专利名称：土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明属于化学物质残留量检测技术，尤其涉及土壤中土霉素残留量的高效液相 色谱检测方法。
背景技术：
近年来，随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的发展，四环素类、大环内酯类、 青霉素类、氨基糖类和磺胺/甲氧苄氨嘧啶类抗生素作为饲料添加剂越来越被广泛地 应用于畜禽养殖业和水产养殖业中。据统计，欧共体每年养殖业中抗生素的消耗量已 达5000多吨；美国每年动物养殖业中抗生素的用量约为11，000多吨，约占抗生素总用 量的70%左右；我国抗生素用量约为美国的600倍左右。在所使用的抗生素中，土霉素 (Oxytetracycline, 0TC)和四环素(Tetracycline)等四环素类抗生素是应用最广泛、使 用量最大的一类抗生素。我国畜禽粪便土霉素含量平均为9.09mg/kg。另据报道，我国农 村每年畜禽粪便产生量约达40亿吨，80 %以上的畜禽粪便没有经过综合处理，而直接被施 于农田，经动物粪便排出的各种抗生素及其代谢产物极易进入农田土壤环境中，导致各种 抗生素尤其是土霉素等四环素类抗生素在土壤环境中的累积，从而降低土壤生物活性，进 而减弱土壤的生物功能。因此，急需建立一种适合于检测土壤中土霉素等四环素类抗生素 残留的方法，以探明和摸清我国农田土壤中四环素类抗生素的残留及转化，从而实现我国 农产品安全和农业可持续发展。然而，目前关于介质中土霉素等抗生素残留的测定方法大 多是基于畜禽蛋肉、乳制品、动物组织、水产品、饲料和蜂胶等介质中四环素类抗生素中的 提取及测定建立起来的，如猪肉中四环素类药物残留的测定方法(王立君，赵健，杨挺.固 相萃取一高效液相色谱法测定猪肉中四环素类药物的残留[J].现代农业科技，2006 (11) 120-121)；肉类及水产品中四环素类抗生素残留量的测定方法(许传梅，星玉秀，董琦，皮 立，肖远，胡凤祖.肉类及水产品中四环素类抗生素残留量的高效液相色谱测定方法[J]. 分析实验室，2007，12 (26) 258-260)；饲料中土霉素的测定方法(宋慧敏，耿士伟，冯三令， 储瑞武，冯群科，贾书静.高效液相色谱法测定饲料中土霉素[J].中国农业科学与技术，
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发明内容
本发明的目的是弥补现有技术中无法快速、准确检测土壤中土霉素的缺陷，提供 一种土壤中土霉素提取且测定残留量的方法，以期为探明土霉素在农田土壤中的残留及其 转化提供方法依据。本发明的技术方案为土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，包括如下 步骤(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA-McIlvaine ；(2)提取土壤样品中的土霉素在干燥土壤样品中加入提取缓冲液 Na2EDTA-McIlvaine,混合均勻，提取、离心获得的上清液即为土霉素待测液；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液干燥后加入流动相，提取过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。土霉素的提取方式为超声提取。每次超声提取的时间为3-20分钟。最优为8分钟。所述提取缓冲液的加入量为一份2g的土壤样品中共加入10_20ml的提取缓冲液。所述土壤样品中的土霉素提取，一份土壤样品进行三次提取，三次提取获得的上 清液混合后为土霉素待测液。所述第(5)步骤中用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量，其色谱条件为流动相乙腈/O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液的pH值为2_3 ；恒速洗脱流速范围为0. 8-1. 5ml/min ；柱温25°C_30°C ；检测器紫外检测器，检测波长350nm ；进样进样量为20 μ 1。所述流动相的乙腈和0. 01mol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15 85-90。所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10 90，磷酸二 氢钠溶液的PH值为2. 5.所述恒速洗脱的最优流速为1. 2ml/min。有益效果应用本方法进行土壤中土霉素残留的测定，操作简便，准确度高，土霉素含量与峰 面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析 的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、灵敏度、检出限等 在各种土壤中都有较好的准确度和精密度。
