专利名称：一种利多卡因分子印迹固相萃取柱的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物分析领域，具体地说是涉及一种利多卡因分子印迹固相萃取 (MISPE)柱及制备方法，并主要用于生物样品中利多卡因的高选择性分离、富集和纯化。
背景技术：
盐酸利多卡因，简称利多卡因，化学名为2- 二乙氨基-N- (2，6- 二甲基苯基)乙酰 胺盐酸盐一水合物，属氨酰基酰胺类中效局麻药，主要用于神经及硬膜外阻滞麻醉。血中质 量浓度超过5μ g/mL时，则出现毒性症状[临床麻醉药理学、北京人民卫生出版社，2000 33]。由于生物样品中许多内源性物质的存在，使得样品净化成为必要步骤。目前，生 物样品中的盐酸利多卡因前处理手段较多，如溶剂萃取和固相萃取法，结合毛细管电泳、气 相色谱质谱法或高效液相色谱法。溶剂萃取法需要大量的有机溶剂，耗时且存在严重的基 体干扰，其它方法的仪器昂贵。固相萃取法(SPE)出现于20世纪70年代，至今已成为许多 领域样品预处理的常用方法。传统的SPE吸附剂选择性不佳，在富集分析物过程中存在大 量基体和干扰物质。因此，发展快速、高效、高选择性、环境友好的样品前处理技术非常重 要[中国科学B辑化学，2009，39 (8) :733]。分子印迹聚合物(MIP)是为模板分子量身定 做的高分子聚合物，具有预定性、实用性和识别性等特点[Chemistry of Materials, 2008, 20(3) 859 ；Anal.Chem. ,2009,81(4) :1615]。由于模板选择的多样性，使得MIP能广泛应 用于物质的分离与分析过程，它对于目标物质的高度选择性也是普通SPE填料所不能比拟 的[分析化学，2007，35 (9) 1319 ；AnalyticalLetters, 2009,42 (3) :600]。目前关于利多 卡因MISPE柱的制备未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利多卡因MISPE柱及制备方法 和应用，以高效地选择性分离富集血清、血浆等生物样品提取液中的利多卡因，结合光度法 或高效液相色谱即可实现生物样品中利多卡因的快速分析。为实现上述目的，本发明以利 多卡因为模板，衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，以N，N-二甲基甲酰 胺为致孔剂，偶氮二乙丁腈为引发剂，进行聚合制备出MIP后，填充在固相萃取柱内得利多 卡因MISPE柱。仪器与试剂UV-2450紫外可见分光光度计、LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)； Inertsil 0DS-SP (5 μ m，4. 6X 250mm) C18 色谱柱；HumanpowerIII 超纯水处理器(韩国)； HC-2518微量高速离心机(安徽中科中佳科学仪器)；5S1020固相萃取仪(北京振翔工贸 有限公司)。利多卡因(LD)、衣康酸(纯度>98.0% ,Sigma-Aldrich公司)，盐酸胺碘酮(AD)、 N，N- 二甲基苯胺(C。，纯度> 98. 0%，杭州大阳化工有限公司)，N, N- 二甲基甲酰胺(DMF，色谱纯，天津光复精细化工研究所)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析纯，百灵威化学技 术有限公司)，偶氮二乙丁腈(AIBN，化学纯，上海试剂厂)，N' - (2，6 二甲基苯基)-N，N-二 乙基乙二胺(C1,自制)，其它试剂均为分析纯。
四
附图1为利多卡因乙腈溶液在MIP与非印迹聚合物(NIP)上的吸附量随浓度变化 曲线。附图2为1. Omg/L利多卡因溶液HPLC图2a为利多卡因标准品溶液；2b为利多卡 因血清提取液_未经过MISPE柱；2c为利多卡因血清提取液-经过MISPE柱。
五具体实施例方式A)将模板、功能单体、交联剂、引发剂、致孔剂按lmmol :4mmol :16mmol 78. 5mg的 配比置于50mL圆底烧瓶中，充分溶解混勻，超声脱气5min，通氮气15min，于80°C恒温油浴 锅中加热24h。B)将步骤Α)制备的聚合物磨碎成粉末，粉末过筛，收集粒径在38 75 μ m的聚合 物，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/V)溶液洗至无利多卡因检出，继续用甲醇洗 去乙酸，最后真空干燥至恒重，得利多卡因MIP颗粒。用HPLC评价多卡因MIP颗粒的选择性。将洗涤过的MIP颗粒干法装填于不锈钢 色谱柱(50mmX 4. 