专利名称：产生epo方法的过程中控制的制作方法
产生EPO方法的过程中控制本发明涉及一种检测红细胞生成素的方法，特别是用于发酵生产过程中产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液的过程中控制(Inprozesskontrolle)的方法。所述过程特征特别在于可以借助等电聚焦(IEF)的专门方法来直接确定产生的红细胞生成素的同种型组成。结合从红细胞生成素含量的测定(优选通过ELISA)获得的数据，可以在发酵过程期间或刚刚结束后评价合成的粗制品的质量，从而可以控制后续的纯化过程。当使用灌流反应器时，这是特别有利的。红细胞生成素(缩写为ΕΡ0)是分子量为约34到39kDa的糖蛋白。它由165个氨基酸的无分枝多肽链以及1个0-糖苷键合(Ser 126)和3个N-糖苷键合(Asn 24, Asn 38 和Asn 83)的糖侧链(碳水化合物部分)组成。侧链由单糖甘露糖，半乳糖，岩藻糖，N-乙酰葡萄糖胺，N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸组成。红细胞生成素可以以不同的同种型存在。红细胞生成素分子量的这种差异归因于与神经氨酸衍生物末端连接的糖链的异质性。通过链的不同长度和分枝，可以构建多种“糖分枝”，这产生EPO分子所有同种型的特征。EPO主要在肾中产生，作为生长因子，刺激骨髓中红细胞的形成。在肾衰竭的情况下，受损的肾不产生足够的EPO或根本不产生任何ΕΡ0，因此没有足量的红细胞来源于骨髓干细胞。通过施用生理量的EPO(其刺激骨髓中红细胞的形成)可以治疗这种肾贫血。用于施用的EPO可以获自人尿液或通过基因技术方法产生。因为人体中只包含非常痕量的ΕΡ0， 所以从其天然来源分离EPO对于治疗目的来说几乎是不可能的。因此，基因技术方法提供以更高量产生这种物质的唯一经济可能性。通过基因技术方法重组产生红细胞生成素主要发生在所谓的CHO细胞(中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary))并且使用基本上3种不同的方法培养真核宿主细胞 (描述于例如 EP-A-O 148 605 和 EP-A-205 564 ；BioProcess Inter-national 2004,46 ； Gorenflo et al.，Biotech.Bioeng. 2002，80，438 和 W09501214)。在分批法中，在培养开始时将培养基和细胞导入生物反应器。直到培养完成之前， 既不添加营养物也不从发酵罐移出细胞，只添加氧气。当一或多种底物被耗尽时，终止所述方法，从发酵上清液收获产物。第二种已知的培养方法是连续法，在其期间向反应器连续注入新鲜培养基，并相应地从发酵罐取出产物。这导致营养物的连续供应，同时不想要的代谢产物诸如生长抑制物铵和乳酸盐被去除或稀释。因此，借助于这种方法可以实现更高的细胞密度并在相当长的时间段内得到维持。所谓的透析反应器是连续法的特例，其能够使高分子物质诸如蛋白保留在发酵罐中，而可以添加低分子物质诸如底物或从系统中去除主要的副产物铵和乳酸盐。灌注反应器用于利用不同细胞保留系统的化合物和蛋白的微生物产生的用途也是公知知识，并且也进行了有关EPO的描述。最后，第三种可能的方法是补料分批发酵法，其中培养从全部发酵罐体积的分数量开始，在较短生长期后添加新鲜底物。这能够产生比分批法更高的细胞密度和更长的处理时间。这种方法的另一优势是细胞代谢受补料程度的影响，这可以造成更少的废物产生。与连续法相比，细胞产物可以在更长的时间段内在发酵罐中聚集，从而实现更高的产物浓度，使得后续处理(Aufarbeitimg)更容易。