半 寿期为120分钟，比BNP的长，BNP的半寿期为20分钟(Smith 2000，J Endocrinol. 167 239-46)。NT-proBNP作为分析前物(Preanalytics)更稳定，使得易将样品运输到中心实 验室(Mueller 2004，Clin Chem Lab Med 42 :942-4)，血样可于室温保存几天，或者可邮 寄或运送而无回收损失。相比之下，BNP于室温或4°C保存48小时导致浓度损失至少20% (Mueller，同上；Wu 2004,Clin Chem 50 :867-73)。因此，根据目标时程或性质，测定活性或 无活性形式的利尿钠肽可能是有利的。本发明最优选的利尿钠肽为NT-proBNP或其变体。 正如上文中的简述一样，当本发明提及人NT-proBNP时，是指优选包含相当于人NT-proBNP 分子的N端部分的长为76个氨基酸的多肽。现有技术已详细披露了人BNP和NT-proBNP 的结构，例如WO 02/089657、WO 02/083913或Bonow，同上。本文使用的人NT-proBNP优 选为EP 0 648公开的人NT-proBNP。这些现有技术文献通过引用有关其中公开的
NT-proBNP及其变体的具体序列而结合到本文中。本发明提及NT-proBNP时，还包括上述 人NT-proBNP的所述具体序列的等位基因变体和其它变体。准确地讲，本发明设计了氨基 酸水平上的变异体多肽，其优选与人NT-proBNP (优选在全长人NT-proBNP的范围)有至少 50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%或 99%的同一性。可通过本领域 众所周知的算法确定2个氨基酸序列间的同一性程度。优选在比较窗内比较2个最佳比对 序列来确定同一性程度，其中相对于参比序列(其不包含添加或缺失)，比较窗中的氨基酸 序列的片段可包含添加或缺失(例如空位或突出端)用于最佳比对。通过以下方法来计算 百分比测定在两个序列中出现相同氨基酸残基的位置数得到匹配位置数，将匹配位置数 除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100得到序列同一性的百分比。可通过下列算法 进行用于比较的序列的最佳比对Smith和Waterman的局部同源性算法(Add. APL. Math. 2 482 (1981))、通过 Needleman 和 Wunsch 的同源性比对算法(J. Mol. Biol. 48 :443 (1970))、 通过 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索方法(Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85 :2444 (1988))、 通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、 BLAST、PASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr.，Madison, WI) 或通过目测。如果已鉴定出需要进行比较的2个序列，则优选应用GAP和BESTFIT测定其 最佳比对以及同一性程度。优选使用默认值为5. 00的空位权重(gap weight)和0. 30的 空位权重长度(gap weight length)。上文提及的变体可以是等位基因变体或任何其它物 种特定同源物、种内同源物(paralog)或直向同源物(ortholog)。基本相似且同样被本发
9明设想的是仍然被所述诊断组件或针对所述相应全长肽的配体识别的蛋白酶降解产物。还 包括与人NT-proBNP的氨基酸序列相比，具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽，只 要所述多肽具有NT-proBNP性质。本文提及的NT-proBNP性质是免疫学性质和/或生物学 性质。生物学性质还包括NT-proBNP或pr印roBNP前体多肽的性质及其其它亚片段的性 质。因此，变体NT-proBNP包括proBNP或preproBNP分子的N端片段，其具有与产生上述 特定NT-proBNP的pr印roBNP分子基本相同的生物学性质。亚片段的生物学性质包括成熟 BNP分子的生物活性，包括其血管舒张活性。因此，变体NT-proBNP可衍生自变体proBNP 或pr印roBNP，其一方面产生变体NT-proBNP，另一方面产生至少具有血管舒张活性的成熟 BNP变体。可通过本领域众所周知的方法确定变体是否具有血管舒张活性(参见例如El Bardei 等，Planta Med 2003 ；69 :75-77 ^Morel 等，J Cardiovasc. Pharmacol 1994 ；24 524 ff)0优选可通过在所述变体存在和不存在时测定主动脉收缩，来评价血管舒张活性， 因此，优选如下评价主动脉收缩和血管舒张活性将主动脉节段(优选来自大鼠或兔)悬浮 于装有生理溶液(NaCl，122mM ；KCl，5. 9mM ；NaHCO3,15mM ；MgCl2,1. 25mM ；CaCl2,1. 25mM ；葡 萄糖，IlmM)且通入95%02，5%C02的气体混合物的器官浴槽中，并于37°C保持。将生理溶 液置换为去极化的 IOOmM KCl 溶液(NaCl 27mM ；KCl IOOmM ；NaHCO3 15mM, MgCl2 1. 25mM ； CaCl2 1.25mM;葡萄糖IlmM)刺激主动脉节段收缩。然后将在受试变体存在下引起的收缩 幅度与其不存在时测量的反应相比较。维拉帕米可用作参比化合物。NT-proBNP变体优选具有与NT-proBNP相当的免疫学性质(即表位组成)。因此， 变体可通过前述用于测定利尿钠肽的量的方法或配体识别。优选可通过Karl等人(Karl 1999，Scand J Clin Invest 230 :177-181)或 Yeo 等人(Yeo 2003，Clinica Chimica Acta 338 :107-115)披露的测定法检测NT-proBNP的生物学和/或免疫学性质。变体还包括翻 译后修饰肽，例如糖基化肽。此外，本发明的变体亦为采样后经过修饰的肽或多肽，例如标 记(特别是放射性标记或荧光标记)通过共价或非共价与肽连接。脂连蛋白是由脂肪细胞分泌的多肽(若干已知的脂肪细胞因子之一)。在本领域 中，脂连蛋白通常亦称Acrp30和apMl。