专利名称：：一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法
技术领域：
：本发明涉及一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法。
背景技术：
：睾酮是一种重要的合成代谢雄性激素类固醇药物，属于一种兴奋剂。服用睾酮后，可提高运动员的肌肉携氧能力，可以提高运动耐力和成绩。因此，睾酮被国际奥委会和国际反兴奋剂组织明令禁止。表睾酮是睾酮的对映异构体，虽然服用表睾酮没有直接的生理作用，但是仍然可以通过改变体内"睾酮含量/表睾酮含量"的比例，从而掩蔽睾酮的服用；因此，也需要检测运动员体内睾酮和表睾酮的量从而得到"睾酮/表睾酮"含量的值，并综合结果进行判断。另外，建立适合于表睾酮滥用药物的方便、快速、特异性强和灵敏度高的方法对于研究该药物在人体内的代谢过程有重要的意义。在实际检测中，待测样品的杂质较多，影响了检测结果的准确性，需要对样品进行前处理，但现有的前处理步骤均比较繁杂，耗时耗力。
发明内容本发明的一个目的是提供一种从样品中免疫亲和萃取抗原物质的方法。本发明所提供的从样品中免疫亲和萃取抗原物质的方法，包括如下步骤1)将金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物与样品混合，进行结合反应，得到含有所述偶联物与抗原物质的结合物的溶液；所述抗体与所述抗原物质能够相互结合；2)用磁铁将所述结合物从含有所述结合物的溶液中分离出来，得到所述结合物；3)将所述抗原物质从所述结合物中洗脱下来，得到所述抗原物质。上述过程中，所述结合反应的温度为20°C-371:，具体可为25t:，所述结合反应的时间为0.5小时-1.5小时，具体可为1小时。上述过程中，所述洗脱中使用的洗脱液是甲醇；所述抗原物质为表睾酮；所述样品为尿液或离体血液。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中抗原物质的方法。本发明所提供的检测样品中抗原物质的方法，包括如下步骤1)按照上述从样品中免疫亲和萃取抗原物质的方法从待测样品中免疫亲和萃取得到抗原物质；2)对步骤1)得到的抗原物质用高效液相色谱法进行定量检测。本发明的另一个目的是提供一种金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物。本发明所提供的金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物，是抗体片段与金包裹四氧化三铁纳米颗粒偶联形成的偶联物；所述偶联是通过抗体片段中的游离巯基与金包裹四氧化三铁纳米颗粒中的金自组装实现的；所述抗体片段是抗体的重链之间的二硫键被切割还原为游离巯基后得到的抗体片段；所述抗体由重链和轻链组成。上述金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物按照包括如下步骤的方法制备将金包裹四氧化三铁纳米颗粒与含有足量抗体片段的溶液混合，反应，得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体片段的偶联物；所述反应的温度为2°C-6t:，优选为4°C;所述反应的时间为10小时-20小时，优选为15小时；所述抗体片段是按照如下方法制备的将EDTA*21120、所述抗体的溶液和巯基乙胺混合，切割还原反应，得到所述抗体片段；所述切割还原反应的温度为35°C-401:，优选为37t:，所述切割还原反应的时间为80分钟-100分钟，优选为90分钟;所述EDTA21120、所述抗体和所述巯基乙胺的配比为2mgEDTA2H20:14mg抗体llmg巯基乙胺。上述偶联物中，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的。本发明的另一个目的是提供一种制备金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物的方法。本发明所提供的制备金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物的方法，包括如下步骤将金包裹四氧化三铁纳米颗粒与含有足量抗体片段的溶液混合，反应，得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体片段的偶联物；所述抗体片段是抗体的重链之间的二硫键被切割还原为游离巯基后得到的抗体片段；所述抗体由重链和轻链组成；所述反应的温度为2°C_61:，优选为4°C;所述反应的时间为10小时-20小时，优选为15小时；所述抗体片段是按照如下方法制备的将EDTA*21120、所述抗体的溶液和巯基乙胺混合，切割还原反应，得到所述抗体片段；所述切割还原反应的温度为35°C_401:，优选为37t:，所述切割还原反应的时间为80分钟-100分钟，优选为90分钟;所述EDTA21120、所述抗体和所述巯基乙胺的配比为2mgEDTA2H20:14mg抗体llmg巯基乙胺；上述偶联物制备方法中，所述抗体是由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的。保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7也属于本发明的保护范围。由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的表睾酮的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。金包裹四氧化三铁纳米颗粒在免疫亲和萃取中的应用也属于本发明的保护范围。上述的金包裹四氧化三铁纳米颗粒是按照如下方法制备得到的将Fe304颗粒与HAuCl4溶液混合，并使Fe304颗粒均匀分散于HAuCl4溶液中，再向其中加入还原剂，反应，得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒；述？