携带修饰物的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法

文档序号:6090503阅读:319来源:国知局
专利名称:携带修饰物的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域,更具体地说,涉及一种携带修饰物的核苷酸及其制备 方法和用于基因测序的方法。
背景技术
在传统的基因测序技术中,采用的是双脱氧链终止法(Sanger)。加入核苷酸到反 应体系中进行DNA合成反应,核苷酸上的碱基逐步结合到DNA待测模板的不同位点,在一次 合成结束时,由于每个碱基停止的位置不同,导致生成的各段DNA双链长短不一,则利用电 泳将其分开,然后标记ATCG,根据不同的停止位点测定各碱基。目前采用的一种测序方法是首先将模板与引物杂交;然后加入DNA聚合酶和修 饰过的核苷酸,该核苷酸的3端-OH连接有荧光标记物(Fluorophore),DNA聚合反应时该 荧光标记物可使反应暂停;反应暂停时测定此处的碱基;最后去除3’端的荧光标记物,使 DNA聚合反应继续。由上可知,该方法采用将荧光标记物堵住核苷酸的3端-OH的方式来达 到暂停的目的,但是在后续去除荧光标记物时必须切除-0H,数次反应之后将无法彻底切除 荧光标记物,这样会导致反应无法继续进行,就不能测得更长的基因序列。目前采用的另一种测序方法,是基于焦磷酸的测序方法。测序合成反应是基于常 规的合成方法,而信号检测是通过对于焦磷酸的释放过程的PPi的检查,通过酶将PPi转化 为光信号进行检测。这种测序法是一种实时合成测序法,测序反应中间并无暂停步骤。这 种方法的最大弱点是同聚物序列的检测不准确,同样的多个连续碱基的测量因为光信号的 线性度不准而测量不准。因此需要一种新的基因测序方法,能解决测序准确率低和测序长度较短的问题。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一种携带修饰物的核苷酸,旨在解决现有技术测序准 确率低和测序长度较短的问题。为了实现发明目的,所述携带修饰物的核苷酸的结构通式如下dNTP-R;式中 dNTP为核苷酸,修饰物-R连接在核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置,其包含至少一个 可切除位点、至少一个标记物。优选地,,-R的结构为-Rl_R2 ;其中,-Rl为第一修饰物,连接在碱基上;-R2是第 二修饰物,包含一个可切除位点、一个标记物。优选地,所述第一修饰物-Rl携带氨基末端,第二修饰物-R2携带醛基末端,两者 以酯键结合成为所述修饰物-R。优选地,所述第一修饰物-Rl的结构是长度为η的碳链并结合氨基末端, 即-CnHm-NH-,其中n、m均为正整数。优选地,所述第二修饰物-R2的结构为-R21-R22 ;其中,-R21是可切除位 点;-R22是标记物。
优选地,所述可切除位点-R21的结构由双硫键构成,即-S-S-,可通过还原剂打开。优选地,所述可切除位点-R21为吡喃醇结构,即
权利要求
一种携带修饰物的核苷酸,结构通式如下dNTP R;式中dNTP为核苷酸,其特征在于修饰物 R连接在核苷酸中除脱氧核糖上 OH以外的位置,其包含至少一个可切除位点、至少一个标记物。
2.根据权利要求1所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,-R的结构为CR1-R2;其中,-R1为第一修饰物,连接在碱基上;-R2是第二修饰物,包含一个可切除位点、一个标记物。
3.根据权利要求2所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述第一修饰物-R1携带 氨基末端,第二修饰物-R2携带醛基末端,两者以酯键结合成为所述修饰物-R。
4.根据权利要求3所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述第一修饰物-R1的结 构是长度为η的碳链并结合氨基末端,即-CnHm-NH-,其中n、m均为正整数。
5.根据权利要求2所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述第二修饰物-R2的结 构为-R21-R22 ;其中,-R21是可切除位点;-R22是标记物。
6.根据权利要求5所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述可切除位点-R21的 结构由双硫键构成,即-s-s-,可通过还原剂打开。
7.根据权利要求5所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述可切除位点-R21为 吡喃醇结构,即γ0γ0\可在其6h位置的C-O键打开。,
8.根据权利要求5所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,所述标记物-R22包括荧 光标记物,或生物素标记物。
9.根据权利要求1所述的携带修饰物的核苷酸,其特征在于,核苷酸dNTP包括dATP、 dGTP、dCTP、dUTP。
10.一种携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述方法包括将脱氧核糖上-OH以外的位置连有第一修饰物-R1的核苷酸,与带有可切除位点的第 二修饰物-R2进行反应,结合成为携带修饰物的核苷酸dNTP-R。
11.根据权利要求10所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述方法 包括A.将第一修饰物-R1连接到核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置,生成ClNTP-R1;B.对标记物进行修饰,生成带有一可切除位点的第二修饰物-R2;C.将连有第一修饰物的核苷酸ClNTP-R1与第二修饰物-R2结合,生成所述携带修饰物 的核苷酸dNTP-R ;其中,所述步骤A和B无先后顺序。