最近已经证实脂连蛋白具有各种活性，例如抗炎、抗 动脉粥样化、预防代谢综合征和胰岛素增敏活性。脂连蛋白由单一基因编码，具有244个氨 基酸，分子量约为30千道尔顿。成熟人脂连蛋白包括全长脂连蛋白的氨基酸19-244。一般 认为球状结构域包括全长脂连蛋白的氨基酸107444。脂连蛋白多肽的序列是本领域众所 周知的，例如参见W02008/084003。脂连蛋白自缔合成较大的结构。3个脂连蛋白多肽结合在一起形成同三聚体。这 些三聚体结合在一起形成六聚体或十二聚体。已知脂连蛋白在血浆中以各种多聚体复合物 存在，并通过其胶原结构域结合产生3种主要的寡聚形式低分子量(LMW)三聚体、中等分 子量(MMW)六聚体和高分子量(HMW) 12-18聚体脂连蛋白(Kadowaki等U006) Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, di abetes, and the metabolic syndrome (胰岛素抵抗、糖尿病和代谢综合征中的脂连蛋白和脂连蛋白受体).J Clin Invest. 116(7) :1784-1792 ；Rexford S. Ahima, Obesity 2006 ； 14 :242S_249S)。据报道，脂 连蛋白具有若干生理作用，例如针对动脉粥样硬化的保护活性、改善胰岛素敏感性和预防 肝纤维化。
本文使用的脂连蛋白优选是指低分子量脂连蛋白、中等分子量脂连蛋白，更优选 是指总脂连蛋白，最优选是指高分子量脂连蛋白。术语高分子量脂连蛋白(12-18聚体脂 连蛋白，优选18聚体脂连蛋白)、低分子量和中等分子量脂连蛋白和总脂连蛋白为本领域 技术人员所知。所述脂连蛋白优选为人脂连蛋白。用于测定脂连蛋白的方法参见例如US 2007/0042424A1以及W02008/084003公开的方法。优选测定血清样品中的脂连蛋白的量。本发明所述脂连蛋白还包括上述人脂连蛋白的所述特定序列的等位基因变体和 其它变体。准确地讲，本发明设计了氨基酸水平上的变体多肽，其优选与人脂连蛋白(优选 在全长人脂连蛋白的范围内)有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、 98 %或99 %的同一性。可通过本领域众所周知的算法确定2个氨基酸序列间的同一性程 度。优选在比较窗内比较2个最佳比对序列来确定同一性程度，其中相对于参比序列(其 不包含添加或缺失)，比较窗中的氨基酸序列的片段可包含添加或缺失(例如空位或突出 端)用于最佳比对。通过以下方法来计算百分比测定在两个序列中出现相同氨基酸残基 的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100 得到序列同一性的百分比。可通过下列算法进行比较序列的最佳比对=Smith和Waterman 的局部同源性算法(Add. APL. Math. 2 :482 (1981))、通过Needleman和^msch的同源性比 对算法(J. Mol. Biol. 48 :443 (1970))、通过 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索方法(Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85 :2444 (1988))、通过这些算法的计算机执行(Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA 禾口 TFASTA，Genetics Computer Group (GCG)，575Science Dr.，Madison，WI)或通过目测。如果已鉴定出需要进行比较的2 个序列，则优选应用GAP和BESTFIT测定其最佳比对以及同一性程度。优选使用默认值为 5. 00的空位权重和0. 30的空位权重长度。上文提及的变体可以是等位基因变体或任何其 它物种特定同源物、种内同源物或直向同源物。基本相似且本发明也设想的是仍被所述诊 断组件或针对所述相应全长肽的配体识别的蛋白酶降解产物。还包括与人脂连蛋白的氨基 酸序列相比，具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽。优选脂连蛋白变体具有脂连蛋 白性质，优选包括其减少脂肪组织的能力，这可在已知的动物模型中测定。例如可如下测定脂连蛋白变体是否能够减少脂肪组织可将受试变体给予脂肪细 胞、包含脂肪细胞的组织或非人类动物。优选的是，如果与未与所述变体接触的对照脂肪细 胞、对照组织或非人类动物相比，所述脂肪细胞、所述组织或所述非人动物的脂肪量减少/ 降低，则脂连蛋白的变体能够减少脂肪组织。优选在测定所述变体是否减少脂肪组织后处 死非人类动物(因此应理解为，这种测定不被视为治疗人或动物体的方法)。本说明书的测定脂连蛋白或利尿钠肽或任何其它肽或多肽的量时是指测定量或 浓度，优选半定量或定量测定。测定可直接或间接进行。直接测定是指根据从肽或多肽本身 获得的信号以及与样品中存在的肽的分子数直接相关的强度来测定肽或多肽的量或浓度。 可以通过例如测定肽或多肽的特定物理或化学性质的强度值获得这类信号一本文有时亦 称强度信号。间接测定包括从次要组分(即不是肽或多肽本身的组分)或生物读出系统得 到的信号，例如可测量的细胞反应、配体、标记或酶促反应产物。按照本发明，测定肽或多肽的量可采用测定样品中肽的量的所有已知方法来实 现。所述方法包括可在各种夹心、竞争或其它测定方式中利用标记分子的免疫测定装置和 方法。所述测定法将显示表示肽或多肽存在与否的信号。此外，信号强度优选可与样品中存
