专利名称：一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法
技术领域：
本发明属于食品微生物检测领域，具体涉及一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷 菌的方法。
背景技术：
嗜冷菌，是一类最适生长温度等于或低于15°C，最高生长温度不高于20°C的微生 白勺>@禾尔(Morita, Psychrophilic bacteria，《Bacteriological Reviews》，1975，39 (2)， 144-167)。这类微生物广泛的存在于自然界中，与人类的生产生活密切相关。近年来，随着乳品行业的迅速发展，乳制品的产量大幅增加，使得乳制品安全问题 成为人们所关注的焦点之一。在我国的乳品企业中，原料奶从收集到生产加工可能需要在 4°C存放一至数天，这一过程使嗜冷菌在原料奶中大量繁殖，并产生极耐热的蛋白酶和脂肪 酶(即耐热酶)(杜晓明，潘涔轩，赵娟.乳中低温菌的来源、危害及其控制方法；《中国乳 业》，2002，11，28-30)。这些具有活性的耐热酶即使在经过高温处理后仍会有少量残留，残 留的耐热酶在成品奶制品储藏的过程中会继续分解脂肪和蛋白质，从而导致产品品质发生 变化，出现苦味、腐败味、脂肪氧化味或形成胶凝，严重制约了乳品工业的发展。研究发现，乳制品中残留的耐热酶的数量与原料奶中嗜冷菌数量息息相关。若要 保证乳制品的质量安全，就要在生产中了解原料奶中嗜冷菌的污染情况，并且采取措施严 格控制原料奶中嗜冷菌的数量。传统检测嗜冷菌的方法是将样品在7°C下培养10天后进行 计数，此方法虽然结果准确，但是检测方法耗时过长，在实际生产中从检测开始到检测结果 出来，被检测原料奶大多已被制成成品，或已进入市场，为奶制品的质量安全带来隐患。因 此，研发出一种及快速又实用的嗜冷菌检测方法十分必要，已成为乳品行业关注的焦点。国外早在上个世纪七八十年代就开始研究检测原料奶中嗜冷菌数量的方法，如直 接荧光过滤法(DEFT法)、电阻抗法、流动血细胞法、荧光定量法(RCR法)和酶联免疫吸附 测定法(ELISA法)，虽然这些方法都较好的运用了时下的新兴技术，得到的结果与传统的 嗜冷菌检测方法得到的结果有着非常好的相关性。但是从检测时间和检测成本上来说，都 不适合在工业中应用，达不到工厂对于嗜冷菌实时监测的要求。在国内，虽然我国原料奶受嗜冷菌污染问题很突出，但是学术界对于检测原料奶 中嗜冷菌的研究起步还是比较晚的。尽管如此，国内学者还是研究出了一些快速检测原料 奶中嗜冷菌的方法，如王克新等人在“液体乳中嗜冷菌数的测定”一文中对嗜冷菌培养条 件进行了改进，他认为将嗜冷菌培养条件设定为21°C下培养48小时，其在缩短检测时间的 前提下得到的检测结果与传统检测方法得到的检测结果不存在显著性差异(王克新，房国 玉，张丽宏；液体乳中嗜冷菌数的测定；《中国乳品工业》，2007，29 (5)，31-32)。纪振杰等人 在“原料乳中嗜冷菌数的检测方法的比较” 一文中利用了 3M细菌总数测试纸片，对原料奶 中嗜冷菌进行了检测，其检测结果与传统嗜冷菌检测方法结果之间不存在显著性差异，是 一种可取的检测方法；且利用显色剂培养出有色菌落，便于计数(纪振杰，郭德军，王欣；原 料乳中嗜冷菌数的检测方法的比较；《乳品科学与技术》，2007，29 (3)，131-132)。任静和张兰威在“原料乳中嗜冷菌的检测” 一文中则探究了嗜冷菌繁殖过程中产生的耐热脂肪酶与 嗜冷菌数量之间的关系，通过测定该脂肪酶的活力，从而间接检测出嗜冷菌的数量；虽然该 方法得到了嗜冷菌数和酶活之间极显著的线性关系，但是相关系数并不是很高，所以该方 法还需继续探究如何提高菌数和脂肪酶活性之间的线性相关系(任静，张兰威；原料乳中 嗜冷菌的检测；《食品工业科技》，2007，28 (3)，217-220)。以上这些方法都可以作为传统嗜 冷菌检测方法的替代方法，但是由于这些检测方法本身的不足，如检测成本和检测时间的 局限性，使得这些方法很少被应用于乳制品厂对嗜冷菌的实际检测中。氨肽酶法是一种基于革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁上氨肽酶活性的特点而研发 出来的一种快速检测原料奶中嗜冷菌的方法(Cerny，Method for a distinction of Gram negative from Gram positive bacteria,《European Journal of Applied Microbiology)), 1976，3 (3)，223-225)，最早应用于检测冷藏猪肉和冷冻肉糜中嗜冷菌的数 量。由于革兰氏阴性嗜冷菌占冷藏原料奶中嗜冷菌数量的绝大部分，是原料奶中主要的微 生物类群；革兰氏阴性细菌细胞壁都具有氨肽酶，而且活性很高，能够裂解底物；在相同的 条件下革兰氏阳性细菌却不能裂解底物或只表现出很弱的裂解活性。