广泛的层析纯化方法与发酵方法结合以便从上清液分离ΕΡ0，其可以用于治疗， 对应于欧洲药典(Ph. Eur. ；01/2002 :1316))或 Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins (EMEA/CHMP/94256/2005))白勺标准品。在这方面，本领域现有技术描述于多种方法，诸如W0-A-05/121173，EP-A-O 228 452，EP-A-O 267 678，EP-A-O 830 376，EP-A-I 127 063，W0-A-03/045996, EP-A-O 428 267 和 W02005121173。根据本领域现有技术公开的方法，将包括红细胞生成素的样品用于聚丙烯酰胺凝胶的分离方法(例如等电聚焦)，通过施加电场分离样品中包含的蛋白。电泳之后进行所谓的免疫印迹(免疫-印刷或免疫-转移)，在此期间蛋白被转移到膜上。因此，在膜表面获得各个蛋白的拷贝。使用的膜具有下列优点蛋白主要由于疏水性相互作用而被牢固固定，并且膜以化学中性方式起作用。由于EPO分子位于膜表面，对于抗体(用于使红细胞生成素可见)来说它们是容易接近的。借助于等电聚焦，可以分离红细胞生成素的同种型。为了检测红细胞生成素，首先将膜与特异性结合全部现有EPO分子的单克隆抗 EPO抗体温育。其他蛋白不与抗体反应。可以从膜洗去未与EPO结合的单克隆抗体，因为膜表面的剩余部分起初已被非特异性蛋白封闭。抗体与EPO的结合是可逆的，因为它基于非共价相互作用，因此可以例如通过改变PH值而逆转。在双印迹方法中，将结合红细胞生成素的抗体转移到第二膜在酸性环境下抗体改变其结合结构域构象，当施加电场时，单克隆抗体从EPO分子解离并穿过电场向着阴极方向，在那里它与第二膜结合。EPO分子以及其他非特异性蛋白仍保留在第一膜，因为与第一膜的结合不受pH值波动的影响。采用这种方式获得EPO条带的新拷贝。但是，在第二模上除了特异性单克隆抗体(其先前结合固定在第一膜上的红细胞生成素分子)以外不存在红细胞生成素分子。通过第二抗体(二抗)(其与抗EPO单克隆抗体反应)使抗体条带可见。这种第二抗体与特定酶(例如碱性磷酸酶或过氧化物酶)偶联，所述酶在发生显色反应期间催化底物的转化。归因于非特异性信号的降低，第二转移是必需的，因为酶标二抗无法非特异性地与第一膜上的其他样品部分反应。此外，通过抗体-酶-缀合物与第一抗体的多重键合，信号的放大和灵敏度的相关增加是可能的。双印迹方法的一个缺点是显著更高的材料和时间消耗。因此，用于检测红细胞生成素的方法在本领域现有技术中已被公开，并且对本领域技术人员来说是公知的，但是为了检测红细胞生成素，如上所述使用显著更复杂的双印迹方法(Chuan et al. , Cytotechnology 2006,51,67-79 ；Hol-Iaender et al.， Laborpraxis Dezember 2004,56-59 ；Lasne,Journal of Immu-nological Methods 2003, 276，223-226)，或者，当使用电聚焦方法时，只有一部分必需pH范围在凝胶上显示，这样的话同种型分离的选择性不足以评价EPO粗制品的质量(Wimmer et al. , Cytotechnology 1994，16，137-146)。但是，本领域现有技术公开的红细胞生成素检测方法过于复杂，不适于红细胞生成素发酵生产中的过程中控制。本发明的目的是提供简化和改进的红细胞生成素检测方法，用于过程中控制，其中所述过程能够表征来自EPO发酵过程的培养上清液，使得只有被评估为合适的选择的发酵溶液被导入广泛的纯化过程。特别从经济观点来说，本方法应当优于本领域现有技术公开的方法。所述技术问题通过测定红细胞生成素同种型组成的方法来解决，包括下列步骤a)在具有2. 