6304颗粒与金的摩尔比为2:1;所述还原剂为葡萄糖H20或葡萄糖；所述还原剂过量。所述反应的温度为85t:，所述反应的时间为l-2h。所述金包裹四氧化三铁纳米颗粒的制备方法包括如下步骤在所述反应结束后，冷却至25°C，离心，收集沉淀颗粒，即得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒。所述金包裹四氧化三铁纳米颗粒的制备方法包括如下步骤在所述收集沉淀颗粒后，用水洗涤所述沉淀颗粒至上层清液的pH值中性。本发明的免疫亲和萃取方法是以金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒与表睾酮单克隆抗体偶联物为载体，对样品中的表睾酮小分子化合物进行纯化与富集；克服其他前处理方法过程繁杂、耗时、污染环境等缺点，提高复杂体系中目标分析物的检测灵敏度。本发明中检测样品中小分子物质含量的方法，是以上述免疫亲和萃取为前处理手段，再与高效液相色谱技术联用，以测定表睾酮等小分子化合物；具体可包括如下步骤1)表睾酮单克隆抗体的制备与纯化；2)金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒的合成；3)表睾酮的单克隆抗体偶联到纳米颗粒的表面；4)使用偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对掺杂尿样中表睾酮的纯化与富集；5)运用高效液相色谱仪紫外检测器将纯化和富集得到的表睾酮化合物进行定量测定。本发明所提供的对样品进行免疫亲和萃取小分子物质的方法灵敏度高、准确度高、特异性高；实验证明，用本发明方法从尿液中萃取表睾酮，表睾酮的检出限(LOD)(至少3倍信噪比)为6ng/mL，表睾酮的定量下限(LOQ)(至少10倍信噪比)为20ng/mL;对于20mL浓度为l，O.5和0.2ng/mL表睾酮掺杂的PBS溶液，回收率结果从92%到103%，相对标准偏差(RSD)低于6%，实现了从大体积溶液中检测低浓度物质，进一步证明本发明方法的灵敏度高，能够富集低浓度样品。另外，本发明方法快速、简便、准确、有效、成本低廉、环境友好。用本发明方法对尿液中的表睾酮进行富集，经过基于金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒为载体的免疫富集过程，背景物质的干扰基本上消除，不会对表睾酮的检测带来负面影响。本发明的应用前景广阔，根据需要可以将检测范围扩展到血液样本，而且只要能够获得检测对象的抗体，就能将抗体片断偶联到金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒表面，从而制备出免疫亲和固相萃取材料，实现对检测对象化合物的纯化、富集与检测。并且还可以根据需要将离线检测方法转变为在线检测方法，进一步提高自动化的程度。图1为透射电子显微镜结果(A)Fe304纳米颗粒；(B)Fe304@Au纳米颗粒。图2为傅立叶变换红外光谱图(A)Fe304纳米颗粒；(B)Fe304@Au纳米颗粒。图3为抗体的MALDI-TOF质谱图(A)完整抗体分子的分子量质谱图；(B)抗体片段的分子量质谱图。图4为基于偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒为载体的免疫亲和固相萃取前处理方法示意图。图5为经免疫亲和固相萃取前处理方法处理前后的掺杂尿样的液相色谱图。图中6标有ET的为表睾酮化合物(Epitestosterone)。图6为表睾酮的液相色谱_电喷雾质谱图。图7为表睾酮浓度对峰面积拟合的液相色谱标准工作曲线。图8为Fe304@Au纳米颗粒的结构示意图。图9为抗体片段与Fe304@Au磁性纳米颗粒的偶联物的制备示意图。图10为用磁铁将抗体片段与Fe304@Au磁性纳米颗粒的偶联物与表睾酮结合物从溶液中分离的示意图。图11为Fe304标准物质的红外图谱。图12为表睾酮合成图。图13为表睾酮半抗原合成。图14为表睾酮完全抗原合成。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验试剂与原料表睾酮和XAD-2树脂从Sigma-Aldrich公司购买。FeNH4(S04)212H20，Fe(NH4)2(S04)26H20与氯金酸(HAuCl44H20)都从国药集团化学试剂有限公司购买(上海，中国)。曲拉通x-ioo购买自北京化学试剂公司(北京，中国)。巯基乙胺盐酸盐(纯度98%)购买自AcrosOrganics公司。色谱纯的乙腈和甲醇是从FisherScientific公司(FairLawn市，新泽西州，美国)购买。若无特别说明，在实验过程中使用的纯净水均由Milli-Q水纯化系统(Millipore公司，Molsheim市，法国)制备而成。其余未提到的试剂均是分析纯的，并且使用时无需进一步的纯化。所有试剂在进入液相色谱检测前都用0.22微米的滤膜过滤。0.01M磷酸缓冲溶液(PBS，pH7.4)的配制方法将8.0g的NaCl、2.9g的Na2HP0412H20、0.2g的KH2P04和0.2g的KC1溶解到1L去离子水后制备而成的。80mL人体尿液收集自一位27岁健康的男性志愿者，经过志愿者本人的同意。这些尿液用20gXAD-2树脂处理，在去除杂质后得到了空白尿液样本。1iig/mL表睾酮(ET)的储备液由甲醇配制并保存在_20°C的冰箱内。仪器.高效液相色谱(HPLC)分析仪购自岛津公司(东京，日本)。该仪器使用了岛津ProminenceLC-20A色谱分析系统，此系统由LC-20AT四级泵、SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20A自动进样器和DGU-20As脱气装置组成。数据采集和数据处理由岛津LCsolution软件(version1.23)完成。