因此，目前也利用氨 肽酶法来检测原料奶中的嗜冷菌的数量，主要是基于革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁的氨肽酶活 性对原料奶中的嗜冷菌的数量进行检测的，多以无色的L-丙氨酸-对硝基苯胺作为氨肽 酶反应的底物，通过革兰氏阴性嗜冷菌细胞壁氨肽酶的作用使底物裂解成对硝基苯胺(黄 色)，用紫外分光光度计测定反应后溶液的吸光值，得出样品中氨肽酶的活性，然后在氨肽 酶活性和嗜冷菌数量之间建立了一种线性关系，依据这个线性关系，就可以通过测定样品 反应后溶液的吸光值，得出样品中氨肽酶的活性，从而推知样品中嗜冷菌的数量(Begofia， et al. , Method for a distinction of Gram negative from Gram positive bacteria, 《European Journal of Applied Microbiology》，1988, 3(3), 223-225 ;Susana, et al. , A rapid method for the estimation of the microbiological quality of refrigerated raw milk based on the aminopeptidase activity of Gram-negative bacteria, ((International Dairy Journal》，2005，15 (1)，79-84)。一般原料奶中嗜冷菌数量越多，革 兰氏阴性嗜冷菌数量就越多，氨肽酶分解底物活性高，底物被分解生成的对硝基苯胺的量 越多，反应后的样品溶液吸光值越高。Begofia和Susana等研究人员利用此方法对冷藏猪肉、冷冻肉糜、冷藏原料奶中 的嗜冷菌进行了检测，得到氨肽酶活性和嗜冷菌数之间良好的线性关系，建立了反应溶液 的吸光值和嗜冷菌数量之间的对应关系，并证明了氨肽酶法和传统的微生物计数方法之间 存在很高的相关性，表明氨肽酶法可以作为一种稳定的、准确的快速检测原料奶中嗜冷菌 的新方法；该利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法的工艺流程图见图1。氨肽酶法具有精确度高，操作简单，成本低且检测时间短等优点，能够满足乳制品 厂的要求。如传统的嗜冷菌检测方法(即嗜冷菌检测国际标准IDF Standard 101A)的检 测时间为10天，而氨肽酶法的检测时间一般为2. 5小时左右，达到了工厂需要快速检测原 料奶中嗜冷菌数量的要求。与其他现有嗜冷菌的检测方法相比，氨肽酶法除了在检测时间 上具有优势，其操作也比其它检测方法简单，不需要检测员具有特殊的检测技巧，检测仪器 也为实验室常见仪器。另外，氨肽酶法是一个基于显色反应的方法，当样品中的微生物数量 达到一定程度时，反应体系就可以呈现出肉眼可见的颜色。如果乳品厂需要定性检测的话，
4只需要肉眼观察反应后体系的颜色的深浅就可大概估算出样品中嗜冷菌的数量，这一点是 其他嗜冷菌检测方法所达不到的。随着技术的不断更新，Susana等人改进的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方 法却不能再被乳品厂继续使用，原因在于用于检测前期从原料奶中提取嗜冷菌的药品已 经停产。能否从原料奶中提取出嗜冷菌成为目前利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法 的关键所在，必须要寻求一种新的嗜冷菌提取方法或者新的快速检测方法。
发明内容
本发明提供了一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，其操作简单、精确 度高且检测快速，适于工业化应用。一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，包括步骤(1)取两份相同且等量的原料奶，将两份原料奶均在温度为3°C 5°C和转速为 8000转/分钟 10000转/分钟的条件下离心15分钟 25分钟，得到两份分为脂肪层、水 层和沉淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉 淀物层溶于PH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(即 Tris-HCl缓冲液)中，再加入L-丙氨酸-对硝基苯胺，相应的得到第一预处理液和第二预 处理液；(3)将第一预处理液在35°C 37°C水浴中振荡2小时 2. 5小时，转速为100转 /分钟 150转/分钟，得到待测液；将第二预处理液在0°C 2°C静置2小时 2. 5小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照 液中分别加入PH值为4. 5 4. 7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在38°C 42°C水浴9分钟 11分钟，然后于转速为3000转/分钟 3500转/分钟的条件下离心12分钟 18分钟，分 别取上清液，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的滤液做对照， 在紫外分光光度计上测定待测液的滤液的吸光值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯 胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。