图1是5%高氯酸作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影响；
图2是0. lmol/L EDTA-Mcllvaine作为缓冲提取液对土壤中土霉素分离效果的影 响；图3是流动相为甲醇乙腈0. 01mol/L草酸时对土霉素分离效果的影响；图4是流动相为乙腈0. 01mol/L NaH2PO4对土霉素分离效果的影响；图5是流动相中乙腈0. 01mol/L NaH2PO4的比例为15 85时对土霉素分离效 果的影响；图6是流动相中乙腈0. 01mol/L NaH2PO4的比例为10 90时对土霉素分离效 果的影响；图7是流动相的pH为2. 0时对土霉素分离效果的影响；图8是流动相的pH为2. 5时对土霉素分离效果的影响；图9是流动相的pH为3. 0时对土霉素分离效果的影响；图10是流动相的流速为0. 8ml/min时对土霉素分离效果的影响；图11是流动相的流速为1. Oml/min时对土霉素分离效果的影响；图12是流动相的流速为1. 2ml/min时对土霉素分离效果的影响。
具体实施例方式下面结合具体实验进一步阐述本发明的方法。材料供试土壤供试土壤为潮土、红壤和紫色土 3种土壤。3种土壤均为未受土霉素等抗生素污 染的农田耕层(0 20cm) 土壤，土壤采集后，风干，过2mm筛备用。土壤基本理化性状见表 1。表1供试土壤基本理化性质 主要仪器与试剂安捷伦1100型高效液相色谱仪；Speedisk Column H2O-Philic DVB萃取小 柱3ml，IOOmgi真料；色谱柱Aglient ZORBAX SB-C18 (3. 5 μ m，4. 6mm X 150mm) ； 土霉素 (OxytetracyclineHydrochloride, 0TC)，分子式=C22H24N2O9，分子量496. 90，纯度彡 98% ； 甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；试验用水为超纯水。试验方法(1) 土霉素标准溶液及提取缓冲溶液的配制土霉素标准品溶液的配制精密称取土霉素标准品0. 06g(精确到0. OOOlg)于IOOml容量瓶中，加入少量lmol/L盐酸溶解，然后用超纯水定容至100ml，制成600mg/L标
准品贮备液，4°C保存备用。采用梯度稀释法，将土霉素标准品储备液准确配制成浓度分别为0.4、4、20、40、 80、160和400mg/L的土霉素标准工作液，准确吸取上述标准工作液各0. 5ml，加入2g (精 确到0. OOOlg)风干的空白供试土壤中，使土壤中土霉素含量分别为0. 1,1. 0,5. 0,10. 0、 20. 0,40. 0和100. Omg/kg,每个浓度重复6次，充分混勻，用超纯水调节土壤含水量为土壤 最大田间持水量的80%，于25°C生化培养箱中暗培养平衡12h，获得不同土霉素含量浓度 的土壤样品。Na2EDTA-McIlvaine提取缓冲溶液的配制分别称取柠檬酸(C6H8O7 -H2O) 12. 9g(精 确到 0. OOOlg)、磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20)71. 628g(精确到 0. OOOlg)，EDTA_2Na 37. 2g(精确到O.OOOlg)于IOOmL烧杯中，加少量超纯水溶解后，转移至IOOOmL容量瓶 中，加适量超纯水，用0. lmol/L HCl调节pH至4. 000士0. 005，最后用超纯水定容，即为 EDTA-McIIlvaine提取缓冲液，放于4°C冰箱中保存备用。提取缓冲液的选择直接决定了土霉素残留量的测定，经对比试验，本发明选择了 0. lmol/LEDTA-MclIvaine作为提取缓冲液，见图1和图2的结果对比。图1显示了采用其 他介质土霉素测试方法中较为常用的5%高氯酸作为提取缓冲液时对土霉素分离效果的影 响，图2显示了采用本发明的0. lmol/L EDTA-Mcllvaine作为提取缓冲液时对土霉素分离 效果的影响。