11在的多肽的量正相关或负有关(例如成反比)。更多合适的方法包括测定对肽或多肽是特 异性的物理或化学性质，例如其精确的分子量或NMR谱。所述方法优选包括生物传感器、与 免疫测定法联用的光学装置、生物芯片、分析装置(例如质谱仪、NMR分析仪或层析装置)。 此外，各种方法还包括微量培养板ELISA型方法、全自动或自动免疫测定法(可使用例如 Elecsys 分析仪)、CBA (酶促 ￡obalt Binding Assay,可使用例如 Roche-Hitachi 分析 仪)和乳胶凝聚测定法(可使用例如Roche-Hitachi 分析仪)。优选测定肽或多肽的量包括以下步骤(a)使能够激发细胞反应(其强度表示肽 或多肽的量)的细胞与所述肽或多肽接触一段适当的时间，(b)测定细胞反应。为了测定细 胞反应，优选将样品或经过加工的样品加入细胞培养物中，并测定内部或外部的细胞反应。 细胞反应可包括报道基因可测量的表达或者肽、多肽或小分子等物质的分泌。表达或物质 可产生与肽或多肽的量相关的强度信号。肽或多肽的量的测定还优选包括测定从样品中的肽或多肽获得的特定强度信号 的步骤。如上所述，这类信号可以是在质谱中观察到的以对肽或多肽有特异性的m/z变量 观察的信号强度或者对肽或多肽的有特异性的NMR谱。测定肽或多肽的量可优选包括以下步骤(a)使肽与特异性配体接触，(b)(任选) 除去非结合配体，(c)测定结合配体的量。结合配体可产生强度信号。本发明的结合包括共 价和非共价结合两者。本发明的配体可以是与本文所述肽或多肽结合的任何化合物，例如 肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，例如受体或肽或多肽的结 合配偶体及其包含肽的结合结构域的片段，以及适体，例如核酸或肽适体。制备这类配体的 方法是本领域众所周知的。例如，商品供应商也提供合适的抗体或适体的鉴定和产生。本领 域技术人员熟悉开发具有较高亲和力或特异性的这类配体的衍生物的方法。例如，可将随 机突变引入核酸、肽或多肽中。然后可按照本领域已知的筛选方法(例如噬菌体展示)测 定这些衍生物的结合。本文提及抗体时包括多克隆和单克隆抗体两者及其片段，例如能够 结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂合抗体， 其中具有所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接纳体抗体的序列结合。供体 序列通常可包括至少供体的抗原结合氨基酸残基，但也可包括供体抗体的其它在结构和/ 或功能上相关的氨基酸残基。这类杂合体可通过本领域众所周知的若干方法制备。优选配 体或配体物质(agent)与肽或多肽特异性结合。本发明的特异性结合是指配体或配体物质 应基本上不与待分析样品中存在的其它肽、多肽或物质结合(“交叉反应”)。优选特异性 结合的肽或多肽的结合亲和力应比任何其它相关肽或多肽的结合亲和力高至少3倍，更优 选至少10倍，甚至更优选至少50倍。非特异性结合是可接受的，如果它仍能明确地分辨和 测定，例如按照其蛋白质印迹上的大小或通过其在样品中相对较高的丰度。配体的结合可 通过本领域已知的任何方法测定。所述方法优选是半定量或定量的。下述描述了合适的方 法。首先，可通过例如NMR或表面等离振子共振来直接测定配体的结合。其次，如果配体还用作目标肽或多肽的酶促活性的底物，则可测定酶促反应产物 (例如可通过测定例如蛋白质印迹上裂解底物的量来测定蛋白酶的量)。或者，配体本身可 具有酶性质，并且将“配体/肽或多肽”复合物或者分别与肽或多肽结合的配体与合适的底 物接触以检测产生的强度信号。为了测定酶促反应产物，优选底物的量是饱和的。还可在反应前用可检测标记对底物进行标记。优选使样品与底物接触适当的时间。适当的时间是 指对于可检测的、优选可测量的待产生的产物的量是必需的时间。作为测定产物量的替代， 还可测定特定(例如可检出)量的产物出现所需的时间。第三，配体可与标记共价或非共价偶联以供检测和测定配体。可通过直接或间接 的方法进行标记。直接标记包括将标记与配体直接(共价或非共价)偶联。间接标记包括 将第二配体与第一配体的结合(共价或非共价)。第二配体应与第一配体特异性结合。所述 第二配体可与合适的标记偶联和/或可为结合第二配体的第三配体的靶标(受体)。使用 第二、第三甚至更高级次的配体常用来增强信号。合适的第二和更高级次的配体可包括抗 体、第二抗体和众所周知的链霉抗生物素-生物素系统(Vector Laboratories, Inc. )0配 体或底物还可用一种或多种本领域已知的标签“标记”。这类标签然后可以成为更高级次配 体的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷(digoxygeninhHis-Tag、谷胱甘肽-S-转 移酶、FLAG、GFP、myc-标签、A型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的 情况下，标签优选位于N端和/或C端。合适的标记是通过适当检测方法可检出的任何标 记。典型的标记包括金颗粒、乳胶珠、9，10-二氢化吖啶酯、鲁米诺(Iuminol)、钌、酶活性标 记、放射性标记、磁标记(例如“磁珠”，包括顺磁和超顺磁标记)和荧光标记。酶活性标记 包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。用于检测 的合适底物包括二-氨基-联苯胺(DAB)、3，3' -5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP (氯化 4-硝基蓝四唑鐺和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯、可获自Roche Diagnostics的现成储 备液)、CDP-Star (Amersham Biosciences)、ECF (Amersham Biosciences)。合适的酶-底 物组合可产生可按照本领域已知方法测定的有色反应产物、荧光或化学发光(例如使用感 光胶片或合适的照相机系统)。至于测定酶促反应，可类似地应用上文给出的标准。典型 的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa 染料(例如Alexa 568)。更多荧光标记可获自例如Molecular Probes (Oregon)。还包括 使用量子点作为荧光标记。典型的放射性标记包括ms、125I、32P、33P等。放射性标记可通过 任何已知的适当方法检测，例如感光胶片或磷光成像仪。本发明合适的测定方法还包括沉 淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电致化学发光)、RIA (放射免疫测定法)、ELISA (酶 联免疫吸附测定法)、夹心酶免疫测试法、电化学发光夹心免疫测定法(ECLIA)、解离增强 镧系荧光免疫测定法(DELFIA)、闪烁亲近测定法(SPA)、浊度测定法、比浊法、乳胶增强浊 度测定法或比浊法或者固相免疫测试法。本领域已知的其它方法(例如凝胶电泳、2D凝胶 电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法和质谱法)可单独使用或与标记 法或所述其它检测方法联用。肽或多肽的量还可优选如下测定(a)使包含上文所述肽或多肽的配体的固相支 持体与包含肽或多肽的样品接触，和(b)测定与支持体结合的肽或多肽的量。优选选自核 酸、肽、多肽、抗体和适体的配体优选以固定化形式存在于固相支持体上。用于制备固相支 持体的材料是本领域众所周知的，尤其包括市售可得的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁珠、 胶体金属微粒、玻璃和/或硅片和硅表面、硝酸纤维素条、膜、片、duracytes、反应盘的孔和 壁、塑料管等。配体或配体物质可与许多不同的载体结合。众所周知的载体的实例包括玻 璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改良的 纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁体。对本发明来说，载体的性质可以是可溶性的或是不溶