12.根据权利要求11所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述方法 包括Al.将携带氨基末端的第一修饰物-R1连接到核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置; Bi.对标记物进行修饰,生成带有一可切除位点及醛基末端的第二修饰物-R2 ; Cl.将步骤Al中携带氨基末端的核苷酸,与携带醛基末端的第二修饰物-R2进行反应, 以酯键结合,生成所述携带修饰物的核苷酸; 其中,所述步骤Al和Bl无先后顺序。
13.根据权利要求12所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述步骤 Al包括将结构为-CnHm-NH2的氨基修饰物结合到核苷酸中的碱基上,其中n、m均为正整数。
14.根据权利要求12所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述步骤 Bl包括Bll.对标记物进行化学修饰,使其包含一可切除位点;B12对标记物进行醛基修饰,生成携带醛基末端的第二修饰物_R2。
15.根据权利要求11、12或14所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所 述可切除位点的生成过程包括对标记物进行化学修饰,生成双硫键-S-S-作为可切除位点。
16.根据权利要求14所述的携带修饰物的核苷酸的制备方法,其特征在于,所述步骤 Bll包括对标记物进行化学修饰,生成吡喃醇结构作为可切除位点,即
17.一种利用携带修饰物的核苷酸进行基因测序的方法,其特征在于,在所述携带修饰 物的核苷酸dNTP-R中,修饰物-R连接在核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置,其包含至 少一个可切除位点、至少一个标记物,所述方法包括以下步骤A.利用携带修饰物的核苷酸dNTP-R在至少一个DNA待测模板上的第N个待测位点进 行延伸反应,并通过所述标记物采集第N个待测位点对应的荧光信号,其中N为正整数;B.从核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置切除修饰物,并回到步骤A以采集第N+1 个待测位点对应的荧光信号;C.对采集到的荧光信号进行数据处理,确定待测位点的碱基;所述步骤B和C无先后顺序。
18.根据权利要求17所述的基因测序的方法,其特征在于,所述携带修饰物的核苷酸 dNTP-R 包括 4 种dATP-R、dGTP-R、dCTP-R、dUTP-R,则所述步骤 A 包括对于DNA待测模板上的任一待测位点,采用上述4种不同的核苷酸逐次进行延伸反应, 并采集每次反应结束后所述待测位点对应的荧光信号,作为与所述任一待测位点对应的一 组数据。
19.根据权利要求18所述的基因测序的方法,其特征在于,若N=1,则所述步骤A采 集第1个待测位点对应的荧光信号的过程包括Al.将4种携带修饰物的核苷酸dNTP-R逐次与DNA待测模板上的引物进行延伸反应;A2.对逐次反应中标记物受激发产生的荧光信号进行采集,得到与第1个待测位点对应的一组数据。
20.根据权利要求18所述的基因测序的方法,其特征在于,若N= M> 1,则所述步骤 A采集第M个待测位点对应的荧光信号的过程包括Al’.将4种携带修饰物的核苷酸dNTP-R逐次与前一个核苷酸的3’端进行延伸反应; A2’ .对逐次反应中标记物受激发产生的荧光信号进行采集。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的基因测序的方法,其特征在于,若标记物是 荧光标记物,则对所述荧光信号进行采集的过程包括A21.利用激发光源照射所述标记物,产生荧光信号;A22.通过图像采集方式或光电转换方式,对所述荧光信号进行采集。
22.根据权利要求17至20中任一项所述的基因测序的方法,其特征在于,若标记物是 生物素标记物,则在所述步骤A21之前还包括A20.将带有荧光标记的链酶亲和素与所述生物素标记物结合。
23.根据权利要求17所述的基因测序的方法,其特征在于,若可切除位点的结构由双 硫键构成,即-S-S-,则所述步骤B中切除修饰物的过程包括通过还原剂打开双硫键。
24.根据权利要求17所述的基因测序的方法,其特征在于,若可切除位点为吡喃醇结 构,即则所述步骤B中切除修饰物的过程包括
25.根据权利要求17所述的基因测序的方法,其特征在于,所述步骤C中的数据处理包括对与任一待测位点对应的一组数据进行实时的数据处理;或 将多个待测位点对应的各组数据进行非实时的集中数据处理。
26.根据权利要求25所述的基因测序的方法,其特征在于,所述步骤C包括Cl.对于DNA待测模板上的任一待测位点,比较同一组数据中的多个荧光信号值,确定 成功的延伸反应;C2.根据延伸反应采用的对应的核苷酸,通过碱基互补配对原则确定所述待测位点的碱基。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域,更具体地说,涉及一种携带修饰物的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。所述携带修饰物的核苷酸,结构通式为dNTP-R;式中dNTP为核苷酸,修饰物-R连接在核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置,其包含至少一个可切除位点、至少一个标记物。其制备方法包括将脱氧核糖上-OH以外的位置连有第一修饰物-R1的核苷酸,与带有可切除位点的第二修饰物-R2进行反应,结合成为携带修饰物的核苷酸dNTP-R。此外,本发明还提供了一种利用携带修饰物的核苷酸进行基因测序的方法。利用本发明提供的携带修饰物的核苷酸进行基因测序,既能提高测序的准确率,又能测得更长的基因序列。
文档编号G01N21/64GK101942000SQ201010155269
公开日2011年1月12日 申请日期2010年4月13日 优先权日2010年4月13日
发明者盛司潼 申请人:深圳华因康基因科技有限公司
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