图中箭头所指的峰为土霉素峰，在相同条件下，土壤中的土霉素经5%高氯酸 提取后，经HPLC测定后峰面积为285. 56，而经0. lmol/L EDTA-Mcllvaine提取后，峰面积仅 为55. 67，两者相差约5倍。此外，由于四环素类抗生素在强酸性条件下(pH<2.0)，易于 降解为脱水产物，加热时又可转变为差向异构体，而5%高氯酸溶液pH值小于2.0，因此，从 这个意义上讲，选取5%高氯酸溶液作为土壤中土霉素的提取也是不合适的。因此，选用含 有EDTA的弱酸性的0. lmol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取土壤中土霉素残留的提 取液较为合适。(2)提取土壤样品中的土霉素土壤样品中土霉素的提取方法是在干燥土壤样品中加入提取缓冲液 Na2EDTA-McIlvaine,混合均勻，超声提取离心获得上清液即为土霉素待测液。通过以下试 验，获得最佳的提取效果。取两种土霉素浓度的土壤样品，分为20mg/kg组和40mg/kg组；分别称取2g (精确 到0. OOOlg)不同土霉素浓度组的土壤样品于不同50ml离心管(Tl)中；A、确定提取缓冲液加入量试验分三种方式加入提取缓冲液，第一种在2g 土壤中加入IOml 0. lmol/L EDTA-MclIvaine溶液，首先在离心管(Tl)中加入提取缓冲液4ml，旋涡混合30s，3000r/min 超声8min，离心5min，倾出上清液于另一干净的50ml离心管(T2)中；然后在离心管(Tl) 中再加入提取缓冲液4ml，重复上述步骤；第三次在离心管(Tl)中加入提取缓冲液2ml，重 复上述步骤后在离心管(T2)中混合的上清液即为土霉素待测液。第二种在2g 土壤中加入15ml0. lmol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，除第一次加入 5ml，第二次加入5ml，第三次加入5ml外，其余步骤与第一种相同。第三种在2g 土壤中加入20ml0. lmol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，除第一次加入10ml，第二次加入5ml，第三次加入5ml外，其余步骤与第一种相同。试验结果见表2，加入量为15ml时，所得峰面积最大。当土壤中土霉素的添加浓度 为20mg/kg，提取液加入量为IOml时，所得峰面积明显小于15ml和20ml提取液加入量的处 理，而后两者所得的峰面积相差不明显，并且提取液加入量为20ml的峰面积略小于提取液 加入量为15ml的。当土壤中土霉素的添加浓度为40mg/kg时，提取液加入量为15ml时，峰 面积为284. 13，明显高于其他加入量为IOml和20ml时的峰面积。因此，就提取液加入量而 言，选择在2g 土壤中加入15ml提取液是最优的。表2提取液加入量对土霉素出峰面积的影响 B、确定提取过程中超声时间的试验在确定缓冲提取液及其加入量后，将每次土霉素提取过程中的超声时间分别设为 3、8、13和18min(表3)。由表3可知，这些超声时间都能实现土霉素的提取，但不同的超 声时间对土霉素的出峰面积有一定的影响，随着超声时间的延长，土霉素样品的峰面积先 逐渐增加而后降低，不管土壤中土霉素添加浓度为20mg/kg还是40mg/kg，均以超声时间为 Smin时土霉素的峰面积最大。因此，在提取过程中，超声时间Smin更为合适。表3超声时间对土霉素出峰面积的影响 因此，土壤中土霉素的最优提取方法是在装有2g 土壤样品离心管(Tl)中首先 加入 5ml0. lmol/L EDTA-Mcllvainel,旋涡混合 30s，3000r/min 超声 8min，离心 5min， 倾出上清液于另一干净离心管(T2)中，重复上述步骤两次，总共加入15ml0. lmol/L EDTA-Mcllvainel，在离心管(T2)中获得土霉素待测液。对土壤样品中的土霉素进行三次 提取，将三次的上清液混合获得土霉素待测液，每次超声提取的时间为8分钟，提取缓冲液 的加入量为每2g 土壤样品加入10-20ml提取缓冲液，分三次加入。(3)用HLB固相萃取小柱对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液。用Speedisk Column H2O-Philic DVB萃取小柱对上述所得到的待测液进行纯化和洗脱。首先用6ml无水甲醇和8ml提取液对固相萃取小柱进行活化，然后加入待测液，待 待测液全部通过小柱后，用12ml超纯水冲洗固相萃取小柱，之后再用IOml无水甲醇进行洗 脱。