为了达到更好的实验效果，优选所述的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，包括步骤(1)取两份相同且等量的原料奶，将两份原料奶均在温度为4°C和转速为10000转 /分钟的条件下离心20分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀 物层溶于PH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，再加 入L-丙氨酸-对硝基苯胺，相应的得到第一预处理液和第二预处理液；(3)将第一预处理液在37°C水浴中振荡2小时，转速为120转/分钟，得到待测 液；将第二预处理液在1°C静置2小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照液中分别加入PH值为4. 6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在40°C水浴10分钟，然后于转速 为3000转/分钟的条件下离心15分钟，分别取上清液，过滤得到待测液的滤液以及空白对 照液的滤液，以空白对照液的滤液做对照，在紫外分光光度计上测定待测液的滤液的吸光 值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯 胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。步骤(2)中，所述的L-丙氨酸_对硝基苯胺以L-丙氨酸_对硝基苯胺水溶液的 形式加入，更利于反应的进行。所述的L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液的浓度为0.8g/L 1.2g/L，进一步优选Ig/ L0步骤(4)中，所述的吸光值的检测波长为350nm 420nm，进一步优选390nm。所述的Tris-HCl缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般为将12. 114g 的三羟甲基氨基甲烷溶解于约0. 9L水中，加46mL 11. 6N的浓盐酸，用水调整终体积至1L， 其中N为当量浓度，当量浓度=溶质的克当量数/溶液体积(升)。本发明吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺 浓度之间的数量关系，均可采用本领域通用的方法来建立。按照本领域常用的工作曲线绘制方法，一般为取对硝基苯胺标准品，分别用蒸馏 水溶解配制成一系列由低浓度到高浓度的对硝基苯胺标准溶液，在紫外分光光度计上测定 各对硝基苯胺标准溶液的吸光值。根据对硝基苯胺标准溶液中对硝基苯胺的浓度与吸光值 的关系绘制出吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线(即线性方程)。由于氨肽酶利用L-丙氨酸-对硝基苯胺为底物生成有色的对硝基苯胺，所以对硝 基苯胺的浓度就代表了样品中氨肽酶的活性。采用本发明方法测定出已知嗜冷菌数量的原料奶中嗜冷菌数量与氨肽酶活性之 间的数量线性关系。一般为取原料奶于4°C下保存4天，每间隔24小时取样一次，得到原 料奶样品；以质量百分浓度为的蛋白胨水溶液为稀释液将原料奶样品进行梯度稀释， 配制成一系列由低浓度到高浓度的原料奶样品液；将原料奶样品液均勻涂布在已涂有培养 基的平板中，每个浓度的原料奶样品液做3个平行样，置于7°C的生化培养箱中培养10天； 同时做空白对照样；选取菌落数在30 300之间的平板进行计数，计算出同一浓度原料奶 样品液三个平板上菌落数的平均数，乘以相应的稀释倍数得到原料奶中嗜冷菌的数量；同 时用本发明氨肽酶法测定原料奶样品液的吸光值，每个样品重复3次取平均值；依照吸光 值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线计算出每个吸光值对应的对硝基苯胺的浓度，以嗜冷 菌数量为纵坐标，对硝基苯胺的浓度为横坐标做线性方程，得出原料奶中嗜冷菌数量与硝 基苯胺的浓度(即氨肽酶活性)之间的数量线性关系。研究发现，将氨肽酶法应用在对原料奶中嗜冷菌的快速检测中，关键是要对原料 奶样品进行前期处理，破坏其乳化体系，提取出原料奶中的嗜冷菌，并保证菌体成活。由于原料奶是一个乳化体系，其组成成分主要包括水、乳蛋白质、乳脂肪和碳水化 合物等，嗜冷菌均勻的悬浮于原料奶的乳化体系中。为了能够从原料奶的乳化体系中将嗜 冷菌提取出来，本发明先将原料奶进行离心，其离心后分为三层脂肪层、水层和沉淀物层， 其中嗜冷菌菌体和乳蛋白质就存在于沉淀物层中。由于采用的是低温高速离心，所以保证了菌体的回收率和成活率。收集沉淀物层之后，将沉淀物层直接进行氨肽酶反应，根据酶反 应的特点，氨肽酶会与特定的底物(L-丙氨酸_对硝基苯胺)结合，反应后使体系呈现出荧 光黄颜色。但是由于乳蛋白的存在，使得反应体系仍然是混浊的乳液状态，影响下一步吸 光值的测定，所以本发明方法步骤(4)在体系中加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，置于38°C 42°C水浴9分钟 11分钟(优选40°C水浴10分钟)后低速离心，使乳蛋白沉淀下来，上层 液体即为反应后显色的上清液，避免乳蛋白对吸光值的影响。