专利名称：Brca基因突变的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种肿瘤用药选择和遗传易感性相关 的BRCA基因突变的快速检测。
背景技术：
人类乳腺癌易感基因(BRCA1/2)首先在乳腺癌家族中发现的，为具有遗传倾向的 乳腺癌和卵巢癌的易感基因。BRCAl定位于人类17号染色体q21.以常染色体显性遗传方 式遗传.并有很高的外显率，BRCAl长约IOOkb.含24个外显子。其基因产物是1863个氨 基酸所构成的磷酸化蛋白质。BRCA2定位于13号染色体ql2.全基因组DNA长约70kb.其 中编码区含有10987bp.且富含AT f约64% 1，其基因序列与BRCAl无明显关系。BRCA2由 27个外显子组成.其中第11个外显子长约4932bpmRNA长约10. 2kb.编码的BRCA2蛋白含 3418个氨基酸。BRCAI/2基因结构与功能的异常与乳腺癌及卵巢癌的发生密切相关，其作 为一种抑癌基因，不仅能抑制细胞生长，还参与细胞周期调控，基因转录调节，DNA损伤修复 以及凋亡等多种重要细胞活动，在维持基因组稳定性中起重要作用。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，可分为散发性和遗传性两类，其中遗传性乳 癌约占乳癌发病率的5% 10%。乳癌易感基因-I(BRCA-I)是近年来发现的一种重要的 肿瘤抑制基因。它的丢失或突变在家族性乳腺癌发生中起一定作用，该类基因编码的蛋白 在细胞转录调节和DNA修复中起着多种特殊的作用。可诱导凋亡并抑制雌激素依赖型转录 通路，该通路与乳腺上皮细胞增生有关，基因突变削弱了这些功能，而增加乳腺癌发病的危 险度。BRCAl基因的突变使其患乳腺癌的危险性比一般人群高8 10倍。在遗传性乳腺 癌家族中，BRCAl基因的突变率达40% 50%。而在遗传性乳腺癌并卵巢癌家族中，BRCAl 基因的突变几乎为100%。又有相关文献报道70%非BRCAl基因突变所致的遗传性乳腺癌 是由BRCA2基因突变引起的。对BRCA基因进行检测，寻找其致病突变位点，可帮助筛选出 高危人群，有助于风险评估和早期诊断；同时也可为未来的高危人群基因筛查和基因诊断 提供基本突变谱资料。正是由于BRCA1/2基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所 以检测BRCA1/2的突变基因对诊断和及早治疗癌症有很大的临床意义。本发明主要是利用 HRM技术来进行BRCA1/2突变基因的检测，HRM技术是近年来国内外兴起的一种全新的突变 扫描和基因分型的分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局 限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接对PCR产物进行溶解分析，即可完成对样品突 变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。对于在血浆和血清中DNA含量很低 的情况下，使用该方法仍可以用该方法进行BRCA1/2基因突变的检测，突破了微量无法检 测或检测效率低的障碍。本试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测BRCA突变，协助临床医生实现肿 瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。目前普遍应用的BRCA基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP
4法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在 以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳 性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序该方法存在以下缺点检 测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度 较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据， 需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便、设备要求低的BRCA基因突变检测 技术，来改变现状，以满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便、和有效避免污染的检测BRCA基 因突变的试剂盒，解决了现有技术中进行BRCA基因突变检测程序繁琐、费用昂贵或、费时、 精确度低和污染等问题。本发明提供的技术方案是一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异 性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCAl基因的第2外显子或 BRCAl基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的 连续核苷酸序列，所述BRCAl基因的第2外显子具有SEQ ID No :1的连续核苷酸序列；所 述BRCAl基因的第20外显子具有SEQ ID No 2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第21外 显子具有SEQ ID No 3的连续核苷酸序列。优选的，所述连续核苷酸序列为SEQ ID No :4 21序列之一的正向核苷酸序列或 反向核苷酸序列。优选的，所述引物为SEQ ID No 4 21序列之一的正向引物或反向引物。优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TqqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 IOX ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 1 0. 5 μ M
模板DNA0. 1 1. 5ng/ μ L ；
TaqDNA聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；
MgCl2终浓度为1 3mM ；
荧光染料1 3X。
优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为
PCR缓冲液终浓度1 5X ；
dNTPs0. 2 0. 3mM ；
引物序列终浓度为0. 2 0. 3M ；
模板DNA0. 5 1. Ong/ μ L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 03 0. 06U/ μ L ；
MgCl2终浓度为2 3mM ；
5