(4)洗脱液用氮气流吹干后加入流动相乙腈0. 01mol/L NaH2PO4,其体积比为乙 腈0. 01mol/L NaH2PO4 = 10 90，超声提取后过滤得滤液。将上述收集到的洗脱液，用氮气流在50°C条件下吹干。之后精确加入Iml流动相， 超声lOmin，用0. 45 μ m尼龙微孔滤膜进行过滤，滤液用于HPLC分析。(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。确定色谱条件的试验流动相的选择分别以甲醇乙腈O.Olmol/L草酸和乙腈:0. 01mol/L NaH2PO4为流动相对土 霉素待测液进行分离，结果如图3、4所示。由图3可知，相同条件下，流动相为用甲醇乙 腈O.Olmol/L草酸时，出现连峰现象，不能实现土霉素样品很好的分离；而当流动相为乙 腈0. Olm0VLNaH2PO4时(见图4)，土霉素样品分离效果较好，没有连峰现象，可以较好地 将土霉素样品与杂质分开。图中箭头所指的峰为土霉素峰。参见图5和图6，当流动相中乙腈和0. 01mol/L NaH2PO4溶液的比例分别为 15 85(图5)和10 90(图6)时，均能够在一定程度上实现土霉素样品的分离，虽然乙 腈和(XOlm0VLNaH2PO4溶液的比例为15 85时，土霉素样品峰明显高于10 90，但是当 比例为10 90时，更能实现土霉素样品与杂质的很好分离。故而10 90作为流动相中 乙腈和O.Olmol/L NaH2PO4溶液的比例来分离土霉素样品是更为合适的。图中箭头所指的 峰为土霉素峰。流动相pH的选择在确定了合适的流动相之后，我们发现流动相乙腈O.Olmol/L NaH2PO4中 0. 0ImoVLNaH2PO4溶液的pH值对土霉素的分离效果具有一定的影响，在pH值为2、2. 5、3的 情况下都有出峰(见图7、8、9)，但pH值为2. 5时无连峰现象(见图8)，能够实现土霉素样 品峰与杂质的最好分离，能够更好地满足测定的分离要求。图中箭头所指的峰为土霉素峰。流动相流速的选择由图10、11、12可知，流速可以选择0. 8，1. 0和1. 2ml/min,它们对土霉素样品峰形 没有明显的影响。但对土霉素样品出峰时间是有一定影响的，当流速为1.2ml/min时，土霉 素的出峰时间约为12.8min(见图12)，而当流速为0. 8和l.Oml/min(见图10、图11)时， 土霉素的出峰时间则分别约为19. 9和15. 2min,明显长于土霉素在流速1. 2ml/min时的出 峰时间。由此可见，选择为1.2ml/min作为HPLC检测土霉素样品的流速能够明显缩短土霉 素样品的出峰时间，提高仪器的分析效率，1. 2ml/min的流速为更好选择。根据以上试验，可以确定用高效液相色谱仪测定滤液中的土霉素含量的最佳色谱 条件为色谱柱AglientZORBAX SB-C18 (3. 5 μ m，4. 6mm X 150mm)流动相乙腈0. 01mol/L磷酸二氢钠溶液为10 90，磷酸二氢钠溶液的pH值 为 2.5 ；恒速洗脱流速范围为1. 2ml/min ；
柱温25°C；检测器紫外检测器，检测波长350nm ；进样=HPllOO型自动进样器进样，进样量为20 μ 1。(6)线性回归方程、相关系数、检出限和回收率的计算将不同土霉素含量浓度的土壤样品分别按上述的最优方式进行土霉素的提取 (第(2)步骤)，纯化和洗脱(第(3)步骤)，洗脱液吹干后加入流动相过滤(第(4)步骤)， 滤液用高效液相色谱仪分析(第(5)步骤)，制备标准曲线，并进行回归分析。结果见表4。由表4可知，在此浓度范围内，3种土壤中土霉素含量与峰面积呈良 好的线性关系，不同土壤R值分别为0. 997 (红壤)、0. 995 (紫色土)和0. 987 (潮土)。分 别配制土壤中土霉素含量为5mg/kg的3种土壤样品，每一种土壤做12次重复，以3倍信噪 比(S/N = 3)，求得不同土壤的检出限见表4。本方法测定土壤中土霉素含量的检出限为 0. 09 0. 17mg/kg，其中对潮土中土霉素含量的测定限最低。表4线性回归方程、相关系数和检出限 χ 土壤中土霉素样品浓度(concentration of OTC in soils)，mg/kg ；y 样品峰 MiR (Peakarea of the sample)。将土霉素含量浓度分别为5，50，100mg/kg的3种土壤，每个浓度重复6次，按上 述的最优方式实施(2)、(3)、(4)、(5)步骤后进行测定，计算土霉素的相对回收率和相对 标准偏差(结果见表5)。从表5可知，土壤中土霉素样品的相对回收率介于61.5% 128.8%，其中潮土中土霉素的相对回收率为61. 5% 103.9%，红壤中土霉素的相对回收 率为80. 7% 128.8%，紫色土中土霉素的相对回收率为70. 5% 100.0%。测定的相对 标准偏差介于4. 38. 1%，其中潮土中土霉素测定的相对标准偏差为4. 17.0%， 红壤中土霉素测定的相对标准偏差为7. 28. 2%，紫色土中土霉素测定的相对标准偏 差为11. 9% 38. 1%。由此可见，应用本方法进行土壤中土霉素含量的测定能够得到较好 的准确度和精密度。表5方法的相对回收率与相对标准偏差