13性的。用于固定/固定化所述配体的合适方法是众所周知的，包括但不限于离子相互作用、 疏水相互作用、共价相互作用等。还设想使用“悬浮阵列”作为本发明的阵列(Nolan 2002， Trends Biotechnol. 20 (1) :9-12)。在这类悬浮阵列中，载体(例如微珠或微球)存在于悬 液中。阵列由不同的可能被标记的携带不同配体的微珠或微球组成。例如基于固相化学法 和对光不稳定的保护基来制备这类阵列的方法是普遍已知的(US 5，744，305)。本文使用的术语“量”包括多肽或肽的绝对量，所述多肽或肽的相对量或浓度以及 与之相关或可从中推导出的任何值或参数。这类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽 得到的所有特定的物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱的强度值。此外，还包 括通过本说明书中其它部分所述的间接测定法得到的所有值或参数，例如在响应肽时从生 物读出系统测定的反应水平或由特异性结合配体时得到的强度信号。要了解的是，与前述 量或参数相关的值还可以用所有标准数学运算获得。本文使用的术语“比较”包括将待分析样品包含的肽或多肽的量与本说明书中其 它部分所述的合适参比源的量进行比较。要了解的是，本文使用的比较是指相应参数或值 的比较，例如，绝对量与绝对参比量相比较，而浓度与参比浓度相比较，或者得自试验样品 的强度信号与参比样品的相同类型的强度信号相比较。可以手工或辅以计算机进行本发明 方法的步骤(C)中所述比较。对于辅以计算机比较，可将测定量的值与相应的通过计算机 程序存储在数据库中的合适参比的值进行比较。计算机程序可进一步评价比较结果，即以 适当的输出格式自动提供所需要的评价。根据步骤a)测定的量与参比量的比较，预测患有 代谢综合征的患者发生心血管事件或死亡的风险。因此，选择参比量使得被比较的量中的 差异或相似性可供将患者归为高风险组人群、低风险组人群或平均风险组人群。因此，本文使用的术语“参比量”是指可供预测上述患有代谢综合征的患者发生死 亡和/或心血管事件的风险的量。因此，参比量可来源于(i)已知在获得所述样品后，在一 定窗口期内已死亡或患上心血管事件的患者的样品，或者(ii)已知在获得所述样品后，在 一定窗口期内未死亡和/或未患上心血管事件的患者的样品。此外，本发明的参比量可定 义为一个阈值量，其中脂连蛋白和利尿钠肽两者的量大于所述阈值说明患者发生死亡和/ 或心血管事件的风险增加，而脂连蛋白的量大于阈值且利尿钠肽低于阈值说明患者发生死 亡和/或心血管事件的风险降低。优选的是，不论利尿钠肽的量如何(因此利尿钠肽的量 可低于或大于所述利尿钠肽的阈值)，脂连蛋白的量低于阈值说明患者发生死亡或患心血 管事件处于平均风险水平。适用于各患者的参比量可根据各种生理参数(例如年龄、性别或分组人群)以及 用于测定本文所述多肽或肽的方法而变化。可通过本发明的方法确定需要分析的参比样品 的合适参比量，其可以与测试样品一起进行(即同时或相继)。优选的用作阈值的参比量可 推导自正常值上限(ULN)(即群体中存在的生理量上限)。给定人群的ULN可通过各种众所 周知的技术确定。在本发明的方法中，合适的技术可以是测定肽或多肽量群体的中位值。可确定诊断标志物(即NTproBNP和脂连蛋白)的参比量，并可简单地将患者样品 中标志物的水平与参比量进行比较。诊断和/或预后试验的灵敏度和特异性不仅仅取决于 试验的分析“质量”一还取决于异常结果的定义。在实践中，接受者操作特征曲线或“R0C” 曲线通常通过将可变量的值相对于其在“正常”人群和“疾病”人群中的相对频率作图来计 算。对于任何特定的标志物，患病和未患病的个体的标志物水平的分布可能重叠。在这种情况下，试验无法以100%准确性将正常人与疾病患者绝对地区分开来，重叠区表明其中试 验无法将正常人与疾病患者区分开。选定某一阈值，超过阈值(或低于阈值，这取决于标志 物如何随疾病而变化)，将试验视为异常，而低于阈值，则视为正常。ROC曲线下面积可衡量 所观察到的可供正确鉴定疾病的测量值的概率。即使当试验结果不一定给出准确数值时， 也可以使用ROC曲线。只要可以将结果分级，就可以绘制ROC曲线。例如，“疾病”样品的试 验结果可按程度分级(例如1 =低，2 =正常，3 =高)。这种分级可与“正常”人群的结果 相关联，并绘制ROC曲线。这些方法是本领域众所周知的。参见例如Hanley等，Radiology 143 :29-36(1982)。在某些实施方案中，选择标志物以具有至少约70%敏感性，更优选至少约80%敏 感性，甚至更优选至少约85%敏感性，还更优选至少约90%敏感性，最优选至少约95%敏 感性，并配合至少约70%特异性，更优选至少约80%特异性，甚至更优选至少约85%特异 性，还更优选至少约90%特异性，最优选至少约95%特异性。在特别优选的实施方案中，敏 感性和特异性两者为至少约75%，更优选至少约80%，甚至更优选至少约85%，还更优选 至少约90%，最优选至少约95%。在这方面，术语“约”是指给定测量值+/-5%。界定本发明所述的脂连蛋白，特别是高分子量脂连蛋白(特别是血清样品中)的 阈值的参比量优选为2. 0μ g/ml，更优选2. 4μ g/ml或2. 8μ g/ml。在本发明的情况下，最 优选的脂连蛋白的参比量为2. 4 μ g/ml (特别是在血清样品中)。界定本发明所述的利尿钠肽，特别是NT-proBNP的阈值的参比量优选为30pg/ml， 更优选40pg/ml或50pg/ml (因此，比视为表明心血管并发症的参比量的NT-proBNP量低 得多)。