荧光染料 1 2X。优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染 料、SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的 混合液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. O 间。本发明的另一目的在于提供一种检测BRCA基因外显子位点突变的方法，其特征 在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有BRCA基因的第二外显子BRCA2或第三外显子BRCA3中至 少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRCA基因进行PCR 扩增；(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRCA基因进行突变位点检测。优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔 道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上 扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶解曲线法的条件为92 97°C 变性Imin ；40°C复性Imin ；然后初始溶解温度60°C开始程序升温溶解至95°C，并在溶解过 程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。本发明的又一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的BRCA基因突 变检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和 肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。本发明的BRCA基因序列如SEQ No. 22，突变发生在BRCAl外显子2、BRCA1外显子 20、BRCA2外显子11上，所述的突变具体体现在
BRCA 基 因突变类型突变位点核苷酸BRCAl拼接点突 变IVS17-1G > T IVS21+1G > C IVSllt3A > G 300T > GBRCAl移码突变185delAG IlOOdelAT 5640delA 1675delA 3347delAG 2594delC 3828delT 2804delAA 2953del3tCBRCAl插入/缺 失5382insC 1135insA 3171insC 3768insA exl3ins6kbBRCA2移码突变6174delT 995delG 3604delTT 6601delA 1538del4 6503delTT 8765delAG 3398del5 5802delAATTBRCA2插入/缺 失9326insA 5579insA 2816insA所述的试剂盒，包括PCR引物、阴性对照DNA、PCR反应体系和反应条件。所述的 PCR引物，用化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端10-50个序列的模板，以及与之配对 的反向序列。所述的PCR引物优选为下表所示的引物对 最为优选的，下表所示的引物对 所述的阴性对照DNA，用常规方法从正常人组织中提取获得DNA。所述的正常人组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及用这些组织 制成的石蜡块、石蜡切片。所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合液、荧光染料、 MgCl2, Taq酶、DNA模板。所述的PCR缓冲液，包括三羟甲基氨基甲烷盐(Tris · Cl)，氯化 钾，硫酸铵，氯化镁，酸碱度(pH值)8.0-9.0(2(TC )。所述的PCR缓冲液，其特征在于，包 括IOx缓冲液，终浓度15mM的氯化镁，终pH 8.7。所述的dNTP混合液，包括IOmM dATP、 IOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP的混合液。所述的荧光染料，包括EvaGreen饱和性染料、 LC Green 染料、ResoLight 染料、SYTO 9 染料。所述的 MgC12，包括 10_30mM MgC12。所述 的]\%(12，包括25111^%(12。所述的Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/ min at72°C，存储缓冲液 10-40mM Tris · cl，50_200mM 氯化钾(KCL)，0-5. OmM 二硫苏糖醇 (DTT)，0-1.0mM 乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA), 0-2. O% (V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40，0-2.0 % (V/V)吐温 20 (Tween 20)，30-70 % (ν/ν)甘油(glycerol),稳定剂 (stabilizer) :pH 7. 0-10. 0(20°C ) 所述的存储缓冲液，包括终浓度为 20mM Tris · cl、 IOOmM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.O. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v)。稳定剂的终pH值为9. 0。所述的DNA模板，用常规方法从患者组织中提取获得的DNA。包括DNA和RNA。所 述的患者组织，包括外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及 用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片、冰冻切片等。所述的患者组织，包括外周血、体液、腔道的脱落物、粪便、病变组织、肿瘤组织，以 及用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。所述的PCR反应条件 所述的PCR反应条件 所述的反应条件
8 本发明的检测方法使用本发明的试剂盒和DNA模板在本发明所述的反应条件在 荧光定量PCR仪上进行序列扩增、运行溶解曲线，进行数据分析，得到分型的图谱。所述 的荧光定量PCR仪，包括LightCycler 480 (罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、ABI7500 (美国应 用生物系统公司，纽约，美国)、ABI7900(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、Qiagen Rotor-Gene 6000 (德国 Qiagen 公司，杜塞尔多夫，德国)、Idaho LightScanner (美国 Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照， 加入MIX，进行PCR反应，配套的基因分型软件即可自动区分野生型与突变型。采用的阴性 对照样品可以包括BRCAl和BRCA2阴性对照样品。本发明的试剂盒可以提供与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检 测，所述的肿瘤，包括结包括家族性乳腺癌、卵巢癌、肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患 者、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、 鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉 瘤、腺癌、淋巴细胞癌。较为优选的，所述的肿瘤包括家族性乳腺癌、卵巢癌。检测BRCA基因突变的用于PCR反应的试剂盒，适用于BRCAl第二外显子和第二十 外显子及BRCA2第十五外显子突变的检测。本发明检测BRCA基因突变时，所述引物用于扩 增BRCA基因靶向序列，包括以下引物对(1)第一引物序列含有BRCA1-185的至少15个连 续的核苷酸，第二引物序列含有BRCA1-185的至少15个连续的核苷酸；(2)第一引物序列 含有BRCA1-5382的至少15个连续的核苷酸，第二引物序列含有BRCA1-5382的至少15个 连续的核苷酸；(3)第一引物序列含有BRCA2-6174的至少15个连续的核苷酸，第二引物序 列含有BRCA2-6174的至少15个连续的核苷酸。