专利名称：一种唾液蛋白样品的制备方法
技术领域：
本发明属电泳蛋白质样品制备技术领域，具体涉及一种有关全唾液蛋白质的制备 方法。
背景技术：
近年来，唾液的临床诊断价值逐渐为人们所认识。唾液通过非侵入方式获得、对机 体无创伤、可用于大样本筛查、利于纵向动态观察。因此，越来越多的临床工作者将唾液蛋 白质组学的策略应用于生理和病理状态下唾液蛋白质种类和功能的研究。但由于唾液中含 有大量粘蛋白，会造成蛋白质组学工作中样品制备的困难和分离分析的误差，影响实验重 复性。人类的唾液粘蛋白是蛋白质和碳水化合物的共价复合物，可分为两类，即高相对 分子质量粘蛋白(MGl)和低相对分子质量粘蛋白(MG2)。MGl分子量大于lOOOkDa，MG2分 子量为200-250kDa。此类糖蛋白具有优良的组织覆盖作用，以润滑、维持口腔粘膜完整性。 但由于唾液粘蛋白性质粘稠、含量丰富(约占总蛋白7% -20% )、分子量大，在唾液蛋白质 组样品制备和分离分析中，会造成实验误差，影响实验重复性。例如粘蛋白粘稠的性质会使 上样量产生误差；粘蛋白的大分子量会阻塞电泳凝胶孔径影响分离效果；粘蛋白作为一种 高丰度蛋白，会影响蛋白样品中其它低丰度蛋白的上样量。所以在唾液蛋白质组蛋白样品 制备过程中，必须给予去除。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种唾液蛋白样品的制 备方法，主要通过稀乙酸沉淀去除粘蛋白而实现。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)收集唾液； 2)将收集的唾液于4°C，800g离心15min，吸取上清液；3)加入体积浓度为0. 05% -5%的 稀乙酸，混勻；4)4°C，14000g离心60min，吸取上清液；5)将上清液放入透析袋中用双蒸水 透析5h;6)浓缩，得到唾液蛋白样品。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体 积浓度为0. -0. 5%。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸的体 积浓度为0. 15%。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积 为步骤2)中吸取的上清液体积的1-4倍。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的稀乙酸体积 为步骤2)中吸取的上清液体积的2倍。所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤6)所用的浓缩剂为聚乙 二醇 20000。
本发明采用稀乙酸沉淀法去除粘蛋白后制备唾液蛋白样品，并与传统丙酮沉淀法 相比较，具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于 分析等优点，比丙酮沉淀法更有利于提高基于双向电泳-质谱技术路线唾液蛋白质组学的 稳定性、重复性。
图1为稀乙酸沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱；图2为丙酮沉淀法制备的唾液蛋白样品双向电泳银染图谱。
具体实施例方式现结合本发明的实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中，所用的药品和仪 器如下丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、甘氨酸、TRIS、CHAPS、SDS、碘乙酰氨、固相pH干 胶条(IPG strip pH4-7，24cm)等均为 GE healthcare 公司产品；2_D Quant Kit 蛋白定量 试剂盒购自Amersham Biosciences公司；透析袋(截留分子量3500)购自上海捷瑞生物工 程公司；冰乙酸、聚乙二醇(分子量20000)、丙酮为国产分析纯。UV8500双束紫外分光光度 仪购自HITACHI公司；EttanTM IPGphorTM等电聚焦电泳仪，EttanTM DALTSix垂直板电泳 仪,UMAX ImageScanner凝胶扫描仪,均购自 Amersham Biosciences 公司；VariοSkan Flash 全波长多功能酶标仪购自热电Thermo公司。实施例1、唾液样品收集6例唾液样品来源于本实验室健康女性研究生。年龄24 29岁。唾液收集时间 为上午9:00-12:00，收集前2h开始禁食水。用清水漱口后静坐于椅子上，前5min内的唾 液自然吞下后开始收集，口腔唾液积聚至一定量后，将其吐入放置于冰浴中的50ml离心管 内，共采集唾液样品6ml (每组3ml)，采集时间为5-lOmin。实施例2、唾液蛋白样品制备与测定方法一将实施例1中收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，加入两倍 体积0. 