透射电子显微镜(TEM)购自日本JEOL公司出厂的JEM-200CX透射电子显微仪。傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)和紫外_可见光分光光度计分别由Vector22光度计(Bruker，德国)和CARYIEUV-vis分光光度计(Varian，Australia)记录。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)AutoflexIII型号仪器购自德国BrukerDaltonics公司。AvantiJ-25离心机购自美国BeckmanCoulter公司。Microcon预-100超滤膜购自Millipore公司。透析袋由华美科技有限公司提供(北京，中国)。钕铁硼强磁铁的直径是29rnm，厚度为6mm。实施例1、金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au)的制备和金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au)与抗体偶联物的制备先用共沉淀法合成前体四氧化三铁，然后用氧化还原法在四氧化三铁表面还原上一层金。—、金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au)的制备(—)制备Fe304纳米颗粒l失离子{诸备？夜4f0.0128molFeNH4(S04)212H20禾口0.0064molFe(NH4)2(S04)26H20溶解在lOOmL0.4M硫酸水溶液中得至U的；FeNH4(S04)212H20和Fe(NH4)2(S04)26H20的摩尔比为2:1。配制250mL1M的NaOH水溶液，在该溶液中均匀滴加0.1M的曲拉通X-100水溶液至曲拉通X-100在NaOH水溶液中的最终浓度为0.01M。将该溶液转移到500mL三口圆底烧瓶中，水浴中加热至85°C，同时用非磁性的机械搅拌器有力地搅拌，同时用滴管缓慢滴加完25mL的铁离子储备液，然后保持在85t:继续搅拌30分钟，此后便得到了黑色的Fe304颗粒的悬浊液。停止并撤去加热和搅拌(但要保持氮气氛围)，让Fe3(^颗粒自然沉积在容器底部。待反应溶液温度降到室温后进行离心，弃去上层清液，保留沉淀颗粒并先后用大量去离子水和无水乙醇洗涤，然后放入7(TC烘箱中烘干3小时，备用。(二)制备金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au):氯金酸的水溶液将O.412g氯金酸(HAuCl4*4H20)溶于lOOmL水中，得到Au(III)溶液。1、在lOOmL锥形瓶中将Fe304颗粒与0.01M氯金酸的水溶液混合(其中，Fe304与氯金酸的投料摩尔比为2:1)，超声15分钟以加速Fe3(^颗粒分散。2、向步骤1的体系中缓慢滴加还原剂葡萄糖0.55g(含纯葡萄糖0.5g)，在水浴(85°C)中加热1小时并伴有轻微搅拌；期间，随着？6304颗粒逐渐被金颗粒包裹，颗粒颜色由黑色变为红褐色。3、加热1小时后，停止加热，撤去水浴，自然冷却至室温；然后离心分离，得到沉淀颗粒，而上层清液是完全透明的。4、用纯净水洗涤沉淀颗粒至上层清液的pH值中性，然后在7(TC烘箱中烘干，即得到金包裹Fe304颗粒。Fe304@Au纳米颗粒的结构示意图如图8所示。(三)金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au)及Fe304纳米颗粒的验证1、透射电子显微镜(TEM):将Fe304纳米颗粒和Fe304@Au纳米颗粒先分别在水中超声波分散10分钟。然后分别取两种样本溶液滴在两个预先准备好的覆盖有碳的铜网格片上，在室温下将溶液蒸发干后再做TEM分析。TEM实验结果证明，Fe304磁性纳米颗粒的大小是13±lnm(图1A)。在合成Fe304磁性纳米颗粒的实验过程中加入了曲拉通x-ioo，使得磁性颗粒能够很好的分散在溶液中，不容易发生自身聚合。Fe304@Au磁性纳米颗粒的大小是50士5nm(图IB)。2、红外光谱表征傅立叶变换红外光谱表征用溴化钾压片的方法做的红外检测，属于中红外范围。Fe304和Fe304@Au磁性纳米颗粒用傅立叶变换红外光谱表征图谱如图2所示，A表示？6304纳米颗粒的红外谱图，B表示Fe30^Au纳米颗粒的红外谱图。红外光谱图结果显示，随着金在四氧化三铁表面的包裹，Fe-O键的伸縮振动频率从579cm—1迁移到586cm—、在636cm—1和586cm—1处新出现的红外峰表明Fe304纳米颗粒已经成功地被金包裹。Fe304标准物质(美国Sigma-Aldrich公司)的傅立叶变换红外光谱表征图谱如图ll所示，表明本发明得到的FeA颗粒是正确的。将图2A与FeA的标准物质谱图相比，不同之处主要是在峰的强度上有所差异以及峰的波数不能完全吻合。前者主要的原因是在测定红外数据的操作过程中，加入Fe304颗粒的量无法完全一致，所以在峰强度上出现差异。后者是因为每次测定的谱图结果，在波数的数值上很难做到完全相同，仪器本身的误差在10%。？6304颗粒标准物质的谱图里，三个峰都与图2A的对映峰都比较接近，是仪器本身存在的误差所致，所以两个谱图的结果能够对映，即提供的标准谱图能够证明实验合成的就是Fe^颗粒。在Fe30,Au磁性纳米颗粒中残留的Fe304颗粒由于表面没有金的包裹，因而不会影响抗体片断在Fe30^Au磁性纳米颗粒表面的偶联。因为抗体片段在颗粒上的偶联需要有金表面的支持，没有金的Fe304颗粒自然无法将抗体片段固定在其表面上，所以Fe3(^颗粒不会吸附抗体片段，即非特异性吸附很弱。二、Fe304@Au磁性纳米颗粒与抗体的偶联物及其制备1、表睾酮单克隆抗体的制备(1)表睾酮的合成如图12所示表睾酮苯甲酸酯的合成将2.9g睾酮、5.2g三苯基磷和2.4g苯甲酸溶于100mL苯中，作为A液。4.Og偶氮二甲酸二异丙脂溶于20mL苯中，并在搅拌下缓慢加入A液中，室温搅拌反应24小时。