专利名称：一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法
技术领域：
本发明属分析化学领域，具体涉及一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法。
背景技术：
氨基酸是含有氨基的有机酸，是构成蛋白质的基本单位，是人体生命活动所必须 的基本物质，是蛋白质在体内合成肌肉、皮肤、脏器、酶、免疫抗体所必须的成分。氨基酸来 源于蛋白质，蛋白质在体内分解为氨基酸被小肠吸收，通过肝脏贮存于骨骼、肌肉和脏器的 细胞及血浆中，在蛋白质合成和代谢时被利用。1820年在蛋白质的水解产物中发现了结构 最简单的甘氨酸，到1940年已发现自然界中有20种左右的氨基酸。它们为人体或动物合 成蛋白质所必需，多属L-型a-氨基酸。根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同， 将氨基酸分为中性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、 甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等)这类氨基酸 分子中只含有一个氨基和一个羧基；酸性氨基酸(谷氨酸、天门冬氨酸)，这类氨基酸分子 中含有一个氨基和二个羧基；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)这类氨基酸的分子中含二氨基 一羧基；组氨酸具氮环，呈弱碱性，也属碱性氨基酸。组成蛋白质的氨基酸都有一定的营养价值，用适当比例配成的氨基酸混合液可直 接注射到人体血液中以补充营养，部分地代替血浆，对创伤、烧伤和手术后的病人有增进抗 病力，促进康复的作用。各种必需氨基酸有维持人体和动物正常发育的保健营养作用。食物中的蛋白质经过肠胃道消化，分解成能被人体吸收利用的氨基酸，人体对蛋 白质的需要实际上就是对氨基酸的需要。吸收后的氨基酸只有在数量和种类上都能满足人 体需要身体才能利用它们合成自身的蛋白质。营养学上将氨基酸分为必需氨基酸和非必需 氨基酸两类。必需氨基酸指的是人体自身不能合成或合成速度不能满足人体需要，必须从 食物中摄取的氨基酸。对成人来说，这类氨基酸有8种，包括赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。对婴儿来说，组氨酸也是必需氨基酸。非必需氨 基酸并不是指人体不需要这些氨基酸，而是说人体可以自身合成或由其它氨基酸转化而得 到，不一定非从食物直接摄取不可。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天门 冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸如胱氨酸和酪氨酸如果供 给充裕还可以节省必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量。亮氨酸又称白氨酸，化学名为2-氨基-4-甲基戊酸或2-氨基异己酸。亮氨酸是 Proust于1819年首先从奶酪中分离出来的，并将其命名为亮氨酸。亮氨酸属支链氨基酸或 者说必需氨基酸，是人体自身不能合成，必须从食物中摄取的氨基酸。可用于诊断和治疗小 儿的突发性高血糖症，也可用作头晕治疗剂及医药营养滋补剂。其外观为白状结晶，味苦， 熔点293°C。可溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。亮氨酸存在于所有蛋白质中，在玉米麸质 和血粉中含量最高，鱼类含量也很高，特别是豚鱼含量更高。氨基酸在体内的代谢是在各种酶体系下进行氧化分解，进入三羧酸循环，最后氧 化成co2和水。亮氨酸的分解代谢过程是在亮氨酸转氨酶的作用下，经可逆的转氨基作用
3形成a-酮酸。a-酮酸经亮氨酸脱氢酶的催化作用，进行不可逆的氧化脱羧，形成少一个 碳原子的异戊酰CoA。异戊酰CoA经过a，0原子间脱氢形成双键，再在双键间加水，形成 3 -羟-甲基戊二酰CoA。最后降解为乙酰乙酸和乙酰CoA，乙酰乙酸转变成乙酰乙酸 CoA，参加成酮反应，进入三羧酸循环，氧化成C02和水。
血样中氨基酸的检测可以反应病症的反映征象，例如在脓毒症发生时，机体体现 为高代谢状态、高血流动力学状态及其他的炎症反应征象。临床上常表现为骨骼肌中的蛋 白质降解加快，氨基酸转氨反应和氧化反应加剧，致使氨基酸在血中的浓度上升。同时缺氧 导致糖酵解作用增强，其过程形成的乳酸在血中的浓度也会明显增加；随着循环中的氨基 酸和乳酸增加又会促进肝脏中糖异生作用增强，葡萄糖生成明显增多，而此时机体因为胰 岛素抵抗作用的出现导致葡萄糖的利用减弱，表现出血糖显著升高。气相色谱-质谱联用仪(Gas Chromatography and Mass Spectrometry, GC/MS) 是将色谱和质谱用特定的接口联接起来，将色谱的分离能力和质谱的定性能力相结合对 样品进行检测的分析技术。随着技术的创新与发展，GC/MS技术不仅是目前有机物分析的 最有效的手段之一，在生物医学领域如新药研制、疾病诊断、毒品检测、代谢物检测等方面 也有广泛的应用。在新药结构分析上，利用分子量、分子碎片等信息，GC/MS技术可以推 测或确定分子结构。