6mm)中，以乙腈为流动相，流速0. 4mL/min,色谱柱温25°C，波长262nm检 测。以丙酮测量死时间。模板分子的乙腈溶液1.0g/L，每次进样10 μ L，结果表明制备的 MIP对利多卡因具有高的亲和性和选择性。表HPLC评价利多卡因MIP选择性 AD 胺碘酮；C。N，N-二甲基苯胺；C1 - (2，6 二甲基苯基)-N，N-二乙基乙二胺C)称取IOOmg上述利多卡因MIP颗粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上 放置聚乙烯塞板，制得本发明的利多卡因MISPE柱。D)取空白牛血清0.3mL样品，置具塞离心管中，精密加入1. Og/L利多卡因的水溶 液0. 3mL,涡旋混勻lmin，加入乙腈2. 4mL混勻，后于4000r/min离心30min除去蛋白质，精 密量取上清液1. OmL作为生物样品提取液。将MISPE柱用2mL乙腈活化后，加入上述提取液 l.OmL，用5%甲醇-乙腈ImL淋洗，5%盐酸-甲醇ImL洗脱MISPE柱两次，洗脱液于45°C 用N2吹干，用HPLC测定。HPLC测定条件甲醇:pH = 4.0 (40 60, ν/ν)为流动相，流速为 1.0mL/min，检测波长为210nm，柱温为31. 9°C，20 μ L进样。
权利要求
一种利多卡因分子印迹固相萃取(MISPE)柱，其特征是固相萃取柱中填充有利多卡因分子印迹聚合物(MIP)颗粒。
2.如权利要求1所述的利多卡因MISPE柱，其特征在于上述利多卡因MIP颗粒大小为 38 75ym0
3.利多卡因MISPE柱的制备方法，其特征在于包括以下步骤Α)将利多卡因0. 2343g (Immol)、衣康酸0. 5204g (4mmol)、乙二醇二甲基丙烯酸酯 3. 1715g(16mmol)，偶氮二乙丁腈 0. 0785mg, N, N- 二甲基甲酰胺 3. 9262g 置于 50mL 圆底烧 瓶中，充分溶解混勻，超声脱气5min，通氮气15min，于80°C恒温油浴锅中加热24小时，得到 块状聚合物。将块状聚合物用研钵磨碎，过筛收集得到粒径在38 75 μ m,含有利多卡因的 MIP颗粒；B)将上述含有利多卡因的MIP颗粒，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/V)溶 液洗至无LD检出，继续用甲醇洗去乙酸，再经甲醇反复沉降，滤去甲醇，将获得的颗粒物真 空干燥至恒重，即为利多卡因MIP颗粒；C)称取IOOmg上述利多卡因MIP颗粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上放置 塞板，制得利多卡因MISPE柱。
4.如权利要求1所述的利多卡因MISPE柱，其特征在于将上述利多卡因MIP颗粒填充 在聚丙烯固相萃取柱内得利多卡因MISPE柱。
5.如权利要求1所述的利多卡因MISPE柱用途，其特征在于利用该利多卡因MISPE柱 分离富集生物样品中的利多卡因。
6.如权利要求5所述的利多卡因MISPE柱的用途，其特征在于用该利多卡因MISPE柱 分离富集血清(或血浆)样品利多卡因提取液，以乙腈为上样溶剂、5%甲醇-乙腈为淋洗 剂、5%盐酸-甲醇洗脱剂。
7.如权利要求6所述的利多卡因MISPE柱应用于血清(或血浆)样品利多卡因提取 液，其特征在于上述血清样品利多卡因提取液制备方法是取空白牛血清0. 3mL样品，置具 塞离心管中，精密加入1. Og/L利多卡因的水溶液0. 3mL，涡旋混勻lmin，加入乙腈2. 4mL混 勻，后于4000r/min离心30min除去蛋白质，精密量取上清液1. OmL作为生物样品提取液。全文摘要
本发明涉及吸附材料的制备及其在药物分离、富集中的应用，是一种利多卡因分子印迹聚合物和利多卡因分子印迹固相萃取柱的制备及其应用。该分子印迹聚合物以利多卡因为模板，衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，N，N-二甲基甲酰胺为致孔剂，采用本体聚合法合成分子印迹聚合物，将分子印迹聚合物颗粒均匀填充于固相萃取柱内，得到利多卡因分子印迹固相萃取柱。本发明实现了生物样品中利多卡因的高效分离、富集与纯化，与以往普通溶剂萃取法、C18固相萃取法等相关技术相比，选择性高，并且利多卡因分子印迹固相萃取柱可以重复使用，成本低，可望成为生物样品中利多卡因前处理的必备手段。
文档编号G01N1/34GK101905150SQ20101022814
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者刘翠, 吐尔洪·买买提 申请人:新疆大学