在本发明的情况下，最优选的NT-proBNP的参比量为40pg/ml (特别是在血清样品 中)。脂连蛋白和NT-proBNP的量大于参比量优选表示死亡和/或心血管事件的风险增 加。脂连蛋白的量大于参比量且NT-proBNP的量低于参比量优选表示死亡和/或心血管事 件的风险降低。更优选⑴脂连蛋白的量小于参比量且(ii)NT-proBNP的量大于或小于参 比量表示死亡率和/或心血管事件的风险处于平均水平。有利的是，本发明的研究(参见例如实施例)发现，需要测定脂连蛋白和利尿钠肽 的量以可靠地预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。准确地讲， 测定健康个体和患有代谢综合征的患者的血清样品中NTproBNP和HMW脂连蛋白的量。已 经证实，脂连蛋白水平升高(大于参比量，例如中位值)的患有代谢综合征的患者，如果其 NT-proBNP水平也升高(大于参比量，例如中位值)，则其发生死亡和/或心血管事件的长 期风险最大，但是如果其NT-proBNP水平降低(低于中位值)，则具有最低的死亡风险。因 此，根据NT-proBNP水平，可将脂连蛋白水平升高的患者分成死亡和/或心血管事件风险相 反的2个组低风险组和高风险组。此外，不论其NT-proBNP水平如何，脂连蛋白的量降低 的代谢综合征患者在8年随访期以内的死亡率和/或心血管事件风险处于平均水平。在本 发明研究中观察到的结果是出乎意料的。在现有技术中，代谢综合征与低脂连蛋白水平有 关，并且一般认为具有低脂连蛋白水平的代谢综合征患者具有最坏的结果。本发明却表明， 如果脂连蛋白的量增加而不是降低，则患有代谢综合征的患者显著处于死亡和/或心血管 事件的风险中。已经证实，如果NT-proBNP水平的量也增加，则脂连蛋白的量升高的患者风 险也增加。如果NT-proBNP水平降低，则这些患者与其它患有代谢综合征的患者相比具有最佳预后。这些结果是出乎意料的，因为患有代谢综合征的患者脂连蛋白的水平降低被视 为风险增加而不是风险降低的标志(参见例如Trujillo M.E.等“Adiponectin-journey from an adipocyte secretory protein to biomarker of the metabolic syndrome (月旨 连蛋白一脂肪细胞分泌蛋白到代谢综合征的生物标记的行程)."Journal of Internal Medicine, Feb. 2005，第257卷，第2期，第167-175页)。术语标志物水平/量增加、标志 物水平/量降低、标志物水平/量大于和标志物水平/量小于都是指相对于相应参比值的 标志物分子的量/水平。有趣的是，在脂连蛋白的量降低的患者中，NT-proBNP不起重要作用。不论 NT-proBNP的量如何，患有代谢综合征且脂连蛋白量低于参比量(在此为中位值)的患者 发生死亡和/或心血管事件的长期风险处于平均风险水平。这是非常出人意料的结果， 因为在现有技术中认为NT-proBNP水平升高的患者发生死亡和心血管事件的风险一般比 NT-proBNP水平降低的患者的风险显著增加。例如，在对照组中同样观察到这种结果。在本 发明的情况下分析的对照组(无代谢综合征的个体)中，具有较高NT-proBNP水平的个体 的风险显著高于具有较低NT-proBNP水平的个体的风险。如果应用的话，本发明的方法将非常有益，因为该方法可供预测患有代谢综合征 的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。根据所述风险，可开始合适的治疗。本发明对 旨在提高脂连蛋白水平的疗法敏感的患者的鉴定特别有利。在本发明的情况下获得的数据 很大程度上表明不是所有代谢综合征患者都可获益于旨在提高脂连蛋白水平的疗法。因 此，本发明由此提供有效方法，可供医师早期检测发生死亡和/或心血管事件的风险，使得 可对确诊的患者进行适当的治疗，以避免或降低预期风险出现的可能性。因此，不仅每个患 者获益于本发明，而且整个社会也可节约昂贵疗法的成本。因此，本发明涉及用于在患有代谢综合征的患者中鉴定对提高脂连蛋白水平的疗 法敏感的患者的方法，所述方法包括以下步骤a)测定所述患者样品中的脂连蛋白的量，b)测定所述患者样品中的利尿钠肽的量，c)将步骤a)和b)测定的量与参比量进行比较，和d)鉴定对能够提高脂连蛋白水平的疗法敏感的患者。要了解的是，对在上文和下文中所给出术语的定义和解释已作必要的修正以适用 于本说明书和随附权利要求书中描述的全部实施方案/方法，除非明确说明与此相反。本文使用的术语“鉴定”是指评价患有代谢综合征的患者是否适于提高患者的脂 连蛋白水平的疗法，因此对所述疗法敏感。要了解的是，对所述疗法敏感的患者优选将获益 于所述疗法。具体地讲，由于所述疗法，所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险降低。 此外，对所述疗法不敏感的患者优选不会获益于所述疗法。具体地讲，由于所述疗法的后果 (不良副作用)，所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险增加，或者发生死亡或心血管 事件的风险不变。在第一种情况下(风险增加)，当实施本发明的方法时，可以避免可能对 患者有害的疗法，在第二种情况下(未改变)，可以避免进行对所述患者既不特别有利也不 特别有害的疗法，因此对整体卫生保健成本具有积极影响。本文使用的“提高脂连蛋白水平的疗法”优选是指提高患者的脂连蛋白水平、优选 高分子量脂连蛋白水平的任何疗法。用于提高脂连蛋白水平的这类疗法是本领域众所周知的。此外，某种疗法是否提高患者的脂连蛋白水平可由技术人员容易地进行确定。例如，可 以测定所述患者的第一样品的脂连蛋白的量，然后可以开始一种治疗以测试其对脂连蛋白 水平的作用，之后在开始治疗后(例如1个月或2个月后)，获得第二样品，并测定所述第二 样品中的脂连蛋白的量。与所述第一样品相比，所述第二样品中脂连蛋白的量的增加(优 选显著增加)，优选表明某种疗法增加患者的脂连蛋白水平。能够提高患者的脂连蛋白水 平的疗法优选为显著提高脂连蛋白水平(优选血清高分子量脂连蛋白水平)的疗法，更优 选提高至少 10% -15%,15-20%,20-25%,25-30%,30% -35%,35% -40%或更多的疗法。 优选所述提高在3个月、6个月、9个月或12个月的时期内达到。最优选，所述疗法在6个 月的时间内提高患者的所述脂连蛋白水平达25-35%。