在药物的含量分析上，GC/MS技术可以分析药物的主成分和杂质的 结构，进行药物的定量分析。在新药代谢过程中，利用GC/MS技术对药物代谢物进行检测 可以用来分析药物代谢动力学的过程。在临床疾病诊断中，有些生物分子的存在与否或 浓度高低与疾病有一定的联系，GC/MS技术可以利用对这些生物分子的检测发挥有效的 作用。如对一些氨基酸缺陷疾病中氨基酸的分析以辅助疾病的诊断与治疗。在苯丙酮尿 症(PKU)中，用GC/MS定量分析婴儿血样中的苯丙氨酸的含量，可以诊断婴儿是否患有苯 丙酮尿症[Deng CH, Li N, Zhang XM. Rapiddetermination of amino acids in neonatal blood samples based on derivatization with isobutylchloroformate followed by solid-phase microextraction and gas chromatography/mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2004,18(21) :2558_2564]。在另一种氨基酸 缺陷疾病——槭糖尿病(MSUD)中，用GC/MS分析新生儿血样中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸和苯丙氨酸可以诊断这种疾病[Deng CH, Deng YH. Diagnosis of maple syrup urine disease bydetermination of L-valine,L-isoleucine,L-leucine and L-phenylalanine in neonatal blood spots bygas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B. 2003,792(2) =261-268] GC/MS技术也是毒物检测的最常用手段之一， 由于GC/MS技术中质谱库的联机检索功能，可用于快速确定毒物结构，为抢救中毒人员提 供科学依据。GC/MS技术检测血样中亮氨酸的瓶颈在于亮氨酸的衍生化反应，传统方法中亮氨 酸的衍生化反应是血浆样品在烘箱中衍生化，反应花费的时间都比较长，亮氨酸的两步衍 生化反应共需要90分钟，对血样处理来说，衍生化反应耗时较多，血样的前处理时间过长， 不利于代谢物的快速检测。寻找一种亮氨酸的快速衍生化反应方法是实验和临床急需的。
发明内容
本发明目的在于提供一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法。
本发明提出的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，具体步骤如下(1)将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；(2)自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，脱蛋白处理，取上清液；(3)在步骤(2)的血清上清液中加入碱溶液，中和至pH为6-7，离心取上清液；(4)上清液通过阳离子交换树脂柱；(5)用去离子水充分清洗阳离子交换树脂柱后，用氨水洗脱阳离子交换树脂柱，收 集洗脱液；(6)洗脱液用氮吹仪吹干，加入双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA)、吡啶和乙 酸乙酯，密封；微波反应，控制微波功率为200W-500W，反应时间30s-120s。本发明中，步骤(2)中所使用的过氯酸体积比浓度为8%。本发明中，步骤(3)中所使用的碱溶液采用氢氧化钾(K0H)。本发明中，步骤(4)中所使用的阳离子交换树脂可以采用H+型树脂。本发明中，步骤(5)中所使用的氨水为6mol/l。本发明中，为了微波更好地吸收，步骤(6)中还可以加入乙腈做微波吸收剂。本发明中，控制微波功率为300-350W，微波反应时间为100_120s。本发明的有益效果是一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法可以将衍生化反应时 间从传统前处理方法的90分钟缩短到2分钟，节约了气质联用(GC/MS)前处理的时间，便 于进行大量血样中亮氨酸的快速分析，同时也有利于在临床上开展对亮氨酸的及时检测。
图1是实施例1血样中亮氨酸微波衍生化反应GC/MS总离子流色谱图。图2是实施例2血样中亮氨酸微波衍生化反应GC/MS总离子流色谱图。