将反应液置于通风橱内过夜挥干溶剂苯，得到黄色粘稠状产物约20mL。以石油醚乙酸乙酯=17:5作为洗脱剂，硅胶柱纯化产物。目标产物比移值Rf=0.5，同时在其上下各少量存在一个杂质点。表睾酮的合成向3.Og表睾酮苯甲酸酯中加入1.5g的NaOH和25mL的甲醇，室温搅拌过夜。薄层色谱显示原料点减小，产物表睾酮点出现。向反应体系中加入水，用乙酸乙酯萃取4次。有机层用无水硫酸钠干燥过夜。滤去干燥剂并旋蒸去除大部分溶剂，有黄色固体析出。乙酸乙酯重结晶得到浅黄色固体，红外灯下烘干产物，得到l.lg表睾酮。薄层色谱显示产物纯度很高。(2)表睾酮全抗原的合成ET-3-半抗原的合成如图13所示，将0.2g表睾酮和0.2g盐酸羧甲基羟胺置于40mL乙醇中，加入5%NaOH4mL，ll(TC加热回流15小时。薄层色谱显示几乎无表睾酮剩余(乙酸乙酯为展开剂)。减压旋蒸去除大部分乙醇，加入5mL水，用乙醚萃取三次，除去未反应的原料表睾酮和杂质。向水相中加入1MHC1至酸性，此时有大量白色沉淀生成。加乙醚溶解沉淀，萃取三次。醚层用水萃取洗涤三次至中性。向醚层中加无水硫酸钠干燥8小时。滤去干燥剂，旋蒸去除大部分溶剂乙醚，得到黄色油状物140mg(产率二56%)。表睾酮3位全抗原(ET-3-BSA)的合成如图14所示，将34mgET-3-半抗原、14mgNHS和23mgEDC共溶于2.3mLDMSO中，常温下搅拌2小时，作为A液。将0.1M的NaHC03用1MHC1调至pH=7.0。161mg的BSA溶于10mL上述溶液中作为B液，将A液搅拌着加入B液中。室温下缓慢搅拌反应2小时，搅拌中尽量避免尽量气泡产生(n(ET-3-h即ten):n(NHS):n(EDC):n(Protein)=40:50:50:1)。反应完的溶液装入透析袋，依次用PBS9透析24小时，去离子水透析48小时。冻干后于_201:下保存。(3)单克隆抗体的制备杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括免疫动物(对Balb/c小鼠的免疫)，细胞融合，杂交瘤细胞的选择培养，阳性细胞的筛选，杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量制备几个步骤。(3).1免疫动物用高压灭菌的生理盐水(0.9%)溶解ET-3-BSA，配成浓度为280iig/mL的溶液。与等量的福氏完全佐剂充分乳化成油包水的乳浊液，注入5只Balb/c小鼠腹腔内，每只0.5mL(70yg)。第14天进行第二次免疫，将全抗浓度减半，用140yg/mL的ET-3-BSA生理盐水溶液与等量福氏不完全佐剂乳化，在脊柱两侧对小鼠进行皮下多点注射，每只0.4mL(28yg)。第24天进行第三次免疫。试剂及用量与第二次相同，注射部位为四肢上方的皮下。10天后取小鼠尾血，离心、取上清用ELISA测效价(包被抗原ET-3-BSA5iig/mL)，5只小鼠血清效价均在4以上，待用。整个免疫期间，小鼠生长健康。(3).2细胞融合饲养细胞的铺制最常使用的饲养细胞是小鼠腹腔细胞。它能释放出一种非种属特异性生长因子，促进细胞生长；此外，其中的巨噬细胞还有清除死亡细胞的作用。在融合的前两天，进行饲养细胞的铺制。取昆明鼠一只，颈椎脱位处死后，浸泡于75%酒精中15分钟对其皮毛进行消毒。将小鼠置于培养皿上，腹部朝上，用无菌剪刀在其腹部剪一小口，剥离腹部皮肤，暴露腹膜，75%酒精消毒腹膜，晾干。用灭菌的滴管向腹膜内注入匿EM完全培养基约5mL，用针柄轻柔腹部，培养基颜色由粉红变成桔黄色，吸出并置于50mL离心管中，反复几次至培养基不变色。1000rpm离心5分钟，弃去上清，将细胞沉淀悬于40mLHAT培养液中，混匀后滴加至4块96孔培养板中，每孔100i！L，37°CC02培养箱中培养待用。骨髓瘤细胞悬液的制备(1)骨髓瘤细胞的复苏和培养从液氮罐中(-19(TC)取出一安培瓶冷冻的骨髓瘤细胞，立即放入3『C水浴中并不断搅动以防止细胞内的水分结晶而伤害细胞。溶化后逐滴加入完全培养基约3mL，1000rpm离心5分钟，彻底弃去上清液(内含匿SO)，加入约2mL完全培养基，将细胞吹起，转移至培养瓶中，加入10%DMEM完全培养基至5mL左右，置于37t:(A培养箱中培养。骨髓瘤细胞在含10%小牛血清的完全培养液中培养，当培养基颜色发生明显变化时换液(1-2天)。当细胞处于对数生长中期，铺满瓶底时按l:3稀释传代(2-4天传一代)。融合前48小时传代，融合当天选取生长旺盛、浑圆透亮、形态良好的对数期细胞4-6瓶，其它冻存。(2)骨髓瘤细胞悬液的制备在细胞融合当天将处于对数生长期的Sp2/0细胞吹下，置于50mL离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，用不完全培养基清洗两次，最后将细胞悬于40mL不完全培养基中。细胞计数为107个数量级。免疫脾细胞悬液的制备(1)脾脏加强免疫融合前三天，选取两只免疫的Balb/c小鼠进行脾脏加强免疫。将浓度为150iig/mL的ET-3-BSA生理盐水溶液不经乳化直接注入小鼠腹腔内，每只0.2mL(30iig)。(2)免疫脾细胞悬液的制备融合当天，取脾脏加强免疫的两只小鼠，取其眼血(各lmL左右)。离心后的上清分装、冻存，作为阳性对照。处死小鼠，在超净台中消毒并剖开腹部，小心取出已肿大的脾脏，置于无菌培养皿内的不锈钢网上，立即加入不完全培养基。将脾脏剪碎并用针柄碾压，使脾细胞经过网孔滤入培养皿中，提取液置于50mL离心管中。离心，洗涤2次后悬于40mL不完全培养基中。细胞计数为10810个数量级。细胞融合将1(f个Sp2/0细胞和1()8个脾细胞混合于50mL离心管中，加入不完全培养基至40mL。轻轻搅匀后，1000rpm离心5分钟，弃上清，用手指弹击管底，使两种细胞混匀成糊状。将离心管置于37t:已灭菌的水中。向装有0.4mL聚乙二1500(PEG1500)的已灭菌的离心管中加入等量不完全培养基，不断抽吸使液体达到粉红色。用吸管吸取50%的PEG1500溶液，插入离心管底部。