优选的，本发明的检测BRCA基因突变的方法，包括以下步骤(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本(2)用上述的试剂盒和引物，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时 定量PCR检测(3)分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴 性对照参比，判断样本DNA中KRAS基因的各位点是否突变。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核 苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计遵循原则①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不 能形成二级结构。③引物长度一般在15 30碱基之间。④G+C含量在40% 60%之间。 ⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个 碱基的互补。⑧引物5'端可以修饰。⑨引物3'端不可修饰。⑩引物3'端要避开密码子 的第3位。引物设计的软件=Primer 5 (加拿大Premier公司，加拿大，不列颠哥伦比亚省温 哥华市)，Beacon Designer 7 ；本发明所用引物由上海英潍捷基公司合成。引物合成通常使用亚磷酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成 的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' -5'磷酸
二酯键连接。1、将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱 去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚 磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟 基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5 ‘-羟基没有参加反应(少于 2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。—种检测BRCA基因突变的试剂盒、方法及在家族遗传性乳腺癌诊断中的应用。所 述的肿瘤，包括家族性乳腺癌、卵巢癌。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是由于采用上述技术方案，本发明的检测BRCA基因突变的试剂盒、引物及方法，采 用饱和探针荧光定量PCR基础上运行新型突变研究技术——高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis, HRM)，参照阴性和阳性对照，即可完成对样品基因型的判 断。本发明试剂盒灵敏度非常高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘 膜细胞和肿瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。这采用现有 技术中的检测方法是不可能实现的。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
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图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例进行引物验证得到的电泳图；图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳图；图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序图；图5为本发明实施例不同活性酶进行PCR扩增的电泳图；图6为本发明实施例不同荧光染料进行HRM的溶解曲线图；图7为本发明实施例不同MgCl2终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图和得到的PCR 产物电泳图；图8为本发明实施例不同标本DNA模板进行检测的溶解曲线图；图9为本发明实施例试剂盒灵敏度的检测图；图10为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者石蜡切片模板DNA进行扩增后检测 的溶解曲线图；图11本发明应用例正常人血液标本模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图；图12为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者血浆标本模板DNA进行扩增后检测 的溶解曲线比较图；图13为本发明应用例家族遗传性乳腺癌患者口腔黏膜细胞DNA进行扩增后检测 的溶解曲线比较图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1引物的设计、合成和验证本实施例采用Primer 5设计引物，首先优化设计引物片段的大小，得到不同片段 大小引物PCR扩增的电泳图，结果如图1和下表所示。图Ia为5-9bp的引物PCR扩增的电 泳图，图Ib为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图Ic为18_24bp的引物PCR扩增的电泳 图，图Id为25-29bp的引物PCR扩增的电泳图，图Ie为30_37bp的引物PCR扩增的电泳图， 图If为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。由下表或图1可知，最佳引物为18_24bp大小
的引物。
本实施例中的引物由上海英潍捷基公司合成，本实施例通过PAGE实验进行验证。 用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对合成的引物进行鉴定，包括以下步骤 使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿 素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95°C，2minS)。加入 尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥 胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件 许可，也可以用EB染色或银染方式染色。结果如图2所示。
