专利名称：阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测阪崎肠杆菌的方法，以及用于该方法的阪崎肠杆菌金标 快速诊断试剂盒和其制备方法。
背景技术：
近年来，世界范围重大食品安全事件频频发生，疯牛病、葡萄球菌肠毒素牛奶中 毒、苏丹虹、二恶英、三聚氰胺等事件对全球经济和社会政局稳定造成巨大影响。在诸多食 品安全实践中，婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌污染备受关注。阪崎肠杆菌(E. sakazakii)是近年来从奶粉(乳)制品中发现的、在一定条件下 可使人致病的一种食源性致病菌，属于肠杆菌属肠杆菌科的一种周生鞭毛、能运动的革兰 氏阴性无芽孢杆菌，1980年由黄色阴沟菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌是肠道正常菌群 的一种，在一定条件下可引起人和动物致病。阪崎肠杆菌在自然界的污染来源尚不清楚，但它在食品中分布较广泛，主要危害 对象是婴儿，尤其是新生儿、早产儿、低出生体重儿或免疫力低下新生儿，可引起严重的菌 血症、脑膜炎、小肠结肠炎、造成严重的神经系统后遗症和死亡，感染死亡率高达20-50%， 在某些情况下可达40-80%。2004年世界粮农组织和世界卫生组织经过风险性评估将阪崎 肠杆菌和沙门氏菌共同列为婴幼儿配方奶粉A类致病菌。世界粮农组织和世界卫生组织通报，在不同地区，婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌 检出率在2-22. 7%之间。因此，食源性阪崎肠杆菌污染已引起各国政府高度关注，加强了乳 品生产及进出口环节检测，国外乳业巨头所生产产品曾因检出阪崎肠杆菌而被召回。阪崎 肠杆菌的生物学特征和检测检验技术已成为学术界、政府和企业关注的热点，已建立了实 时荧光定量PCR技术国际通用检测标准，我国于2005年由中国检验检疫研究院和天津检疫 检验局牵头完成了《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准，并已实施。实时荧光定量PCR 技术具有荧光定量PCR反应过程实时检测、荧光定量重复性好、基因分析稳定性好、荧光检 测浓度梯度实验性范围宽、热循环升温快速、荧光定量在对数期进行定量分析等优势。其检 测林敏度高、特异性强。但该方法还存在检测设备昂贵、操作技术要求高、样本污染易造成 假阳性等不足。目前检测阪崎肠杆菌的方法主要是通过常规生化鉴定、血清学检测和PCR测定法。国际检测阪崎肠杆菌的标准生化方法是美国食品和药品管理局(FDA)的检测方 法，对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌分离与计数，用“三管法”增菌可检测样品中微量的阪崎 肠杆菌并定量，检测时至少需要333g样品。我国目前尚无该菌检测方法的国家标准，只有 行业标准。其中改进的传统方法与FDA方法比较，检测结果一致，但效率大大提高，时间缩 短了 1/3 1/2。尽管如此，常规检测方法仍存在耗时较长，对检验员的要求较高，假阴性较 高的弊端。血清学检测成本低廉，易于操作，制备多克隆抗体可用于辅助常规生化检测，快速进行中毒诊断。我国国家标准目前仍然使用血清学鉴定的方法用于沙门氏菌、志贺氏菌的 分型。血清学检测的缺点是易产生交叉反应，不适合作为独立的检测方法应用。分子生物学尤其是PCR技术的发展给阪崎肠杆菌的快速检测提供了广阔的空间。 除了普通PCR方法和荧光PCR方法，还有依据该菌生理生化特征建立的分子检测方法。随 机扩增多态性DNA(RAPD)、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、染色体DNA分析、核糖核酸分型以及 质粒分型等也都已用于对阪崎肠杆菌分型研究。但PCR法检测费用昂贵，对仪器设备及检 测环境的要求很高。阪崎肠杆菌感染具有发病急，致死率高等特点，同时该菌的自然来源非常广泛，并 且目前对其致病机制还不是很清楚，虽然近年来相关检测技术取得了很大的进展，但仍然 存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感染 的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常关键。本发明采用阪崎肠杆菌免疫家兔或羊制备多表位抗体，免疫BALB/c小鼠制备单 克隆抗体，研制一种可适用于现场操作的金标快速诊断试剂盒，本试剂盒可特异性的检测 阪崎肠杆菌，检测快速(5-20分钟出结果)，可用于发病现场快速诊断。本发明的公开本发明的第一目的是提供一种阪崎肠杆菌的检测方法，该方法为一步检测法，灵 敏度高、特异性强，而且反应速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学 调查和场地检疫等多种场合。本发明的第二目的是提供一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒，是针对阪崎肠 杆菌检测提供的一种简便而且直接的一步法检测试剂盒，利用该试剂盒检测阪崎肠杆菌的 灵敏度高、特异性强，速度快、操作简便，无需专门设施。本发明的第三目的是提供一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，该 方法简便、稳定性好、重复性好。本发明的第一目的可通过如下措施来实现一种阪崎肠杆菌检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗阪崎肠杆菌抗体 载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗阪崎 肠杆菌抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶 体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有阪崎肠杆菌则在检测载体上形成检测线、控制 线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线显色，结果判定为阴性。本发明的第二目的可通过如下措施来实现一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒内设阪崎肠杆菌金标检测卡组成。检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内。所述的阪崎肠杆菌金 标检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水 层之间设有金标阪崎肠杆菌抗体层，在检测层上包被有由抗阪崎肠杆菌单抗形成的检测线 和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。