5到3. 5的下限和5到8的上限的pH范围在凝胶中对包括红细胞生成素的样品进行等电聚焦，其中包括红细胞生成素的样品来源于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液；b)将凝胶中包括并分离的蛋白转移到膜；c)通过特异性抗体验证与膜结合的红细胞生成素。在优选的方法中，针对红细胞生成素的第一抗体在步骤C)中与结合到膜的红细胞生成素结合，其中当第一抗体与结合到膜的红细胞生成素结合时，检测所述这些第一抗体与结合到膜的红细胞生成素的结合。优势在于通过针对所述第一抗体的第二抗体来检测第一抗体与结合到膜的红细胞生成素的结合。这意味着，在步骤C)的方法中，针对红细胞生成素的第一抗体结合结合到膜的红细胞生成素，针对第一抗体的第二抗体结合结合了红细胞生成素的第一抗体。由于以下事实，除了测定EPO含量，优选通过ELISA进行，借助于专门的等电聚焦法(IEF)结合单一印迹步骤直接测定发酵上清液的同种型组成，提供一种有益和简化的方法，其被用于控制发酵过程和决定必须被纯化的培养上清液的选择。鉴于本领域现有技术，遇到如上所述目的的本领域技术人员不会有信心认为在纯化步骤前使用本发明的方法来选择发酵组分会取得成功。到目前为止文献中还没有描述同等简单和有效的方法。以下是尤其有益的，利用本发明的等电聚焦法，在凝胶上显示具有 2. 5到3. 5的下限和5到8的上限的pH范围(特别是3到6的pH范围)，如此在同种型分离方面的必需选择性足以评价EPO粗制品的质量。此外，在优选的实施方案中，该方法被简化到以下程度，使得可以在单次蛋白转移(印迹)后能够检测到红细胞生成素。在现有技术中，与此相反，使用显著更复杂的双印迹方法进行检测。在优选的方法中，酶(优选碱性磷酸酶)与第二抗体共价结合，其通过底物的催化反应引起颜色反应。因此，为了 EPO的比色检测，优选在膜上使用两种抗体溶液，包含碱性磷酸酶的第二抗体，如此随后可以使用所述酶的底物作为着色剂。特别优选的是使用抗EPO 小鼠和抗小鼠IgG结合BCIP/NPT(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基四氮唑蓝)。此外，优选在将膜与针对红细胞生成素的第一抗体温育后，进行一或多个清洗步骤，随后将膜与针对红细胞生成素的第一抗体进一步温育。膜与针对红细胞生成素的抗体的这种两次或多次温育使得可能的抗原-抗体反应更加充分进行，从而使得红细胞生成素的特异性信号增加。在特别优选的方法中，在清洗步骤(其在膜与针对红细胞生成素的第一抗体温育之后)期间使用的至少一种溶液包含溶于水性介质的有机酸。采用这种方式未特异性结合的抗体被再次从膜除去，印迹膜上可能的自由结合位点被封闭。总而言之这显著增加了条带的选择性。优选溶液包含按重量计0. 1到1. 5 %，优选按重量计0. 5到1%，更优选按重量计0.6到0.8%的有机酸。尤其是有机酸可以是单、二或三羧酸(诸如乙酸，丙酸，乳酸， 琥珀酸，抗坏血酸，己二酸或柠檬酸)，特别优选的是乙酸。如上所述在一个优选的方法中，与第一抗体溶液的温育进行两次，在这之间进行包括4个步骤的清洗过程。此处，优选使用TBST (TriS-缓冲的盐水-Tween)和TBS (Tris-缓冲的盐水)，稀释的水性有机酸。特别优选使用稀释的水性乙酸，和甚至更优选使用浓度范围为0. 5%到的稀释的水性乙酸。在一个优选的方法中，使用聚(偏二氟乙烯)膜作为膜。在一个优选的方法中，膜用于印迹，其适于结合蛋白。特别优选的是多微孔聚(偏二氟乙烯)膜(PVDF)，和甚至更优选的是 Millipore Company 的 Immobilon-P-印迹膜。在另一个优选的方法中，聚丙烯酰胺凝胶(其施加于惰性载体箔)用于等电聚焦法。