由于活的嗜冷菌已经参与完 氨肽酶反应，所以在步骤(4)这一步不用考虑到嗜冷菌存活率的问题。与Susana等人的氨肽酶法快速检测原料奶中嗜冷菌的方法(简称原始氨肽酶法) 相比，本发明具有如下优点1.原始氨肽酶法是先将嗜冷菌提取出来，再进行氨肽酶反应，这样就需要在提 取时保证嗜冷菌菌体的高成活率，否则后续的检测结果会存在很大的误差；该方法采用 sigma公司的产品提取嗜冷菌，可以在保证嗜冷菌菌体存活的前提下，提取出嗜冷菌活体， 以保证提取时嗜冷菌菌体的高成活率(即活菌回收率)；但是目前这种产品已下线，很难找 到效果相似的替代产品。而本发明方法预先令嗜冷菌与氨肽酶反应，然后再提取清澈的反 应液，避免了预先提取嗜冷菌菌体而存在的活菌回收率高低的问题。2.本发明方法将原料奶前期处理的目标从传统的认为需提取嗜冷菌活菌体转向 了如何除掉体系中的乳蛋白，先使嗜冷菌活菌体的氨肽酶与L-丙氨酸-对硝基苯胺进行氨 肽酶反应，最大限度的保证了嗜冷菌的存活，不用考虑嗜冷菌活菌体回收率高低的问题，只 要考虑如何使反应液澄清就可以了，避免了遇见传统认为较难克服的技术难题，同时也减 小了实验的系统误差。3.本发明方法可利用待测液吸光值与嗜冷菌数量之间的对应关系，对原料奶中嗜 冷菌的数量进行定量检测。4.本发明方法操作步骤简便、精确度高且能够进行快速检测，适于工业化应用。
图1为原始氨肽酶法的工艺流程图；图2为本发明实施例1的工艺流程图；图3为本发明实施例1中原料奶吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线图；图4为本发明实施例1原料奶中嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓度之间的数量关系 图。
具体实施例方式实施例1(1)无菌吸取两份IOml相同的原料奶分别装于无菌离心管中，将两份原料奶均在 温度为4°C和转速为10000转/分钟的条件下离心20分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉 淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀 物层溶于5mL pH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中， 再加入2. 5mL的lg/L L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液，相应的得到第一预处理液和第二预处理液；(3)将第一预处理液在37°C水浴中振荡2小时，转速为120转/分钟，得到待测 液；将第二预处理液在1°C静置2小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照 液中分别加入5mL pH值为4. 6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在40°C水浴10分钟，然后于转 速为3000转/分钟的条件下离心15分钟，分别取上清液，经0. 22微米的微孔滤膜过滤除 去上清液中残留的杂质，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的 滤液做对照，在紫外分光光度计上于390nm测定待测液的滤液的吸光值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及原料奶嗜冷菌数量与对 硝基苯胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。取对硝基苯胺标准品，分别用蒸馏水溶解配制成一系列由低浓度到高浓度的对 硝基苯胺标准溶液，即采用逐级稀释的方式得到对硝基苯胺浓度分别为10μ g/mL、20y g/ mL、30 μ g/mL、40 μ g/mL、50 μ g/mL、60 μ g/mL、70 μ g/mL、80 μ g/mL、90 μ g/mL、100 μ g/mL 的对硝基苯胺标准溶液，分别在紫外分光光度计上于390nm测定上述各对硝基苯胺标准 溶液的吸光值。以吸光值A390(y)为纵坐标，以对硝基苯胺的浓度(χ)为横坐标，绘制 标准曲线，如图3，得到吸光值A390(y)与对硝基苯胺的浓度(χ)之间的回归方程为y = 0. 0087x-0. 0074，R = O. 9993。取10份原料奶于4°C下保存4天，每间隔24小时取样一次，得到10份原料奶样 品，依次编号为1-10号；以质量百分浓度为的蛋白胨水溶液为稀释液，取1号原料奶 样品25mL，加入225mL质量百分浓度为1 %的蛋白胨水溶液，稀释至ICT1倍；从ICT1倍稀释 液中取lmL，加入9mL稀释液中，稀释至10_2倍；按此方法依次稀释，直至将原料奶样品稀释 至10_8 ；其它2-10号原料奶样品的稀释同1号原料奶样品，配制成一系列由低浓度到高浓 度的原料奶样品液；将各原料奶样品液均勻涂布在已涂有培养基的平板中，每个浓度的原 料奶样品液做3个平行样，置于7°C的生化培养箱中培养10天；同时做空白对照样；选取菌 落数在30 300之间的平板进行计数，计算出同一浓度原料奶样品液三个平板上菌落数的 平均数，乘以相应的稀释倍数得到原料奶中嗜冷菌的数量。