本发明的第三目的可通过如下措施来实现一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层和检 测层的控制线，检测线的包被，然后再衬板上组合阪崎肠杆菌金标测试条和检测板。所述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0. 005-0. 012%的氯金酸中加入其体积的1. 3-2%、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸10-20 分钟，可得到15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗阪崎肠杆菌抗体，在胶体金溶液中 用0. 2M碳酸钾溶液调pH7. 6-8. 6，按2-8mg/100ml加入阪崎肠杆菌抗体，搅拌后，再在溶液 中按0. 1-0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii将上述胶体金溶液经2000 转/分钟离心10-15分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60-80 分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体 金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6%的动物血清蛋白和0. 01-0. 06%叠氮钠；vi将胶体金溶液 浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，37°C干燥过夜形成金标抗体层。所述的检测 层的制备是在纤维素膜上设有阪崎肠杆菌抗体构成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成 的控制线。其制备方法是浓度为l_2mg/ml的或抗体溶液中加入的固定剂，再利用喷 膜机将抗体喷在纤维素膜上，喷膜后37°C干燥，再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS， 在37°C下封闭30分钟，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。所述的固定剂选用甲醛、丙酮中的一种。本发明相比现有技术具有如下优点1、本发明检测、诊断阪崎肠杆菌的方法为一步法，具有较高的特异性和灵敏性，且 操作简便，无需专门设施。2、本发明的诊断试剂盒检测阪崎肠杆菌时具有较高的特异性和灵敏性，检测过程 操作迅速、快捷、方便，适用于临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合。3、本发明的诊断试剂盒的制备方法简便、稳定性好、重复性好。图面说明
图1是发明检测板的外观结构示意图1-检测板 2-加样孔 3-检视窗图2是本发明检测板的内部结构示意图4-加样端吸水层 5-金标抗体层 6-控制线 7-检测线8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板本发明的实施方式本发明还将结合实施例作进一步详述实施例一一种阪崎肠杆菌检测方法包括下述步骤(1)将胶体金标记的抗阪崎肠杆菌抗体 载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被阪崎肠 杆菌抗体形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取样品稀释液滴于胶 体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有阪崎肠杆菌则在检测载体上形成检测线、控制 线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线显色结果判定为阴性。参照图1，一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒内设阪崎肠杆菌金标检测卡1。参照图2，所述的阪崎肠杆菌金标检测卡1是在衬板10上设有加样端吸水层4、检 测层8和吸水端吸水层9，在检测层和加样端吸水层4之间设有金标阪崎肠杆菌抗体层5， 在检测层8上包被有检测线7和控制线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层 滤纸制成；检测层8为纤维素膜，该纤维素膜可为硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜；金标抗体 层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体制成。
一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法主要包括制备金标抗体层(5) 和检测层(8)的质控线(6)、检测线(7)的包被，然后再衬板(10)上组合阪崎肠杆菌金标测 试条和检测卡(1)。在塑料垫板10的两端分别粘贴加样端吸水层4和吸水端吸水层9 ；在 其中段粘贴包被检测线和控制线的纤维素膜层8，在加样端吸水层4与纤维素膜层8的交接 部位，夹贴含金标抗体层5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层4中间，1/5 部分在纤维素膜层8上。然后按4毫米宽、8厘米长规格切条，在组装于塑料盒内。盒盖上 加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。所述的金标抗体层5的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，取IOOmg氯金 酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、浓度为的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到 15-50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记阪崎肠杆菌抗体，取IOOml胶体金溶液，用0. 2ml 碳酸钾溶液调PH8. 4，加入6mg阪崎肠杆菌抗体，搅拌20分钟，再加入MOmg牛血清白蛋白， 继续搅拌5分钟，4°C静置2-4小时；iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10分钟， 弃沉淀物，收集上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟离心收集沉淀物；ν将 沉淀物按^iVlOOml溶于0. 02M、pH7. 