权利要求
一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA Mcllvaine；(2)提取土壤样品中的土霉素在干燥土壤样品中加入提取缓冲液Na2EDTA Mcllvaine，混合均匀，提取、离心获得的上清液即为土霉素待测液；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液干燥后加入流动相，提取过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。
2.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 土霉素的提取方式为超声提取。
3.根据权利要求2所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 每次超声提取的时间为3-20分钟。
4.根据权利要求3所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 一份2g的土壤样品共加入10-20ml的提取缓冲液。
5.根据权利要求4所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 一份土壤样品进行三次土霉素的提取，三次提取获得的上清液混合后为土霉素待测液。
6.根据权利要求5所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 每次超声提取的时间为8分钟。
7.根据权利要求1所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量的色谱条件如下流动相乙腈/0. 01mol/L磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液的pH值为2_3 ；恒速洗脱流速范围为0. 8-1. 5ml/min ；柱温25°C -30 °C ；检测器紫外检测器，检测波长350nm ；进样进样量为20 μ 1。
8.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液体积比为10-15 85-90。
9.根据权利要求8所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在于 所述流动相的乙腈和O.Olmol/L磷酸二氢钠溶液的最优体积比为10 90，磷酸二氢钠溶液 的PH值为2.5。
10.根据权利要求7所述的土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其特征在 于所述恒速洗脱的最优流速为1. 2ml/min。
全文摘要
本发明公开了一种土壤中土霉素残留量的高效液相色谱检测方法，其步骤包括(1)配制土霉素标准品溶液和提取缓冲液Na2EDTA-Mcllvaine；(2)提取土壤样品中的土霉素；(3)对土霉素待测液进行纯化和洗脱获得洗脱液；(4)洗脱液吹干后加入流动相，超声提取后过滤得滤液；(5)用高效液相色谱法测定滤液中的土霉素含量。本发明的方法操作简便，准确度高，土霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，回收率、灵敏度、检出限以及相对标准偏差等均能满足残留分析的要求。经实验证明，该方法能用于各种性质差异较大的土壤，其回收率、灵敏度、检出限等在各种土壤中都有较好的准确度和精密度。
文档编号G01N30/02GK101900711SQ20101023368
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者李兆君, 梁永超, 范菲菲 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所