15%的稀乙酸，混勻，再次离心60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，放入透析袋中 用双蒸水透析5h，然后应用聚乙二醇20000浓缩至300 μ 1左右。方法二 将实施例1中收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，再次离心 60min(4°C，14000Xg)，吸取上清液，取预冷至4°C的丙酮，按照4 1的比例(丙酮样 品)，倒入样品中，混勻，-20 V保存24h后，取出样品，离心60min (4°C，14000 X g)，弃上清， 可见离心管底部有白色绵絮状物质，用300 μ 1裂解液(30mmOl/LTris-HCl，8mOl/L尿素， 4% CHAPS, pH8. 5)溶解沉淀。将方法一和方法二制备的样品蛋白用2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒测定蛋白质 浓度。总质量=蛋白样品浓度X总体积。总时间=从第一步离心开始到300μ1蛋白样品 制备完成的时间。双向凝胶电泳实验分别将方法一和方法二制备的样品和水化液(8mol/L尿素， 2% CHAPS, 13mmol/LDTT,0. 5% IPG buffer, 0. 002%溴酚蓝)混合后共 450ul (每块胶总蛋 白上样量为300 μ g)，采用胶内泡涨的方法上样。等电聚焦参数30V，12h ；500V, Ih ； 1000V, Ih ；8000V, 8h。等电聚集后，胶条于平衡液1 (1 % DTT，50mmol/LTris-cl, 6M尿素，30 %甘油，2% SDS，0. 002%溴酚蓝)、平衡液2(4%碘乙酰氨，50謹01/1!^8(1，611尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝)中各平衡15min后转移到第二向12. 5 % SDS-PAGE胶上，用0. 5 %琼 脂糖封顶，进行第二向电泳，参数设定为10W，45min ；40W，6h。直到溴酚蓝染料迁移至胶的 底部边缘结束电泳。取出凝胶转移到染色盒里进行硝酸银染色，使用UMAX ImageScarmer凝胶扫描仪 及LabScan软件进行扫描。采用SPSS 16. 0统计软件处理，所有数据采用均数士标准差(Z 士S)表示，均数 比较用t检验作两组组间比较。实验结果如下稀乙酸沉淀法制备得到的蛋白总质量显著高于丙酮沉淀法，而提取蛋白总时间显 著低于丙酮沉淀法。相关的数据见表1。表1.两种蛋白制备方法蛋白质总质量及总时间的比较(n = 6,X 士S)
注与丙酮沉淀法比较:*P < 0.05，**P <0.01。由表1中可以看出，稀乙酸沉淀法的蛋白提取率与蛋白提取时间均显著优于丙酮 沉淀法。两种方法蛋白回收率的差异可能是由于丙酮作为一种有机溶剂在沉淀蛋白时可能 并不完全，部分蛋白质可能仍留在上清液中被去除而损失；0. 15%的稀乙酸在沉淀粘蛋白 的同时，对溶液中其它蛋白质并无影响。由图1中也可以看出稀乙酸沉淀法组蛋白质点数 要明显多于丙酮沉淀法组，特别是在凝胶左下角(酸性端、低分子量区)，而丙酮沉淀法组 凝胶的上区和中区分别有两块横向染色阴影，根据分子量推测即是MG1和MG2。稀乙酸沉淀 法组由于去除了粘蛋白这一高丰度蛋白，相对增加了其它低丰度蛋白的上样量，使这些蛋 白点得以在凝胶显示，并且图谱清晰度较高，便于软件统计分析。此外，相对于丙酮特殊的 辛辣气味、多系统毒性、易燃性，稀乙酸有安全无毒的优点。当然，稀乙酸沉淀法在保留了大部分蛋白质的同时，也保留了部分杂质(包括生 物大分子如核酸等，小分子如盐离子等)。其中生物小分子类可以通过双蒸水透析去除，大 分子化合物仍然混杂在蛋白质样品中。但由于这些生物大分子含量较低，在整个蛋白质组 实验过程中，对蛋白质的分离、分析、鉴定影响不大。所以综合分析其利弊得失，稀乙酸沉淀 法具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于分析 等优点，比丙酮沉淀法更有利于提高基于双向电泳-质谱技术路线唾液蛋白质组学的稳定 性、重复性。实施例3、乙酸体积与浓度对唾液蛋白样品制备的影响一、实验方法如下(1)唾液样本收集唾液收集时间为上午9:00-12:00，收集前2h开始禁食水。用清水漱口后静坐于椅 子上，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，口腔唾液积聚至一定量后，将其吐入放置于 冰浴中的50ml离心管内，共采集唾液样品12ml (每管100 yl，每组6管)。
(2)不同体积稀乙酸沉淀法唾液蛋白样品制备收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，分别加入12倍、8倍、4倍、2倍、 1. 5倍、1倍、0. 5倍、0倍体积0. 15%的稀乙酸，混勻，再次离心60min (4°C，14000 X g)，吸取