4的Tris-HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含 0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%叠氮钠；vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体 开始渗出为止，在37°C下2小时干燥而形成金标抗体层5。所述胶体金标记抗体为羊、兔抗 阪崎肠杆菌抗体。所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有阪崎肠杆菌抗体构成的检测线7和由 羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线6。其制备方法是取抗阪崎肠杆菌抗体，调浓度为Img/ ml，加入2 %的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7 ；再取羊或兔抗鼠IgG调浓度 为2mg/ml，加入2%的甲醛，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0. 5cm处，喷控制线6，按 20ul/10cm设置喷膜量，喷膜37°C干燥，2小时，再用0. 01MpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在 37°C下封闭30分钟，0. 01MpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。实施例二 阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒与例一同。该试剂盒的制备方法除制备胶体金标记的抗体为抗阪崎肠杆菌单克隆抗体外，其 他条件与例一同。
权利要求
1.一种阪崎肠杆菌检测方法，其特征在于(1)将胶体金标记的阪崎肠杆菌抗体载于 玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗阪崎肠杆 菌抗体(多抗或单抗)形成的检测线和由羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；( 取检测 样本稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有阪崎肠杆菌，则在检测载体 上形成检测线和控制线双线，显双线结果判定为阳性，仅控制线显色结果判定为阴性。
2.一种阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒内设阪崎肠杆菌金标检 测卡，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡盒内。
3.如权利要求2所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂卡，其特征在于所述的阪崎肠 杆菌金标检测卡⑴是在衬板(10)上设有加样端吸水层G)、检测层⑶和吸水端吸水层 (9)，在检测层⑶和加样端吸水层⑷之间设有金标阪崎肠杆菌抗体层(5)，在检测层⑶ 上包被有检测线(7)和控制线(6)。
4.如权利要求2所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于制备 金标抗体层( 和检测层(8)的控制线(6)、检测线(7)的包被，然后在衬板(10)上组合阪 崎肠杆菌金标测试条和检测卡(1)。
5.如权利要求4所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述 的金标抗体层(5)的制备方法包括下述步骤i胶体金的制备，在浓度为0. 004 0. 012% 的氯金酸中加入其体积的1. 3 2%，浓度为1 3%的柠檬酸三钠，煮沸10 20分钟， 可得到15 50纳米的胶体金溶液；ii胶体金标记抗阪崎杆菌单克隆抗体，在胶体金溶 液中用0. 2m碳酸钾溶液调pH8. 0 8. 4，按4 12mg/100ml加入抗人阪崎杆菌单克隆抗 体，搅拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入动物血清蛋白，4°C静置2_4小时；iii 将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10 15分钟，弃沉淀物，得上清液；iv将上清 液经10000转/分钟离心60 80分钟离心得沉淀物；ν将沉淀物按4-10ml/100ml溶于 0. 02M、pH7. 4Tris-HCI缓冲液得胶体金溶液，该缓冲液中含0. 2-0. 6 %的动物血清蛋白和 0. 01-0. 06%叠氮钠；vi将上述胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止， 37°C干燥过滤形成金标抗体层。
6.如权利要求4或5所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于 所述胶体金标记抗体为羊或兔抗阪崎肠杆菌抗体或阪崎肠杆菌单克隆抗体。
7.如权利要求4所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述 的检测层(8)是在纤维素膜上设有羊或兔抗阪崎肠杆菌抗体或阪崎肠杆菌单克隆抗体构 成的检测线(7)和由抗羊或兔抗鼠IgG抗体形成的控制线(6)。
8.如权利要求7所述的阪崎肠杆菌金标快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于所述 的固定剂为甲醛或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测阪崎肠杆菌的方法，以及用于该方法的金标快速诊断试剂盒和其制备方法，其检测方法包括(1)将胶体金标记的抗阪崎肠杆菌抗体载于玻璃纤维或无纺布载体上，并在与胶体金标记抗体载体相连的检测载体上包被抗阪崎肠杆菌抗体形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线；(2)取样品稀释液滴于胶体金标记抗体的载体上，如上述稀释液含有阪崎肠杆菌，则在检测载体上形成检测线和控制线双线，结果判定为阳性；仅控制线显色，结果判定为阴性。该试剂盒由检测卡组成，检测卡由检测条和塑料卡盒组成，检测条安装在塑料卡内，检测条是在衬板上设有加样端吸水层、检测层和吸水端吸水层，在检测层和加样端吸水层之间设有金标阪崎肠杆菌抗体层，在检测层上包被有由抗阪崎肠杆菌单抗形成的检测线和由羊、兔抗鼠IgG抗体形成的控制线。
文档编号G01N33/577GK102135541SQ201010272890
公开日2011年7月27日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者周海飞, 张远兴, 李克生, 李志远, 杜惠芬, 郑悦, 马国荣 申请人:李克生