左手慢慢旋管，右手轻轻搅动细胞沉淀，同时缓慢滴加PEG1500，1分钟内加完，水浴中静置1.5分钟进行融合。静置完毕后，立即加入5mL不完全培养基，使PEG1500稀释而停止作用，滴加方法为前1分钟加入lmL，后1分钟加完剩下的4mL。补加不完全培养基20mL，300rpm离心3分钟，弃上清。加入HAT培养液轻轻搅动，使细胞悬浮。补加HAT至40mL，混匀，滴加到铺有饲养细胞的4块96孔培养板中，每孔100yL，以HAT为培养液，37°CC02培养箱中培养。(3).3杂交瘤细胞的选择培养免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞经PEG1500处理后，形成多种细胞的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和脾细胞，骨髓瘤细胞自身融合的共核体，脾细胞自身融合的共核体以及骨髓瘤细胞和脾细胞融合的异核体。每2-3天换一半HAT培养液，几天后骨髓瘤细胞和脾细胞陆续死亡，而融合的杂交瘤细胞成簇的生长，形成小的细胞集落。此时，换成HT培养基培养至两星期左右，可观察到明显的集落，这时吸取培养基进行特异性抗体检测，以确定含有分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。阳性细胞的筛选在融合细胞培养至两周左右时，选择细胞集落明显、培养基颜色变化大的孔用ELISA法进行阳性测试。测试时吸取100i!L培养基作为待测物检测。对于首次测得的阳性孔，隔天吸取上层培养基检测，三次测定阳性稳定后最终确定阳性细胞。ELISA过程如下(1)用CBS配制浓度为10iig/mL的ET-3-BSA包被液，每孔100yL，4。C放置15小时。弃去包被液，用PBST洗涤3次，每孔200iiL，每次放置3分钟，甩去，拍干。(2)用1%的明胶溶液封闭，每孔200iiL，37t:下温育2小时。弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每孔200iiL，每次放置3分钟，甩去，拍干。(3)加入100iiL待测培养基，并用稀释100倍的兔血清作为阴性对照，免疫小鼠的眼血作为阳性对照，37t:温育1小时。弃去培养基反应液，用PBST洗涤3次，每孔200iiL，每次放置3分钟，甩去，拍干。(4)加入5000倍稀释的标记二抗，每孔100iiL，37t:下温育1小时。弃去二抗溶液，用PBST洗涤3次，去离子水洗涤2次，每孔200iiL，每次放置3分钟，甩去，拍干。(5)加入底物溶液，每孔100iiL，闭光显色15分钟。加入2M硫酸终止显色。酶标仪上450nm读数。杂交瘤细胞的克隆化选择阳性稳定三次以上的单克隆5株进行扩大培养。一孔扩至一排，最终保留两株单克隆1E5、3D7以及几株多克隆细胞。经检验1E5和3D7所有孔全部为阳性，进一步证明是单克隆。当一排细胞长至对数期，铺满孔底时转至铺有饲养细胞的瓶中扩大培养。培养基逐步由HT换为含20%血清的培养基。(3).4杂交瘤细胞的冻存在培养瓶中分别培养两株单克隆和多克隆细胞，培养基血清含量缓慢由20%降至17.5%，最后降至15%。分批冻存于液氮中。方法如下(l)弃去并吸干培养基，用少量不完全培养基轻轻洗去漂浮的死细胞，弃去；(2)加入3mL左右不完全培养基，用弯头滴管将细胞完全吹下；(3)将含有细胞的不完全培养基转移至7mL离心管中，胶布封口，1000rpm以下离心3-5分钟，弃去培养基；(4)沉淀中加入1.8mL冻存液，反复吹吸溶解后，转至安培瓶中。(5)安培瓶外包上棉花，置于-7(TC冻存；(6)过夜后取出，冻存于-19(TC液氮中。该分泌抗表睾酮的单克隆抗体的杂交瘤细胞株ET-3D7已于2010年1月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.3592，分类命名为鼠源杂交瘤细胞株，细胞株名称为ET-3D7。(3).5单克隆抗体的大量制备抗表睾酮的单克隆抗体的制备方法将已经建立的杂交瘤细胞CGMCCNo.3592置于细胞培养基中，置于37t:和5%C02孵箱中培养，每隔2d换一次细胞培养液，待细胞浓度大于105mg/ml时停止换液，持续培养到细胞全部死亡。收集培养上清，1500rpm，离心10分钟，上清含有高水平的单克隆抗体，-2(TC保存备用。所述细胞培养基为向DMEM培养基中添加胎牛血清，使胎牛血清在细胞培养基中的终浓度为15-20%(体积百分含量)，所述细胞培养基的pH为7.4。还可以按照如下方法制备在抗体大量制备前几天，向健康Balb/c小鼠腹腔中注入石蜡油。将一定数量的单克隆细胞用无菌PBS溶液吹下，1000rpm以下离心3_5分钟，细胞沉淀溶解于0.5mLPBS中，注入小鼠腹腔内。单克隆细胞注入小鼠7-10天后，小鼠腹部可见明显胀大，取其腹水。具体方法如下用左手固定小鼠，用75%酒精消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支试管，将灭菌的16号注射针头剌入小鼠下腹部，让腹水滴入试管内，当腹水停滴时，轻轻移动针头，并轻柔其腹部，使腹水继续滴出。一次可得到约l-3mL腹水。1000rpm离心5分钟，吸取上层透明清液，冻于_20°C2、制备Half-IgG抗体片段抗体为表睾酮的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的。用方法I将抗体分子切割还原将2mg的EDTA2H20固体加入含有14mg抗体的PBS缓冲溶液中，再向缓冲溶液中加入11mg巯基乙胺固体，在37t:下反应90分钟；然后，将反应混合物在4t:下对0.01MPBS缓冲溶液(pH7.4)透析15小时；最后，未反应完全的完整抗体分子用MicroconYM-100超滤去除，得到抗体片段溶液(溶质是抗体片段，溶剂是PBS缓冲溶液)。完整抗体分子和抗体片段(half-IgG)的分子量由MALDI-TOF质谱仪测定(图3)。