Kadowaki等人的刊物(Journal of Clinical Investigation(2006), Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance, diabetes, and the metabolic syndrome (胰岛素抵抗、糖尿病和代谢综合征 中的脂连蛋白和脂连蛋白受体)，第117卷(7) :1784-1792)和Han等人(Journal of the American College of Cardiology (2007), Adiponectin and Cardiovascular disease response to therapeutic interventions (脂连蛋白禾口心血管疾病对治疗干预的反应)， 第49卷 531-8)概括了旨在影响、特别是提高患者的脂连蛋白水平的疗法。此外，用于 提高患者的脂连蛋白水平的药物公开于W02007007732。前述文献均通过引用将其公开内容 整体结合到本文中。在本发明的情况下，能够增加患者的脂连蛋白水平的疗法优选选自体重显著减 轻、优选体重减少至少10%体重、更优选至少15%，优选通过减少内脏脂肪(visceral adiposity)；给予ACE抑制剂(特别是贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、 赖诺普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利和群多普利)；给予过氧化物 酶体增殖物激活受体-a (PPARa)激动剂，优选贝特类(特别是苯扎贝特、环丙贝特、氯贝 丁酯、吉非贝齐、非诺贝特)、过氧化物酶体增殖物激活受体-Y (PPARy)激动剂(优选噻 唑烷二酮类，例如罗格列酮和吡格列酮)；给予血管紧张素II型I受体阻滞药；给予降糖药 (优选格列美脲(但不是二甲双胍))；增加亚油酸摄取。作为能够增加患者的脂连蛋白水 平的疗法，还包括给予脂连蛋白。特别包括在本发明中的能够提高受治疗者的脂连蛋白水 平的疗法为减轻体重至少10%并给予噻唑烷二酮类，优选罗格列酮和吡格列酮。已知噻唑 烷二酮类在白脂肪组织中显著上调脂连蛋白表达(参见例如Maeda等，Diabetes 2001,50 2094-2099)。用于提高脂连蛋白水平的疗法的其它药品为noacin和大麻素受体拮抗剂，例 如利莫纳班。正如本领域技术人员将会了解的一样，前述评价一般对于待鉴定的全部个体(即 100%)不会都正确。然而，条件是能鉴定出统计学显著性部分的患者(例如组群研究中的 组群)。可由本领域技术人员应用各种众所周知的统计评价工具容易地确定某一部分是否 有统计显著性，例如测定置信区间、确定P值、斯图登t检验、曼-惠特尼检验等。详情可参 见 Dowdy 禾口 Wearden,Statistics for Research,John Wiley & Sons,New York 1983。优 选的置信区间为至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。ρ值优选为0. 1、 0. 05,0.01,0. 005或0. 0001。更优选可通过本发明的方法适当鉴定出至少60%、至少70%、 至少80%或至少90%的患者人群。在本发明上述方法中，术语“参比量”优选是指可供鉴定对增加脂连蛋白的量的疗
17法敏感或不敏感的患者(其患有代谢综合征)的多肽的量。因此，参比量可得自(i)已知 对所述疗法敏感的患者，特别是已知已成功治疗的患者(特别是当接受所述疗法时未死亡 或患心血管事件的患者)或(ii)已知对所述疗法不敏感的患者，特别是已知未成功治疗的 患者(特别是因所述疗法死亡或患心血管事件的患者)。优选的参比量可参见本文的其它 部分。优选患者样品中的脂连蛋白的量低于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量低于所 述利尿钠肽的参比量，表明患者对能够提高脂连蛋白水平的疗法敏感。优选脂连蛋白的量低于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量大于所述利尿钠肽的 参比量，表明所述患者对能够提高脂连蛋白水平的疗法敏感。所述患者还对心脏疗法(该 术语的解释见下文)敏感。另外，优选所述患者对心脏疗法(该术语的解释见下文)敏感。优选脂连蛋白的量大于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量低于所述利尿钠肽的 参比量，表明所述患者对能够提高脂连蛋白水平的疗法不敏感。然而，优选所述患者对心脏 疗法(该术语的解释见下文)敏感。优选脂连蛋白的量大于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量大于所述利尿钠肽的 参比量，表明所述患者对能够提高脂连蛋白水平的疗法不敏感。术语“心脏疗法”优选包括旨在改善心脏功能障碍、优选心力衰竭的治疗方案。优 选所述疗法包括给予适于治疗心脏功能异常、特别是心力衰竭的药品。适于治疗心力衰 竭的药品是本领域众所周知的，参见例如Heart Disease，2005，第7版，主编Braunwald， Elsevier Sounders，参见表 23-1、23-6、23-7、23-8、23-9、23_10。优选给予这类药品的目的 在于治疗心力衰竭的症状和体征，且其目的在于防止心力衰竭进一步发展。适于治疗心力衰竭的药物优选为钙拮抗剂(钙通道阻滞药)、地高辛、洋地黄毒 苷、醛固酮拮抗剂和利尿药。因此，上述方法还可供鉴定对心脏疗法敏感的患者，并因此可获益于心脏疗法。优 选利尿钠肽的量大于参比量表明所述患者是敏感的，因此可获益于心脏疗法。优选如果利 尿钠肽的量低于参比量，则表明所述患者对心脏疗法不敏感，因此，将不会受益于所述疗法 (特别因为卫生保健成本增加和不良副作用的风险增加)。因此，本发明还涉及评价患有代谢综合征的患者是否可获益于提高脂连蛋白水平 的疗法和/或心脏疗法的方法，所述方法包括以下步骤a)测定所述患者样品中的脂连蛋白的量，b)测定所述患者样品中的利尿钠肽的量，c)将步骤a)和b)测定的量与参比量进行比较，和d)评价所述患者是否可获益于能够提高脂连蛋白水平的疗法和/或心脏疗法。优选，a)脂连蛋白的量低于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量低于所述利尿钠肽 的参比量，表明所述患者可获益于能够提高脂连蛋白水平的疗法，而所述患者将不会获益 于心脏疗法；和b)脂连蛋白的量低于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量大于所述利尿钠肽的参 比量，表明所述患者可获益于能够提高脂连蛋白水平的疗法，且还可获益于心脏疗法；和c)脂连蛋白的量大于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量大于所述利尿钠肽的参 比量，表明所述患者将不会获益于能够提高脂连蛋白水平的疗法，却可获益于心脏疗法；和