具体实施例方式下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。实施例1 将采集的2ml血浆样品在室温下解冻，加入4ml过氯酸(8%，V/V)脱蛋 白处理，离心2分钟，上清液用氢氧化钾中和至pH6-7之间，此溶液在冰上冷处理10分钟， 离心2分钟取上清液。上清液过阳离子交换柱(50W-X8，200mesh，H+form)，用20ml去离子水 充分清洗双柱后，用2ml6mol/l氨水洗脱阳离子交换柱上的氨基酸，用安瓿瓶接取洗脱液。 洗脱液用氮吹仪吹干，加入BSTFAlOOiU，吡啶50iU，乙酸乙酯100 yl，为了加强微波反应 的效果加入乙腈50 iU，将安瓿瓶封口，在微波炉300W下反应120s。所用微波炉为三星牌 微波炉，功率范围从100W至800W。冷却开管，用氮吹仪吹干，加入100 ill 二氯甲烷溶解，取 1. 0u 1进行GC/MS分析。GC/MS反应条件是色谱柱HP-5MS石英毛细管柱(30mX0. 25mm, 0. 25 u m)；柱温:70°C (保持 2min) 300°C (保持 lOmin)，升温速度20°C /min ；载气氦 气(> 99. 999% )，流速:lml/min ；质谱:EI 源(70eV，200°C )，扫描方式:Full_scan。图 1 是血样中亮氨酸微波衍生化反应GC/MS总离子流色谱图，亮氨酸BSTFA衍生化反应的出峰 时间是6. 929分钟。实施例2 将采集的2ml血浆样品在室温下解冻，加入4ml过氯酸(8%，V/V)脱蛋 白处理，离心2分钟，上清液用氢氧化钾中和至pH6-7之间，此溶液在冰上冷处理10分钟，离心2分钟取上清液。上清液过阳离子交换柱(50W-X8，200mesh，H+form)，用20ml去离子水 充分清洗双柱后，用2ml6mol/l氨水洗脱阳离子交换柱上的氨基酸，用安瓿瓶接取洗脱液。 洗脱液用氮吹仪吹干，加入BSTFAlOOiU，吡啶50iU，乙酸乙酯100 yl，为了加强微波反应 的效果加入乙腈50 u 1，将安瓿瓶封口，在微波炉400W下反应120s。所用微波炉为三星牌 微波炉，功率范围从100W至800W。冷却开管，用氮吹仪吹干，加入100 ill 二氯甲烷溶解，取 1. 0u 1进行GC/MS分析。GC/MS反应条件是色谱柱HP-5MS石英毛细管柱(30mX0. 25mm, 0. 25 u m)；柱温70°C (保持 2min) 300°C (保持 lOmin)，升温速度20°C /min ；载气氦 气(> 99. 999%)，流速lml/min;质谱EI 源(70eV，200°C )，扫描方式Full-scan。图 2 是血样中亮氨酸微波衍生化反应GC/MS总离子流色谱图，亮氨酸BSTFA衍生化反应的出峰 时间是6. 928分钟。
权利要求
一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于具体步骤如下(1)将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；(2)自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，脱蛋白处理，取上清液；(3)在步骤(2)的血清上清液中加入碱溶液，中和至pH为6-7，离心取上清液；(4)上清液通过阳离子交换树脂柱；(5)用去离子水充分清洗阳离子交换树脂柱后，用氨水洗脱阳离子交换树脂柱，收集洗脱液；(6)洗脱液用氮吹仪吹干，加入双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、吡啶和乙酸乙酯，密封；微波反应，控制微波功率为200W-500W，反应时间30s-120s。
2.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(2) 中所使用的过氯酸体积比浓度为8%。
3.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(3) 中所使用的碱溶液采用氢氧化钾。
4.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(4) 中所使用的阳离子交换树脂采用H+型树脂。
5.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(5) 中所使用的氨水为6mol/l。
6.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(6) 中加入乙腈。
7.根据权利要求1所述的一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法，其特征在于步骤(6) 中微波反应功率为300-350W，微波反应时间为100-120S。
全文摘要
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种血样中亮氨酸的快速衍生化方法。具体步骤为将冰冻储存的血样在常温下自然解冻；自然解冻后的血样中加入过氯酸，充分振荡，脱蛋白处理，取上清液；在血清上清液中加入碱溶液，中和至pH为6-7，离心取上清液；上清液通过阳离子交换树脂柱；用去离子水充分清洗阳离子交换树脂柱后，用氨水洗脱阳离子交换树脂柱，收集洗脱液；洗脱液用氮吹仪吹干，加入双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、吡啶和乙酸乙酯，密封；微波反应，控制微波功率为200W-500W，反应时间30s-120s。本发明可节约了气质联用衍生化前处理的时间，便于进行大量血样中亮氨酸的快速分析，同时也有利于在临床上开展对亮氨酸的及时检测。
文档编号G01N30/06GK101852788SQ20101017516
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者宋国新, 肖晋芬, 胡耀铭 申请人:复旦大学