优选地，标准化聚丙烯酰胺凝胶(其结合惰性载体箔，例如由聚酯制成)用于IEF。特别优选的是其PH梯度在电场中通过载体两性电解质形成的凝胶。甚至更优选的是义！·^ 公司的 Blank PreNets0尤其是，优选为了调节凝胶的pH值，在等电聚焦期间使用两性电解质，其调节凝胶中的PH范围为pH 3到pH 6。特别优选的是使用Serva公司的krvalyt 3_6。在进一步优选的方法中，包括红细胞生成素的样品来源于在灌注反应器中生长的产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液。优选在等电聚焦法之前给包括红细胞生成素的样品脱盐，如果需要的话进行浓缩。在本发明方法特别优选的实施方案中，在发酵期间测定红细胞生成素的同种型组成。同样，优选的是使用ELISA检测以便测定培养上清液的EPO含量。特别优选的是 Roche Diagnostics 公司的 EPO ELISA 检测。本发明的方法导致EPO生产过程需要显著更少的装置和人力资源，进而转化为时间和花费的显著节约。在获得培养上清液的样品(例如来自灌注发酵过程)后不迟于对小时，可以决定发酵溶液的纯化是否是有意义的以及如何控制纯化过程。商品化供应的Erypo 制品(Janssen-Cilag)用做参照材料。本发明还提供一种用于培养上清液的过程中控制的方法，所述培养上清液来源于产生红细胞生成素的真核细胞的发酵，包括下列步骤a)根据如上所述的本发明检测红细胞生成素的方法来测定红细胞生成素的同种型组成；b)测定样品中红细胞生成素的含量，优选通过ELISA进行；c)借助于步骤a)和b)中获得的数值和信息选择发酵溶液用于纯化红细胞生成素，或继续发酵。所述方法特征特别在于可以借助专门的等电聚焦法(IEF)来直接确定发酵上清液的同种型组成。结合从EPO含量的测定(优选通过ELISA)获得的数据，可以在发酵过程期间或至其刚刚完成评价粗制品的EPO质量，从而可以控制后续的纯化过程。下列实施例旨在解释本发明，而不是限制其范围。附图描述
图1显示等电聚焦和显色后膜上不同EPO组分(组分1到组分5)的印迹。样品来源于47天期间内产生红细胞生成素的CHO细胞系的灌注发酵。
实施例EPO是在CHO细胞中发酵产生的。通过专利和科学文献中针对真核细胞、尤其是 CHO细胞描述的标准步骤进行发酵。在灌注反应器的不包含任意动物成分的培养基中进行培养。在最多50天的时段内连续进行收获。在等电聚焦法之前，对必须接受分析的各发酵液进行脱盐和浓缩。为此，首先借助于超速离心试剂盒和IOkDa的分子量截断，通过离心GOOOg 60分钟和14000g 60分钟)将 15mL样品压缩到200 μ L，达到约14mg/L的总EPO含量(通过ELISA检测测定)，将12 μ L 浓缩物与^yL超纯水和10 μ L乙醇混合，并在-20°C保存60分钟。然后将样品溶液在冷冻离心机OO分钟，16100g，0°C)中离心，溶液的上清液用于等电聚焦(IEF样品溶液)。等电聚焦法从预聚焦凝胶开始(Blank PreNets, Serva ；20到60分钟直至大约400Vh)，以便pH梯度从pH 3变到pH6 (Servalyt 3-6) 0为此，选择约300V的电压值和3. 5mA的电流值(阴极缓冲液1M甘氨酸；阳极缓冲液分别为25mM的天冬氨酸和谷氨酸)。之后将15 μ L IEF样品溶液和对照溶液(Erypo -制品)分别移液到Sample Application Piece (Serva)，通过施加约2000Vh的电压将溶液等电聚焦。随后，聚焦过程立刻中断，在聚焦过程在进一步的2500Vh继续之前除去Sample Application Pieces。