d)脂连蛋白的量大于脂连蛋白的参比量且利尿钠肽的量低于所述利尿钠肽的参 比量，表明所述患者将不会获益于能够提高脂连蛋白水平的疗法，且所述患者将不会获益 于心脏疗法。优选的参比量如本文其它部分的描述。出人意料的是，在本发明的情况下所得 到的结果表明，利尿钠肽的量略微增加(特别是NT-proBNP大于40pg/ml)的患有代谢综 合征的患者风险增加，并因此可获益于心脏疗法。在现有技术中，表明需要心脏疗法的 NT-proBNP的参比量一般比本发明的NT-proBNP的参比量大得多(例如125pg/ml)。此外，本发明还包括适于实施本发明的方法的试剂盒和装置。因此，本发明涉及用于预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件 的风险的装置，所述装置包括用于测定患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部件 (means)，以及用于将通过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的 部件，从而预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。本发明还包括用于鉴定对能够提高患者的脂连蛋白水平的疗法敏感的患者的装 置，所述装置包括用于测定患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部 件，以及用于将通过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件， 从而鉴定对能够提高所述患者的脂连蛋白水平的疗法敏感的患者。本文使用的术语“装置”是指至少包括彼此有效连接的上述部件(means)的部件 系统，使得可鉴定对提高患者的脂连蛋白水平的疗法敏感的患者或可预测患有代谢综合征 的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。在上文本发明的方法中公开了用于测定脂连蛋 白和利尿钠肽的量的优选部件和用于进行比较的部件。如何操作性连接所述部件将取决于 装置中所包括的部件类型。例如，当使用自动测定肽的量的部件时，通过所述自动操作部件 获得的数据可用例如计算机程序处理，以得到所需要的结果。在这种情况下，优选部件装入 单一装置中。因此，所述装置可包括用于测定应用样品中肽或多肽的量的分析单元和用于 处理所得数据以进行评价的计算机单元。或者，当部件(例如测试条(test stripe))用于 测定肽或多肽的量时，比较部件可包括对照测试条或表格，从而将测定量与参比量进行比 较。测试条优选与特异性结合本文所述肽或多肽的配体偶联。测试条或装置优选包括用于 检测所述肽或多肽与所述配体结合的部件。与上述本发明的方法有关的实施方案公开了用 于检测的优选部件。在这种情况下，将部件有效连接，因为系统用户按照手册中提供的说明 和解释，将测定的量的结果及其诊断或预后值结合起来。在这类实施方案中，部件可以独立 的装置出现，并优选包装成试剂盒。本领域技术人员应当了解如何容易地将部件连接。优 选的装置是无需专业临床工作人员的专门知识便可使用的装置，例如只需要加载样品的测 试条或电子装置。结果可作为原始数据输出提供，这需要临床工作人员予以解释。然而，装 置的输出优选是经过处理(即经过评价)的原始数据，不需要临床工作人员予以解释。其 它优选的装置包括本发明方法上面提及的分析单元/装置(例如生物传感器、阵列、与特异 性识别多肽(其量有待测定)的配体偶联的固相支持体、等离子表面共振装置、NMR质谱仪、 质谱仪等)或评价单元/装置。此外，本发明涉及适于实施本发明的方法的试剂盒，因此用于预测患有代谢综合 征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险，所述试剂盒包括实施所述方法的说明书和用 于测定患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部件，以及将通过所述
19部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件，从而预测患有代谢综合征 的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。此外，本发明涉及适于实施本发明的方法的试剂盒，因此，用于鉴定对能够提高患 者的脂连蛋白水平的疗法敏感的患者，所述试剂盒包括实施所述方法的说明书和用于测定 患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部件，以及将通过所述部件测 定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件，从而评价患者是否对能够提高脂 连蛋白水平的疗法敏感。本文使用的术语“试剂盒”是指可以包装在一起、也可以不包装在一起的本发明的 上述化合物、部件或试剂的集合。可将试剂盒的各组分装入独立的小瓶中(即作为独立组 件的试剂盒)，或者以单一小瓶提供。此外，要了解的是，本发明的试剂盒将用于实施本文上 述方法。优选设计成所有组分以现成即用方式提供以实施本发明上述方法。此外，试剂盒 优选包括实施所述方法的说明书。说明书可以纸质或电子形式的用户手册提供。例如，手 册可包括说明书，用于解释当使用本发明的试剂盒实施上述方法时获得的结果。本说明书引用的所有参考资料的全部公开内容和本说明书中具体提及的公开内 容均通过引用结合到本文中。下面的实施例仅用于说明本发明。无论如何都不得解释为是对本发明范围的限 制。实施例1 测定患有代谢综合征的患者样品中的高分子量脂连蛋白和NT-proBNP测定了获自共计沈56名随机选择个体的血清样品以及356名患有代谢综合征的 患者的血清样品中的高分子量脂连蛋白和NT-proBNP。按照欧洲胰岛素抵抗研究小组定义 的代谢综合征的存在标准(EGIR，血清胰岛素大于44pmol/l，以及下列中的两个指标BMI 大于30kg/m2、血清甘油三酯大于2mmol/l或S-HDL低于lmmol/1、葡萄糖大于6. lmmol/1、 血压高于140收缩压/90舒张压mm Hg)，选出356名患有代谢综合征的患者。用脂连蛋白 (多聚体)EIA 试剂盒(Alpco Diagnostics, Salem,USA 目录号47-ADPH_9755)测定了 HMW 脂连蛋白。测定了两个组(健康个体、患有代谢综合征的个体)的NT-proBNP和脂连蛋白的 中位值健康个体NTproBNP 53pg/ml，脂连蛋白 3.6μβ/πι1 ；患有代谢综合征的个体 NTproBNP 39. 7pg/ml，脂连蛋白 2· 38μ g/ml。在随访研究中，测定了获得样品后8年的死亡率(参见表1)。表1 :8年随访期的死亡率