同时，按上述氨肽酶法测定原料奶样品液的吸光值，每个样品重复3次取平均 值；依照吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线计算出每个吸光值对应的对硝基苯胺 的浓度，以嗜冷菌数量(a)为纵坐标，对硝基苯胺的浓度(χ)为横坐标做线性方程，如图 4，得到原料奶中嗜冷菌数量(a)与对硝基苯胺的浓度(χ)之间的的数量线性关系，a = 0. 032x+5. 507，回归系数 R = O. 962。按上述方法重复测定19次，检测结果如表1。实施例2(1)无菌吸取两份IOml相同的原料奶分别装于无菌离心管中，将两份原料奶均在 温度为5°C和转速为8000转/分钟的条件下离心15分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉 淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀 物层溶于5mL pH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，再加入2. 5mL的1. 2g/L L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液，相应的得到第一预处理液和第二 预处理液；(3)将第一预处理液在35°C水浴中振荡2. 5小时，转速为100转/分钟，得到待测 液；将第二预处理液在0°C静置2. 5小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照 液中分别加入5mL pH值为4. 5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在38°C水浴11分钟，然后于转 速为3500转/分钟的条件下离心12分钟，分别取上清液，经0. 22微米的微孔滤膜过滤除 去上清液中残留的杂质，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的 滤液做对照，在紫外分光光度计上于390nm测定待测液的滤液的吸光值。(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯 胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量，为1. 28X 108cfu/mL。吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓度之 间的数量关系同实施例1。实施例3(1)无菌吸取两份IOml相同的原料奶分别装于无菌离心管中，将两份原料奶均在 温度为3°C和转速为9000转/分钟的条件下离心25分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉 淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀 物层溶于5mL pH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中， 再加入2. 5mL的0. 8g/L L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液，相应的得到第一预处理液和第二 预处理液；(3)将第一预处理液在36°C水浴中振荡2. 2小时，转速为150转/分钟，得到待测 液；将第二预处理液在2°C静置2. 2小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照 液中分别加入5mL pH值为4. 7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在42°C水浴9分钟，然后于转 速为3200转/分钟的条件下离心18分钟，分别取上清液，经0. 22微米的微孔滤膜过滤除 去上清液中残留的杂质，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的 滤液做对照，在紫外分光光度计上于390nm测定待测液的滤液的吸光值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯 胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量，为8.91X108cfu/mL。吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓度之 间的数量关系同实施例1。对比例1(1)取与实施例1中原料奶相同的原料奶，采用传统嗜冷菌检测方法，即将原料奶 均勻涂布在已涂有培养基的平板中，置于7°C的生化培养箱中培养10天；同时做空白对照 样；选取菌落数在30 300之间的平板进行计数，计算出原料奶中嗜冷菌的数量。按上述方法重复测定19次，检测结果如表1。