在超过4500Vh的样品聚焦时间后，终止等电聚焦过程，凝胶在预冷的印迹缓冲液(用超纯水和400mL甲醇将200mL 10XTris/甘氨酸缓冲液(Bio-Rad)稀释到2L)中温育15 分钟。在平行步骤中，根据供应商说明书制备Immobilon-P-印迹膜(Millipore)。然后在下列条件下将凝胶印迹到膜上印迹缓冲液(IXTris/甘氨酸，含20%甲醇，Bio-Rad)中 50V恒定50分钟。在蛋白转移后立刻相继进行3个清洗步骤，首先用甲醇，然后用水两次， 各30秒。随后将膜放入封闭溶液(溶于IXTBS缓冲液(Bio-Rad)的5%脱脂奶粉溶液)， 在平缓振荡下于室温下温育60分钟。除去封闭溶液后，用TBST (0.5% Tween 20，溶于 TBS(Bio-Rad))清洗3次。随后在第一抗体溶液中温育至少4小时(1% BSA(Sigma)，溶于 30ml 的 IXTBS 缓冲液(Bio-Rad)，含 50 μ 1 抗 EPO-小鼠(RD-Systems)的 60 μ 1500mM 叠氮钠溶液)。然后利用TBST，TBS,0. 7%水性乙酸和再一次的TBST进行进一步的清洗过程，其中膜在乙酸溶液中温育60分钟。然后在相同条件下用第一抗体溶液反复处理膜。用TBST清洗3次后，利用第二抗体溶液处理膜(1% BSA(Sigma)，溶于含60 μ 1 500mM叠氮钠的30ml IXTBS缓冲液(Bio-Rad)，向其中添加35 μ 1抗小鼠IgG (Sigma))。用TBST清洗3次和AP缓冲液(IOmL 5M盐溶液，用50mL IM Tris-HCl溶液(pH 9. 5)和5mL IM氯化镁溶液和超纯水稀释到IL的溶液体积)清洗2次后，利用BCIP/NBT Liquid Substrate System(Sigma)(当平缓振荡时室温下10到20分钟)给凝胶显色。通过添加AP终止溶液(IOml 0. 5M Na-EDTA 溶液(pH 8. 0)，用20mL IM Tris-HCl溶液(pH 8. 0)和超纯水稀释到IL的溶液体积)终止颜色反应，用超纯水再次清洗膜。风干后，目测或通过密度测定鉴定膜(参见图1)。通过Roche Diagnostics GmbH公司的EPO ELISA检测(光度测定的酶联免疫吸附测定，使用预包被抗体的微量滴定板体外定量测定人血清/血浆中红细胞生成素用于研究目的)测定培养上清液的EPO含量。对于来自灌注反应器的单一组分(总发酵时间47天)，计算下列范围的EPO含量组分1 (发酵直至第5天) 约80mg/L组分2 (发酵直至第13天) 约75mg/L组分3 (发酵直至第20天) 约140mg/L组分4 (发酵直至第25天) 约80mg/L组分5 (发酵直至第32天) 约150mg/L图1结果的鉴定显示，尤其是组分2和4以及可能组分3的纯化是有意义的。相对于总EPO含量，这些组分具有治疗上可用同种型的最高百分比。相反，根据ELISA检测， 组分5具有最高的EPO含量，但是与Erypo 参照材料相比，只包含极微量的所需同种型。
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权利要求
1.用于确定红细胞生成素的同种型组成的方法，包括下列步骤a)在具有2.5到3. 5的下限和5到8的上限的pH范围在凝胶中对包含红细胞生成素的样品进行等电聚焦，其中包括红细胞生成素的样品来源于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液；b)将凝胶中包括并分离的蛋白质转移到膜；c)通过特异性抗体验证与膜结合的红细胞生成素。
2.权利要求1的方法，其特征在于针对红细胞生成素的第一抗体在步骤c)中与结合到膜的红细胞生成素结合，其中当所述第一抗体与结合到膜的红细胞生成素结合时检测这些第一抗体与结合到膜的红细胞生成素的结合。