图3表明，质谱的结果显示，完整的抗体分子和抗体片断的分子量分别是147798±443g/mol和73816±221g/mol。利用如下方法II和方法III将抗体分子切割还原，结果与方法I无显著差异。方法II:除反应温度为35t:、反应时间为100分钟外，其余均与方法I相同。方法III:除反应温度为4(TC、反应时间为80分钟外，其余均与方法I相同。3、制备抗体片段与Fe304@Au磁性纳米颗粒的偶联物偶联物的制备如图9所示。方法I:将金包裹四氧化三铁纳米颗粒(Fe304@Au)加入含有足量表睾酮单克隆抗体片段的PBS缓冲溶液中，在4t:冰箱中轻微搅拌过夜(15小时)；反应结束后，使用磁铁将磁性颗粒从溶液中分离出来；根据反应前后上清液的紫外吸光度结果，得出约lmg的抗体片段偶联到10mg的Fe304@Au颗粒上。反应前上清液为PBS溶液，不含抗体；反应后上清液为含有抗体的PBS溶液，可以用紫外可见分光光度仪测定抗体的浓度；传统的S印harose4B载体材料的抗体偶联效率lgS印harose4B凝胶膨胀后体积约有3.5mL，每mL可偶联约5_10mg抗体。若以8mg抗体计算，故lg凝胶约需要3.5X8=28mg抗体，即10mg凝胶能偶联0.28mg抗体。本发明中，10mgFe304@Au颗粒能够偶联lmg抗体，是传统方法的lmg/O.28mg=3.57倍，所以比传统的S印harose4B载体材料的抗体偶联效率高了3倍以上。表明，本发明的以金包裹四氧化三铁磁性颗粒为载体的免疫亲和富集材料的抗体偶联效率要优于传统的S印harose4B载体材料的抗体偶联效率。抗体片断在金表面的偶联是通过抗体片断上的巯基与金作用实现的。抗体分子重链之间的二硫键被巯基乙胺切割还原后得到抗体片段，并暴露出游离的巯基基团，得到带游离巯基的抗体片断，然后通过游离巯基的自组装反应，抗体片断能够稳固定向地偶联到金包裹四氧化三铁纳米颗粒表面。抗体片断在富集材料上的偶联不仅不会损失抗体的免疫活性，而且还能进一步提高抗体在富集材料上的偶联密度，从而提高抗体的偶联率。因为偶联的抗体是抗体的片段，只有完整抗体的1/2，那么在单位材料上偶联的抗体数目为完整抗体的两倍。利用如下方法II和方法III制备金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物，结果与方法I无显著差异。方法II:除反应温度为2t:、反应时间为20小时外，其余均与方法I相同。方法III:除反应温度为6t:、反应时间为10小时外，其余均与方法I相同。实施例2、用Fe304@Au磁性纳米颗粒从样品溶液中萃取表睾酮并检测表睾酮含量(—)标准曲线的制备1、标准品溶液的制备向PBS缓冲液中添加表睾酮，使表睾酮在PBS缓冲液中的浓度分别为20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，即得到各浓度的标准品溶液。2、从标准品溶液中萃取表睾酮萃取过程的示意图如图4所示。将表睾酮抗体片段与金包裹四氧化三铁纳米颗粒的偶联物加入到各标准品溶液中(偶联物的量为10mg，标准品溶液的量为lmL)，在室温(25°C)下结合反应1小时，得到偶联物与抗体片段的结合物；用磁铁将结合物从溶液中分离出来(将磁铁置于容器的一侧，结合物在磁铁的作用下吸附在靠近磁铁的容器壁上，如图10所示)，将瓶子里的上清液倒掉，剩余吸在瓶壁上的结合物；用水洗涤回收结合物3次，之后再用甲醇将表睾酮从结合物上洗脱下来(甲醇通过改变抗原和抗体之间的溶液环境，将抗原从抗体上洗脱下来。用高纯氮气吹干含有表睾酮的甲醇洗脱液，再在室温下重新用液相色谱的流动相定容至lmL，待进行高效液相色谱分析检测。上述过程中，在磁铁和Fe304@Au纳米颗粒的相互作用下，结合物(Fe304@Au纳米颗粒与抗体片段的偶联物与表睾酮形成的结合物)很容易从溶液中分离出来，因此这种Fe304@Au纳米颗粒载体材料能够满足免疫亲和固相萃取的需要。Fe304@Au磁性纳米颗粒至少能够重复使用IO次以上。3、高效液相色谱的方法检测萃取样品中的表睾酮的量色谱柱:C18反相色谱柱(Gemini公司)，Phenomenex牌，柱长250mm，内径4.6mm，柱填料为d8填料，柱填料粒径为5ym，110A孔径。配有一个Q的预柱(预柱的柱长为4mm，内径为3.0mm)。柱温25。C;自动进样器进样，进样量201;洗脱液(流动相)为乙腈与乙酸水溶液的等体积混合物；乙酸水溶液中乙酸与水的体积比为1:1000。流速为lml/min;检测器为紫外检测器，检测波长244nm;高效液相色谱的分离在室温下进行。每份溶液平行测定3次。记录每份溶液对应的表睾酮的峰面积值。表睾酮标准品为表睾酮(纯品，淡黄色固体颗粒)，购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录上的编号是E5878-100MG。4、标准曲线标准工作曲线是通过表睾酮的液相色谱峰面积与其对应浓度之间的线性关系拟合而得。标准工作曲线的横坐标为标准品溶液中表睾酮的浓度值，纵坐标为高效液相色谱检测的峰面积值。标准曲线如图7所示。标准工作曲线的线性回归方程为Y=53.2XX+837。用如下两种方法从标准品溶液中萃取表睾酮，其余均与上述相同，结果得到的标准曲线无显著差异。方法II:从标准品溶液中萃取表睾酮的步骤中，除结合反应的温度为2(TC，时间为1.5小时外，其余均与实验2中所述相同。方法III:从标准品溶液中萃取表睾酮的步骤中，除结合反应的温度为37t:，时间为0.5小时外，其余均与实验2中所述相同。用甲醇进行洗脱，目的是将抗原_抗体复合物解离，以获得抗原的溶液。对洗脱剂的要求是非盐类物质、不能对抗体有强杀伤性、挥发性强而且不会对液相色谱的色谱柱有害的物质。经实验证明，甲醇的洗脱效果好。(二)对添加表睾酮的尿液的检测1、添加表睾酮的尿液的制备lg/mL的表睾酮甲醇储备液将表睾酮溶于甲醇中，浓度为lg/mL。用不含表睾酮的尿液分别稀释lyg/mL的表睾酮甲醇储备液，至表睾酮的浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，得到不同浓度的掺杂尿液样本。