对比例2除了取与实施例2中原料奶相同的原料奶之外，其余操作同对比例1，测得原料奶 中嗜冷菌的数量为1. 32X 108cfu/mL。对比例3除了取与实施例3中原料奶相同的原料奶之外，其余操作同对比例1，测得原料奶 中嗜冷菌的数量为9. 03X 108cfu/mL。表1传统的嗜冷菌检测方法和本发明氨肽酶法检测结果
权利要求
一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，包括步骤(1)取两份相同且等量的原料奶，将两份原料奶均在温度为3℃～5℃和转速为8000转/分钟～10000转/分钟的条件下离心15分钟～25分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀物层溶于pH值为8.0且浓度为0.1mol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷 盐酸缓冲液中，再加入L 丙氨酸 对硝基苯胺，相应的得到第一预处理液和第二预处理液；(3)将第一预处理液在35℃～37℃水浴振荡2小时～2.5小时，转速为100转/分钟～150转/分钟，得到待测液；将第二预处理液在0℃～2℃静置2小时～2.5小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照液中分别加入pH值为4.5～4.7的醋酸 醋酸钠缓冲溶液，均在38℃～42℃水浴9分钟～11分钟，然后于转速为3000转/分钟～3500转/分钟的条件下离心12分钟～18分钟，分别取上清液，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的滤液，以空白对照液的滤液做对照，在紫外分光光度计上测定待测液的滤液的吸光值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。
2.如权利要求1所述的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，其特征在于，包括 步骤(1)取两份相同且等量的原料奶，将两份原料奶均在温度为4°C和转速为10000转/分 钟的条件下离心20分钟，得到两份分为脂肪层、水层和沉淀物层的离心物；(2)分别除去上述两份离心物中的脂肪层和水层并收集沉淀物层，将收集的沉淀物层 溶于PH值为8. 0且浓度为0. lmol/L的无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，再加入 L-丙氨酸-对硝基苯胺，相应的得到第一预处理液和第二预处理液；(3)将第一预处理液在37°C水浴中振荡2小时，转速为120转/分钟，得到待测液；将第二预处理液在1°C静置2小时，作为空白对照液；(4)将上述待测液和空白对照液按以下步骤进行相同处理在待测液和空白对照液中 分别加入PH值为4. 6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，均在40°C水浴10分钟，然后于转速为3000 转/分钟的条件下离心15分钟，分别取上清液，过滤得到待测液的滤液以及空白对照液的 滤液，以空白对照液的滤液做对照，在紫外分光光度计上测定待测液的滤液的吸光值；(5)通过吸光值与对硝基苯胺浓度之间的标准曲线，以及嗜冷菌数量与对硝基苯胺浓 度之间的数量关系，得出原料奶中嗜冷菌的数量。
3.如权利要求1或2所述的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，其特征在于，步 骤(2)中，所述的L-丙氨酸-对硝基苯胺以L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液的形式加入。
4.如权利要求3所述的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，其特征在于，所述 的L-丙氨酸-对硝基苯胺水溶液的浓度为0. 8g/L 1. 2g/L。
5.如权利要求1所述的利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，其特征在于，步骤 (4)中，所述的吸光值的检测波长为350nm 420nm。
全文摘要
本发明公开了一种利用氨肽酶法检测原料奶中嗜冷菌的方法，该方法预先将原料奶离心处理，除去其中的脂肪层和水层，得到富含嗜冷菌菌体和乳蛋白质的沉淀物层；在无菌三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中将沉淀物层中的嗜冷菌活菌体的氨肽酶与L-丙氨酸-对硝基苯胺直接进行氨肽酶反应，最大限度的保证了嗜冷菌的存活，然后再除掉体系中的乳蛋白，提取清澈的反应液，避免了预先提取嗜冷菌菌体而存在的活菌回收率高低的问题，减小了实验的系统误差，同时可利用待测液吸光值与嗜冷菌数量之间的对应关系，对原料奶中嗜冷菌的数量进行定量检测。
文档编号G01N21/33GK101943660SQ20101025392
公开日2011年1月12日 申请日期2010年8月13日 优先权日2010年8月13日
发明者刘东红, 叶兴乾, 吕元, 吴丹, 唐佳妮, 陈健初 申请人:浙江大学