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权利要求
1.一种预测方法，其用于预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风 险，所述方法包括以下步骤，a)测定所述患者样品中的脂连蛋白的量，b)测定所述患者样品中的利尿钠肽的量，c)将步骤a)和b)测得量与参比量进行比较，和d)根据步骤c)获得的信息，预测患者发生死亡和/或心血管事件的风险。
2.权利要求1的方法，其中所述患者是人。
3.权利要求1和2的方法，其中所述样品是血液、血清或血浆样品。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脂连蛋白是高分子量脂连蛋白，和/或其中 所述利尿钠肽是NT-proBNP。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中a)利尿钠肽的量大于所述利尿钠肽的参比量，以及脂连蛋白的量大于所述脂连蛋白的 参比量表明，所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险增加，b)利尿钠肽的量低于所述利尿钠肽的参比量，以及脂连蛋白的量大于所述脂连蛋白的 参比量表明，所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险降低，和c)利尿钠肽的量低于或大于所述利尿钠肽的参比量，以及脂连蛋白的量低于所述脂连 蛋白的参比量表明，所述患者发生死亡和/或心血管事件的风险处于平均水平。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中(i)所述脂连蛋白是高分子量脂连蛋白，且所 述脂连蛋白的参比量为2. 4μ g/ml，优选2. 4 μ g/ml+/-0. 5或+/-0. 2 μ g/ml，和/或其中 (ii)所述利尿钠肽是NT-proBNP，且NT-proBNP的参比量为40pg/ml，优选40pg/ml+/_5或 +/-3pg/mL·
7.一种评价方法，其用于评价患有代谢综合征的患者是否可获益于提高脂连蛋白水平 的疗法，所述方法包括以下步骤a)测定所述患者样品中脂连蛋白的量，b)测定所述患者样品中利尿钠肽的量，c)将步骤a)和b)测得量与参比量进行比较，和d)评价所述患者是否可获益于所述疗法。
8.权利要求7的方法，其中所述能够提高患者的脂连蛋白水平的疗法选自优选通过 减少内脏脂肪而减轻体重至少10%、给予ACE抑制剂、给予过氧化物酶体增殖物激活受 体-α (PPAR α )激动剂、过氧化物酶体增殖物激活受体-、(PPAR y )激动剂、给予降糖药、 增加亚油酸摄取。
9.权利要求7和8中任一项的方法，其中所述疗法是给予噻唑烷二酮类。
10.一种装置，其用于预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险， 所述装置包括用于测定所述患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部件、以及用于将通 过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件，从而预测患有代谢 综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。
11.一种试剂盒，其适于实施权利要求1-6中任一项的方法，所述试剂盒包括实施所 述方法的说明书、用于测定患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部 件、以及用于将通过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件，从而预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险。
12.一种装置，其用于评价患者是否可从提高患者脂连蛋白水平的疗法中获益，所述装 置包括用于测定患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部件、以及用 于将通过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件，从而评价患 者是否可获益于提高脂连蛋白水平的疗法。
13.—种试剂盒，其适于实施权利要求7和8中任一项的方法，所述试剂盒包括实施所 述方法的说明书、用于测定患有代谢综合征的患者样品中的脂连蛋白和利尿钠肽的量的部 件、以及用于将通过所述部件测定的脂连蛋白和利尿钠肽的量与参比量进行比较的部件， 从而评价患者是否可获益于提高脂连蛋白水平的疗法。
全文摘要
本发明涉及根据测定患者样品中的利尿钠肽和脂连蛋白来预测患有代谢综合征的患者发生死亡和/或心血管事件的风险的方法。此外，本发明涉及根据上述标志物的测定来鉴定对提高患者的脂连蛋白水平的药物疗法敏感的患者的方法。本发明还包括适于实施本发明的方法的试剂盒和装置。
文档编号G01N33/74GK102150047SQ200980136142
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月10日 优先权日2008年9月11日
发明者A·霍施, D·茨杜内克, G·黑斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司