142、从添加表睾酮的尿液中萃取表睾酮方法与实验(一)中所述相同。3、高效液相色谱的方法检测萃取样品中的表睾酮的量方法与实验(一)中所述相同。4、根据标准曲线得到萃取物中表睾酮的量表睾酮的浓度是将检测得到的峰面积数值代入标准工作曲线的线性回归方程得出的。实验组1:表睾酮浓度为50ng/mL的表睾酮掺杂尿液样本，按照上述步骤1_4的方法进行检测。实验组2:表睾酮浓度为100ng/mL的表睾酮掺杂尿液样本，按照上述步骤1_4的方法进行检测。实验组3:表睾酮浓度为200ng/mL的表睾酮掺杂尿液样本，按照上述步骤1_4的方法进行检测。对照组1:表睾酮浓度为100ng/mL的表睾酮掺杂尿液样本，不经过任何前处理，直接进行高效液相色谱分析(即直接进行上述步骤3和4)。对照组2(空白对照组)表睾酮浓度为100ng/mL的表睾酮掺杂尿液样本，经未偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒免疫萃取处理后，进行高效液相色谱分析。实验设3次重复，结果取平均数±标准差。结果如表1和图5所示。图5中，(a)对照组1的液相色谱图；(b)实验组2的液相色谱图；(c)对照组2的液相色谱图。对照组1的结果液相色谱图的背景信号很高，这是由尿液中的杂质引起的。表明，如果不进任何前处理步骤，直接测定掺杂尿液中的表睾酮分子是很困难的。实验组2的结果液相色谱图的背景干扰信号被消除，表明，用偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对待测尿液样本进行免疫富集前处理，表睾酮分子被特异性富集。对照组2的结果使用未偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对掺杂尿液做前处理，未检测到表睾酮。表明表睾酮分子没有被特异性的富集。同时，上述实验还证明，没有偶联抗体的Fe304@Au纳米颗粒对表睾酮没有非特异性吸附，不会对表睾酮的定量分析造成干扰。实验还证明，偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对掺杂尿液中表睾酮的免疫富集的特异性很高。表1.以金包裹四氧化三铁磁性颗粒为载体的免疫亲和萃取实验对表睾酮掺杂尿液的回收率测定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>将实验组2收集的表睾酮洗脱峰进行液相色谱_电喷雾质谱(LC-ESI-MS)分析。质谱仪器使用BrukerEsquire-LC离子阱检测器(购自Billerica市，马里兰州，美国)的正离子模式。40psi的高纯氮气作为雾化气。电喷雾源的具体条件如下毛细管电压为-4000V;末端盘电压为-3500V;毛细管出口电压为104V;氮气干燥气的温度设在30(TC，流速设在每分钟12.0L。流动相为乙腈与乙酸水溶液的等体积混合物；乙酸水溶液中乙酸与水的体积比为l:1000。实验设3次重复，结果一致。结果如图6所示。质谱的结果显示，由于在流动相中加入乙酸进行酸化，因此在正离子模式下，表睾酮的分子离子峰[M+H]+的质荷比m/z为289，而表睾酮的钠离子加成的质谱峰[M+Na]+的质荷比m/z为311，但前者的峰强度高于后者。上述高效液相色谱实验和质谱实验表明偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对掺杂尿液免疫富集得到的物质就是表睾酮。因此，基于金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法是很有潜力的样品前处理方法。(三)对添加表睾酮的PBS缓冲液的检测为了考察磁性颗粒的富集性能，进行如下实验。1、添加表睾酮的PBS缓冲液的制备向PBS缓冲液中添加表睾酮，使表睾酮在PBS缓冲液中的浓度分别为lng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL，即得到添加表睾酮的PBS缓冲液。2、从添加表睾酮的PBS缓冲液中萃取表睾酮方法与实验(一)中所述相同，不同的是偶联有表睾酮抗体片段的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒的量为lOmg，添加表睾酮的PBS缓冲液的量为20mL。3、高效液相色谱的方法检测萃取样品中的表睾酮的量方法与实验(一)中所述相同，不同的是，在氮气吹干后，用流动相溶液定容到0.2mL后进入高效液相色谱测定。4、根据标准曲线得到萃取物中表睾酮的量表睾酮的浓度是将检测得到的峰面积数值代入标准工作曲线的线性回归方程得出的。实验设3次重复，结果取平均值±标准差。结果如表2所示。表2.以金包裹四氧化三铁磁性颗粒为载体的免疫亲和萃取实验对大体积低浓度的富集的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如图7所示，液相色谱的标准工作曲线的线性回归系数R2为0.995，定量范围在20-200ng/mL之间，而且精确性好(因为标准曲线上每个浓度点的峰面积相对标准偏差均低于1.5%，偏差极低，精确度很好)。表睾酮的检出限(L0D)(至少3倍信噪比)为6ng/mL。表睾酮的定量下限(LOQ)(至少10倍信噪比)为20ng/mL。50，100和200ng/mL表睾酮掺杂尿液的回收率为92%至109%(见表l)。此外，使用偶联有表睾酮的单克隆抗体的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对大体积、低浓度(低于6ng/mL)的表睾酮PBS溶液进行免疫亲和萃取实验，富集的对象是20mL浓度为l，O.5和0.2ng/mL表睾酮掺杂的PBS溶液，实验结果见表2，回收率结果从92%到103%，相对标准偏差(RSD)低于6%。表3结果表明，经过免疫富集萃取前处理步骤，表睾酮的检出限可以提高100倍，即提高两个数量级。