上清液。(3)不同浓度乙酸沉淀法唾液蛋白样品制备收集的样品离心15min(4°C，800Xg)，吸取上清，分别加入200 yl乙酸溶液，体积 浓度分别为 100%,25%,5%U%>0. 5%,0. 15%,0. 1%,0. 05%,0. 01 %、0%，混勻，再次离 心 60min (4°C，14000 X g)，吸取上清液。(4)样品蛋白浓度测定及总质量计算样品蛋白用Bradford法蛋白定量检测试剂盒(购自南京凯基生物科技公司)测 定蛋白质浓度。总质量=蛋白样品浓度X总体积。采用SPSS16.0统计软件处理，所有数 据采用均数士标准差(7 士S)表示，均数比较用单因素方差分析(One-Way AN0VA)作多组 间比较。二、实验结果(1)不同体积稀乙酸沉淀法提取蛋白质的总质量比较表2.不同体积稀乙酸沉淀法提取蛋白质的总质量比较(n = 6，文士S) 注与空白对照组比较:*P<0. 05,**P<0.01 ；与2倍体积组比较:AP<0. 05, AAP < 0. 01。从表2可知，随着稀乙酸体积的逐渐增大，蛋白质总质量有逐渐减少的趋势。与 空白对照组相比，体积比1、1.5、2、4、8、12各组蛋白质总质量均显著下降(P < 0.05，P < 0. 01)；与体积比2组相比，体积比1、1. 5、4、8、12各组蛋白质总质量均无显著差异。(2)不同浓度乙酸沉淀法提取蛋白质的总质量比较表3显示，随着乙酸浓度的逐渐增大，蛋白质总质量先有逐渐减少的趋势，在 0.5%乙酸组达到最低点后有逐渐上升的趋势。与空白对照组相比，0. 15%,0.5%,1%> 5%、25%各组蛋白质总质量均显著下降(P < 0. 05，P < 0. 01)；与0. 15%组相比，0. 05%, 0. 1%,0. 5%、1%、5%、25%各组蛋白质总质量均无显著差异。表3.不同浓度乙酸沉淀法提取蛋白质的总质量比较(n = 6，1 士S)
6 注与空白对照组比较*P < 0. 05,**P < 0.01 ；与0. 15%乙酸组比较AP < 0. 05，aaP < 0. 01。临床上粘蛋白定性检查(Rivalta试验)原理为粘蛋白是多糖和蛋白质形成的复 合物，其PH为3-5，亦称酸性糖蛋白，其在大量稀乙酸溶液中呈白色云雾状沉淀。在本次体 积梯度实验中，虽然与体积比2组相比，体积比1、1.5、4、8、12各组蛋白质总质量均无显著 差异，但可以观察到随着稀乙酸体积的逐渐增大，去除粘蛋白后蛋白质溶液总质量有逐渐 减少的趋势，即稀乙酸体积越大，其去除粘蛋白的效率越高。但在后续实验中还需进行透析 浓缩，倘若稀乙酸体积过大，就会增加实验成本、延长实验时间。所以综合分析其利弊得失， 我们选取稀乙酸体积比2组作为最优体积比进行实验。在本次浓度梯度实验中，与空白对 照组相比，0. 15 %、0. 5 %、1 %、5 %、25 %各组蛋白质总质量均显著下降，而以上各组间蛋白 质总质量均无显著差异。但在后续实验中还需进行透析以去除盐离子，倘若稀乙酸浓度过 大，就会增加溶液中盐离子的浓度不利于实验；同时也会降低溶液中的PH可能会对溶液中 其它蛋白质产生不利影响。所以综合分析其利弊得失，我们选取稀乙酸体积浓度0. 15%组 作为最优浓度进行实验。
权利要求
一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)收集唾液；2)将收集的唾液于4℃，800g离心15min，吸取上清液；3)加入体积浓度为0.05％-5％的稀乙酸，混匀；4)4℃，14000g离心60min，吸取上清液；5)将上清液放入透析袋中用双蒸水透析5h；6)浓缩，得到唾液蛋白样品。
2.根据权利要求1所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的 稀乙酸的体积浓度为0. -0. 5%。
3.根据权利要求1所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的 稀乙酸的体积浓度为0. 15%。
4.根据权利要求1所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的 稀乙酸体积为步骤2)中吸取的上清液体积的1-4倍。
5.根据权利要求1所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤3)中加入的 稀乙酸体积为步骤2)中吸取的上清液体积的2倍。
6.根据权利要求1所述的一种唾液蛋白样品的制备方法，其特征在于步骤6)所用的浓 缩剂为聚乙二醇20000。
全文摘要
一种唾液蛋白样品的制备方法，属于蛋白质样品制备技术领域，其特征在于包括以下步骤1)收集唾液；2)将收集的唾液于4℃，800g离心15min，吸取上清液；3)加入体积浓度为0.05％-5％的稀乙酸，混匀；4)4℃，14000g离心60min，吸取上清液；5)将上清液放入透析袋中用双蒸水透析5h；6)浓缩，得到唾液蛋白样品。本发明具有蛋白回收率高、制备时间短、安全无毒、增加低丰度蛋白上样量、图谱清晰易于分析等优点。
文档编号G01N1/28GK101871857SQ201010201790
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者丁慧登, 卢德赵, 曲建全, 温成平, 范永升, 谢志军 申请人:浙江中医药大学