3.权利要求2的方法，其特征在于通过针对所述第一抗体的第二抗体来检测第一抗体与结合到膜的红细胞生成素的结合。
4.权利要求1的方法，其特征在于在步骤c)中，针对红细胞生成素的第一抗体与结合到膜的红细胞生成素结合，而针对第一抗体的第二抗体与结合红细胞生成素的第一抗体结合。
5.权利要求3或4的方法，其特征在于酶、优选碱性磷酸酶与第二抗体共价结合，其通过底物的催化反应引起颜色反应。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其特征在于在膜与针对红细胞生成素的第一抗体温育后，进行一或多个清洗步骤，随后将膜与针对红细胞生成素的第一抗体进一步温育。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其特征在于在膜与针对红细胞生成素的第一抗体温育后进行的清洗步骤期间，使用的至少一种溶液包含于水性介质中的有机酸。
8.权利要求7的方法，其特征在于所述溶液包含按重量计0.1到1. 5 %，优选按重量计 0. 5到1 %，更优选按重量计0. 6到0. 8%的有机酸。
9.权利要求7或8的方法，其特征在于所述有机酸是单、二或三羧酸，优选选自乙酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、抗坏血酸、己二酸或柠檬酸，特别优选乙酸。
10.权利要求1到9中任一项的方法，其特征在于使用聚(偏二氟乙烯)膜作为膜。
11.权利要求1到10中任一项的方法，其特征在于使用聚丙烯酰胺凝胶用于等电聚焦法，所述聚丙烯酰胺凝胶被施加于惰性载体箔。
12.权利要求1到11中任一项的方法，其特征在于为了调节凝胶的pH值，在等电聚焦期间使用两性电解质调节凝胶中的PH范围为pH 3到pH 6。
13.权利要求1到12中任一项的方法，其特征在于包含红细胞生成素的样品来源于在灌注反应器中生长的产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液。
14.权利要求13的方法，其特征在于在等电聚焦法之前给包含红细胞生成素的样品脱盐，如果需要的话进行浓缩。
15.权利要求1到14任一项的方法，其特征在于在发酵期间测定红细胞生成素的同种型组成。
16.用于培养上清液、特别是来自灌注反应器的培养上清液的过程中控制的方法，所述培养上清液来源于产生红细胞生成素的真核细胞的发酵，所述方法包括下列步骤a)根据权利要求1到15中任一项的方法测定红细胞生成素的同种型组成；b)测定样品中红细胞生成素的含量，优选通过ELISA进行；c)借助于步骤a)和b)中获得的数值和信息选择发酵溶液用于纯化红细胞生成素，或继续发酵。
全文摘要
本发明涉及一种测定红细胞生成素的同种型组成的方法，包括下列步骤a)在具有2.5到3.5的下限和5到8的上限的pH范围在凝胶中对包括红细胞生成素的样品进行等电聚焦，其中包括红细胞生成素的样品来源于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液；b)将凝胶中包括并分离的蛋白转移到膜；c)通过特异性抗体验证与膜结合的红细胞生成素；并且本发明涉及一种在发酵生产过程期间用于产生红细胞生成素的真核细胞的培养上清液的过程中控制的方法。
文档编号G01N33/74GK102317791SQ200980156804
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月7日 优先权日2008年12月16日
发明者D·赖歇特, F·格拉泽, F-R·孔茨, R·汉科, W·奥伊尔, W·维南德 申请人:赢创德固赛有限公司