综上结果表明，本发明的用偶联有表睾酮抗体片段的金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒对待测样品进行免疫亲和萃取的方法能够富集低浓度样品。以紫外检测器为例，用它检测表睾酮的检出限LOD为6ng/mL，但使用了有100倍富集效果的磁性颗粒，LOD可降低100倍至0.06ng/mL，说明该方法的富集效率高，提高了检测灵敏度，表3就说明了这个结论。表3.使用免疫富集前处理方法前后的定量下限和检出限的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>权利要求一种从样品中免疫亲和萃取抗原物质的方法，包括如下步骤1)将权利要求5-7中任一所述偶联物与样品混合，进行结合反应，得到含有所述偶联物与抗原物质的结合物的溶液；所述抗体与所述抗原物质能够相互结合；2)用磁铁将所述结合物从含有所述结合物的溶液中分离出来，得到所述结合物；3)将所述抗原物质从所述结合物中洗脱下来，得到所述抗原物质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述结合反应的温度为20°C_371:，优选为25t:，所述结合反应的时间为0.5小时-l.5小时，优选为1小时。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述洗脱中使用的洗脱液是甲醇；所述抗原物质为表睾酮；所述样品为尿液或离体血液。4.一种检测样品中抗原物质的方法，包括如下步骤1)按照权利要求1-3中任一所述方法从待测样品中免疫亲和萃取得到抗原物质；2)对步骤1)得到的抗原物质用高效液相色谱法进行定量检测。5.金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物，是抗体片段与金包裹四氧化三铁纳米颗粒偶联形成的偶联物；所述偶联是通过抗体片段中的游离巯基与金包裹四氧化三铁纳米颗粒中的金自组装实现的；所述抗体片段是抗体的重链之间的二硫键被切割还原为游离巯基后得到的抗体片段；所述抗体由重链和轻链组成。6.根据权利要求5所述的偶联物，其特征在于所述金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物按照包括如下步骤的方法制备将金包裹四氧化三铁纳米颗粒与含有足量抗体片段的溶液混合，反应，得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体片段的偶联物；所述反应的温度为2°C_61:，优选为4°C;所述反应的时间为10小时-20小时，优选为15小时;所述抗体片段是按照如下方法制备的将EDTA21120、所述抗体的溶液和巯基乙胺混合，切割还原反应，得到所述抗体片段；所述切割还原反应的温度为35°C_401:，优选为37t:，所述切割还原反应的时间为80分钟-100分钟，优选为90分钟;所述EDTA'2H20、所述抗体和所述巯基乙胺的配比为2mgEDTA'2H20:14mg抗体llmg巯基乙胺。7.根据权利要求5或6所述的偶联物，其特征在于所述抗体是由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的。8.—种制备金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体的偶联物的方法，包括如下步骤将金包裹四氧化三铁纳米颗粒与含有足量抗体片段的溶液混合，反应，得到金包裹四氧化三铁纳米颗粒与抗体片段的偶联物；所述抗体片段是抗体的重链之间的二硫键被切割还原为游离巯基后得到的抗体片段；所述抗体由重链和轻链组成；所述反应的温度为2°C_61:，优选为4°C;所述反应的时间为10小时-20小时，优选为15小时;所述抗体片段是按照如下方法制备的将EDTA2&0、所述抗体的溶液和巯基乙胺混合，切割还原反应，得到所述抗体片段；所述切割还原反应的温度为35°C_401:，优选为37t:，所述切割还原反应的时间为80分钟-100分钟，优选为90分钟;所述EDTA'2H20、所述抗体和所述巯基乙胺的配比为2mgEDTA'2H20:14mg抗体llmg巯基乙胺；9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述抗体是由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的。10.保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7;和由保藏编号为CGMCCNo.3592的鼠源杂交瘤细胞株ET-3D7分泌得到的表睾酮的单克隆抗体。11.金包裹四氧化三铁纳米颗粒在免疫亲和萃取中的应用。全文摘要本发明公开了一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法。该方法包括如下步骤1)将偶联物与样品混合，进行结合反应，得到含有所述偶联物与抗原物质的结合物的溶液；所述抗体与所述抗原物质能够相互结合；2)用磁铁将所述结合物从含有所述结合物的溶液中分离出来，得到所述结合物；3)将所述抗原物质从所述结合物中洗脱下来，得到所述抗原物质。本发明的应用前景广阔，根据需要可以将检测范围扩展到血液样本，而且只要能够获得检测对象的抗体，就能将抗体片段偶联到金包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒表面，从而制备出免疫亲和固相萃取材料，实现对检测对象化合物的纯化、富集与检测。并且还可以根据需要将离线检测方法转变为在线检测方法，进一步提高自动化的程度。文档编号G01N33/64GK101776691SQ20101011074公开日2010年7月14日申请日期2010年2月9日优先权日2010年2月9日发明者崔毅然,张新祥,邱爽,陈泓序申请人:北京大学