专利名称：血清多肽的质谱检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及血清多肽的质谱检测方法。
背景技术：
胃癌是消化道常见恶性肿瘤之一，2006年，全球新增胃癌病例近93万，死亡70万。 而我国胃癌死亡率男性(40. 8/10万)和女性(18. 6/10万)分别为欧美发达国家的4. 2-7. 9 倍和3. 8-8.0倍。可见我国胃癌死亡率比较高，形势严峻。外科手术是唯一可以治愈胃癌 的方法，由于其诊断时常常处于进展期，从而失去手术彻底切除的机会。因而，早期诊断和 早期治疗对于提高胃癌患者的长期存活率有重要意义。目前胃镜检查是发现早期胃癌的有效手段，但胃镜检查不易被人接受，难于用在 人群普查，因而，寻找一种简单，微创或无创且灵敏度和特异性高的早期胃癌诊断方法是研 究热点，至今仍未找到一种理想的肿瘤标志物。近年来，表面增强激光解吸附离子化/时 1、司 ~ 飞 质ill (surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, SELDI/TOF-MS)被广泛用于胃癌标志物研究。但是用于研究的病例数都比 较有限，因而会有一定的局限性。
发明内容
本发明提供了一种血清多肽的质谱检测方法，对胃癌患者血清多肽进行定量测 定，有利于胃癌的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。一种血清多肽的质谱检测方法，依次包括以下步骤(1)对血清样品进行预处理；(2)将弱阳离子交换型(WCX)磁珠分装到聚合酶链式反应管(PCR管)中，然后将 聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；(3)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管里加入缓冲 液并混合均勻；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓 冲液；所述的缓冲液为40 50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为3. 5 4. 5 ；(4)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入步骤 (1)预处理后的血清样品，混合均勻后静置；(5)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；(6)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入所述 的缓冲液并混合均勻；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管 内的缓冲液；(7)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入洗脱 液，混合均勻后静置；所述的洗脱液为体积百分比为0. 5 的三氟乙酸(TFA)，配制所述 的洗脱液所用的溶剂是色谱级水(HPLC级水)；(8)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，吸取聚合酶链式反应管内的液体；
(9)将步骤(8)中所吸取的液体与饱和芥子酸溶液混合均勻形成混合液，吸取所 述的混合液到基质辅助激光解析电离质谱的靶上，待靶上的溶液结晶后放入质谱仪中进行 检测，得到血清多肽谱图。本发明中，所述的磁珠可以通过商业途径购买得到，比如荷兰MagSi公司的WCX磁 珠，Dynal的WCX磁珠，优选采用直径为Ium 1. 2um的磁珠。本发明中，所述的磁性处理器为内部设有磁铁的装置，可设有各种形状的支架，其 具有磁力并可分离磁珠。当含有磁珠的反应体系放置在磁性处理器上时，在磁力的作用下， 溶液中本来相对均勻分布的磁珠集中在磁极方向，从而达到分离磁珠的目的。本发明中，所述的步骤(1)中所述的预处理的方法如下将血清样本预先保存于-70°C以下，使用时，先在冰上融解后，再以体积比为1 2 的比例稀释在U9缓冲液中(U9缓冲液是指9mol/LUrea，2% CHAPS, 50mmol/L Tris-HCL， PH 9. 0)。通常所述的稀释在小管中进行，如1. 5毫升离心管。本发明中，所述的芥子酸饱和溶液按以下方法配制将每10毫克芥子酸溶于300微升的乙腈和三氟乙酸的水溶液中而成，所述乙腈和 三氟乙酸的水溶液中，乙腈的体积百分比为50%，三氟乙酸的体积百分比为0. 5%，水为色 谱级水(HPLC级水)。本发明中，所述的质谱仪中离子化方式可以为基质辅助激光解吸电离(MALDI)， 例如德国 Bruker 公司的 flex 系列，如 MicroFlex、AutoFlex、UltraFlex 等，Ciphergen biosystems 公司的 SELDI-T0F 等。本发明中，所述的缓冲液优选为50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为4. 5。本发明中，所述的洗脱液优选为体积百分比为1 %的三氟乙酸，配制所述的洗脱液 所用的溶剂是色谱级水。本发明中，优选在每次检测前标准化质控血清监测整个方法体系稳定性，包括所 用试剂和质谱能量。本发明中，优选定期使用分子量校正品校正质谱分子量，通常为每周校正一次。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果通过血清学微创、简便的方法结合质谱分析，检测出特征差异峰，作为早期胃癌的 诊断中的重要检测依据，从而在人群中筛选出高疑患者，然后结合内镜和病理技术做进一 步的确诊，大大提高早期胃癌的发现率。