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实施例2阴性或阳性对照DNA的制作阴性对照DNA的提取采样1、抽取正常人或已知突变的人外周血2. 5ml于枸橼酸纳(1 9)抗凝管。2、抗凝管中的血2000rpm离心5分钟，分离出血细胞，PBS洗两次。3,DNA提取。用Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提 取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA在-20°C保存。定量使用Nano 1000定量仪，测定DNA浓度，合格指标1，符合OD 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0 要求之间，再将 DNA定量稀释到10ng/ul电泳鉴定提取的DNA用1. 0 %的琼脂糖凝胶120V电泳25min，电泳条带比 较单一，比较纯，电泳结果如图3 ；对其进行测序鉴定将提取的DNA进行PCR扩增后送 Invtrogen公司测序，测序结果图如图4。上述鉴定结果表明，按上述方法所获得的DNA样 品符合阴性对照的要求。实施例3肿瘤组织DNA的提取样本采集取新鲜组织块50 IOOmg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须切至厚度在 0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混勻。(30分钟内完成)室温 下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取；使用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组 DNA 提取试 剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。DNA 纯化(若提取的 DNA, OD 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，没有 在标准范围内，则需要此步骤)加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管5min以充分混勻， 13000rpm离心IOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体积的醋酸钠 (pH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇勻，沉淀DNA13000rpm离心3min， 轻轻倒去上清液，加入70%乙醇洗一次，13000rpm，离心3min，去上清液，倒置5-lOmin (倒 置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否则DNA将难 以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸管吹打使DNA 充分溶解。实施例4血液中血细胞DNA的提取抽取病人外周血l_2ml于枸橼酸纳(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管， 吸取部分血液至离心管2000rpm离心5分钟，分离血浆和细胞。弃血浆，留下血细胞并用 PBS洗两次。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血浆用Blood Mini kit试剂盒(德 国QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品 同样处理，提取的DNA-20°C保存。实施例5石蜡切片组织DNA的提取刮削5-10 μ m厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。用二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操 作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例6 =PCR-HRM条件优化实验1)热启动Taq酶选择用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，，图5中1、2、 3、4 分别为 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速热启动 DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活
性最高。 2)荧光染料的选择用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6 中 1、2、3、4、5 分别为 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 荧光染料的实验结 果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。 3) PCR条件的优化在退火温度、Mgcl2浓度两方面PCR条件进行优化调整，结果如表 60°C时，MgCl2浓度为2. OmM, 2. 5mM的实验图如图7所示，图7可以看出，选择退火 温度为60°C，MgCl2终浓度为2. 5mM时为最佳的条件。4) HRM条件优化HRM条件的优化溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面调整 最佳HRM条件的确定 5) DNA来源样本分别从外周血、口腔拭子、组织、石蜡切片中进行检测模板DNA，检测结果如下表和 图8所示 图8A D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，由图可知，外周 血、口腔拭子、组织、石蜡切片中的DNA均可检测，差异性不大。实施例6灵敏度实验用实施例1 5获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入 阴性对照样本、突变样本、5%突变样本、10%突变样本、15%突变样本。本试剂盒与其它 检测方法灵敏度比较如图9和下表所示如图9所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1%。其他检测方法对照 文献Mutation Research 635(2007) 105-117的检测方法灵敏度数据，如下表所示，本试剂 盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1%。
应用例1 家族遗传乳腺癌患者石蜡切片组织BRCA突变检测家族遗传乳腺癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。使用仪器LlightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、刮削5-10 μ m厚的切片1_5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作 说明提取DNA。引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图10所示的家族 遗传性乳腺癌患者的检测结果。结果在家族遗传性乳腺癌病人中检出BRCAl第2外显子 突变的有12例(检出率大约为66. 7% )，BRCAl第20外显子突变的有2例(检出率大约 为10% )，BRCA2第11外显子突变的有2例(检出率大约为10% )如图IOA C所示，为 BRCA1-185、BRCA1_5382和BRCA2-6174的突变检测图。符合国内外研究报道的家族遗传乳 腺癌中BRCA基因突变的几率。应用例2家族遗传性乳腺癌血细胞DNA检测BRCA突变抽取病人(共20例)外周血l_2ml于枸橼酸钠(1 9)或EDTA抗凝管中，不用 肝素抗凝管，破碎红细胞后吸取部分血液至离心管2000rpm离心5分钟，分离细胞。提取血 细胞中的DNA作为模板。