具体实施例方式下面结合实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。实施例1本发明的血清多肽的质谱检测方法，其具体步骤如下先将选好的磁珠(Dynal公司的WCX磁珠)按32ul/管分装到聚合酶链式反应管 (即PCR管)中(分装前磁珠要混合均勻)，将PCR管放到冰箱里，在4°C的环境下保存待 用；取一分装好磁珠的PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内液体；将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100 μ L 50m mol/L乙酸钠缓冲液(pH值为4. 5)，混合均勻后室温放置3-5分钟，然后把PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后 移除PCR管内的液体，重复上述操作一次；将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100 μ L预处理后制得的血清样品 (预处理过程为将预先保存于-80°C冰箱的胃癌患者血清样本取出10 μ 1在冰上融化，然 后向标记好的1. 5ml离心管中依次加入20 μ LU9缓冲液(9mol/L Urea, 2% CHAPS, 50mmol/ LTris-HCia % DTT，pH9. 0)和10 μ 1融化的血清样本，混勻，室温静置IOmin0然后再加入 360μ 150mmol/L乙酸钠缓冲液混勻)，混合均勻后室温放置10-15分钟；将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内的液体；将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入100 μ L 50mmol/L乙酸钠缓冲液， 混勻后放置3-5min，将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后移除PCR管内的缓冲液，重复 上述操作一次；然后再将PCR管从磁性处理器中取出，向PCR管内加入10 μ L体积百分比为的 TFA,混合均勻后室温放置5min ；接着，将PCR管置于磁性处理器上，1-2分钟后吸取5 μ L PCR管内的液体到另一个 新的PCR管中，同时加入5 μ L饱和芥子酸溶液(即饱和SPA溶液)充分混勻，再吸取1 μ L 该混合液点样到用于SELDI-T0F质谱的专用芯片上，待芯片上的溶液结晶后将该芯片放入 质谱仪中进行检测，并分析分子量和相对含量。质谱仪采用美国Ciphergen biosystems公司的PBS II c型号，测试前先用加有 All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正仪器，使分子量的误差范围在0. 1 %内。芯片阅读仪参数设置如下激光强度185，检测灵敏度8，优化范围1000 15000， 最高分子量50000，芯片上的每个点采集90次。用Ciphergen ProteinChip 3. 2. 1软件收
集数据。实施例2以42例胃癌患者(其中I期12例，II期6例，III期18例，IV期6例，男女各半) 和42人性别年龄匹配的健康人群的血清作为血清样本。采用实施例1相同的方法逐一进 行检测。并对测得的血清多肽谱图进行原始蛋白指纹图谱标准化处理，再采用Biomarker Wizard软件分析，在分子量2000 30000范围内共检测到75个蛋白峰，其中13个峰在胃 癌组与对照健康人群组比较中有极显著差异(P < 0. 001)，不同峰的丰度见表1，表1为42 例胃癌患者与42例健康人群的血清蛋白差异峰。表 权利要求
一种血清多肽的质谱检测方法，其特征在于，依次包括以下步骤(1)对血清样品进行预处理；(2)将弱阳离子交换型磁珠分装到聚合酶链式反应管中，然后将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；(3)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管里加入缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；所述的缓冲液为40～50mmol/L乙酸钠缓冲液，其pH为3.5～4.5；(4)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入步骤(1)预处理后的血清样品，混合均匀后静置；(5)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的液体；(6)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入所述的缓冲液并混合均匀；再将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，移除聚合酶链式反应管内的缓冲液；(7)将聚合酶链式反应管从磁性处理器中取出，向聚合酶链式反应管中加入洗脱液，混合均匀后静置；所述的洗脱液为体积百分比为0.5～1％的三氟乙酸，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水；(8)将聚合酶链式反应管置于磁性处理器上，吸取聚合酶链式反应管内的液体；(9)将步骤(8)中所吸取的液体与饱和芥子酸溶液混合均匀形成混合液，吸取混合液到基质辅助激光解析电离质谱的靶上，待靶上的溶液结晶后放入质谱仪中进行检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的直径为Ium 1.2um。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中所述的预处理的方法如下将血清样本预先保存于-70°C以下，使用时，先在冰上融解后，再以体积比为1 2的比 例稀释在U9缓冲液中。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芥子酸饱和溶液按以下方法配制 将每10毫克芥子酸溶于300微升的乙腈和三氟乙酸的水溶液中而成，所述乙腈和三氟乙酸的水溶液中，乙腈的体积百分比为50%，三氟乙酸的体积百分比为0. 5%，水为色谱级 水。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为50mmol/L乙酸钠缓冲液，其 pH 为 4. 5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗脱液为体积百分比为的三氟乙 酸，配制所述的洗脱液所用的溶剂是色谱级水。
全文摘要
本发明公开了一种血清多肽的质谱检测方法，用磁珠支持基质的方法捕获血清中胃癌多肽组，用磁性分离器分离磁珠及样品，无需离心样品。然后用质谱法分析多肽谱图。本发明的方法可用于正常人与胃癌患者的血清样品检测，其检测结果在早期胃癌的诊断中可以作为重要的检测依据。本发明检测方法准确、方便且快捷。
文档编号G01N27/62GK101936948SQ20101024682
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者余传定, 徐琦, 朱赤红, 许沈华, 郑智国 申请人:浙江省肿瘤医院