使用仪器LlightCycler 480 荧光定量 PCR 仪器分析DNA模板提取1、将抗凝血2000转离心5分钟，取血细胞。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)提取血浆中的DNA。按照 试剂盒的操作说明提取。引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图1IA C为正常人BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图，图12A C为家族遗传性乳腺癌 患者BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图的检测结果。从图中可知，在家 族遗传性乳腺癌病人中检出BRCAl第2外显子突变的有8例(检出率大约为40% )，BRCAl 第20外显子突变的有1例(检出率大约为5%)BRCA2第11外显子突变的有4例(检出率 大约为20%)。在正常人中未检出BRCA突变。符合国内外研究报道的家族遗传乳腺癌中 BRCA基因突变的几率。应用例3 口腔粘膜细胞DNA筛查BRCA基因突变口腔拭子涂擦口腔粘膜后，用PBS洗脱细胞，2000rpm离心5分钟收取口腔粘膜细 胞。用试剂盒提取DNA作为模板。使用仪器LlightCycler 480 荧光定量 PCR 仪器分析DNA模板提取1、将口腔粘膜细胞洗脱液2000转离心5分钟，取沉淀细胞。2、用TIANamp Swab DNA Kit试剂盒(TIANGEN公司生产)提取口腔粘膜细胞DNA。 按照试剂盒的操作说明提取。引物序列 PCR和HRM反应条件 用以上优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，得到如图13A C为家族 遗传性乳腺癌患者BRCA1-185、BRCA1-5382和BRCA2-6174的突变检测图的检测结果。。从 图中可知，在家族遗传性乳腺癌病人中检出BRCAl第2外显子突变的有8例(检出率大约 为40% )，BRCAl第20外显子突变的有2例(检出率大约为10% )BRCA2第11外显子突变 的有5例(检出率大约为25%)。符合国内外研究报道的家族遗传乳腺癌中BRCA基因突 变的几率。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCA1基因的第2外显子或BRCA1基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRCA1基因的第2外显子具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述BRCA1基因的第20外显子具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第11外显子具有SEQ ID No3的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续 核苷酸序列为SEQ ID No 4 21序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物 为SEQ ID No 4 21序列之一的正向引物或反向引物。
4.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂 盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系， 所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 IOX ；dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列终浓度为 0. 1 0. 5 μ M ； 模板 DNA0. 1 1. 5ng/y L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为1 3mM ；荧光染料1 3X。
5.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR 反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 2 0. 3mM ；引物序列终浓度为0. 2 0. 3M ；模板 DNA0. 5 1. Ong/ μ L ；TaqDNA 聚合酶0. 03 0. 06U/ μ L ；MgCl2终浓度为2 3mM ；荧光染料1 2X。
6.根据权利要求1所述的检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光 染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCGreen PLUS染料、ResoLight染料、 SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-200CT pH值在8. 0-9. 0间。
7.—种检测BRCA基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有BRCAl基因的第二外显子BRCA或第二十外显子BRCA，BRCA2 基因的第十一外显子BRCA中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引 物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中BRCA基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的BRCA基因进行突变位点检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细 胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片 中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s， 56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR 仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率溶 解曲线法的条件为92 97°C变性Imin ；40°C复性Imin ；然后初始溶解温度60°C开始程序 升温溶解至95°C，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
10.一种PCR反应试剂盒在BRCA基因突变相关的肿瘤用药选择和遗传易感性方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增BRCA基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有BRCA1基因的第2外显子或BRCA1基因的第20外显子或BRCA2基因的第11外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述BRCA1基因的第2外显子具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述BRCA1基因的第20外显子具有SEQ ID No2的连续核苷酸序列；BRCA2基因的第21外显子具有SEQ ID No3的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而为肿瘤包括家族性乳腺癌和卵巢癌的选择用药和遗传易感性提供指导。
文档编号G01N21/64GK101921831SQ20101013423
公开日2010年12月22日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者王弢, 王秀娟, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司