专利名称：一种靶向沉默h19rna表达的单链反义rna及其效果检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反 义RNA及其效果检测方法。
背景技术：
基因沉默是指生物体内的特定基因由于各种调控因素的存在导致不能表达或表 达降低的生物学现象，它不仅是生物体调节基因表达、维持正常生理活动的重要方式，同 时也是对特定基因进行功能研究和注释，发掘疾病治疗药物靶点乃至实施疾病基因治疗 的重要途径。目前常用的基因沉默技术主要包括三大类，第一类是反义DNA(antisense oligonucleotide, AS0)技术。反义DNA是指一段能与特定基因的mRNA以碱基互补配对 的方式结合的反义寡核苷酸，能够阻止靶基因的转录或是翻译，从而下调基因表达(Ideue， Τ.，Hino, K.，Kitao, S.，Yokoi, Τ.，and Hirose，Τ. Efficient oligonucleotide-mediated degradation of nuclearnoncoding RNAs in mammalian cultured cells. RNA 2009， 15,1578-1587.)。第二类是反义RNAfentisense RNA)技术。反义RNA是指能与特 定基因的RNA序列互补配对的一段RNA分子，通过造成靶基因RNA的稳定性下降或 是影响mRNA的转录或翻译而沉默基因的表达(Achenbach，Τ. V.，Brunner，B.，md Heermeier, K. Oligonucleotide-based knockdown technologies antisense versus RNAinterference. Chembiochem 2003，4，928—935 ；Beisner,J. ,Dong,Μ. ,Taetz,S. ,Nafee, N.，Griese，Ε. U.，Schaefer, U.，Lehr, C. Μ.，Klotz，U.，andMurdter，Τ. Ε. Nanoparticle mediated del ivery of 2， -0~methyI-RNA leads toefficient telomerase inhibition and telomere shortening in human lungcancer cells. Lung Cancer. ,68,346-354)0 第三类是RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术。RNA干扰是以21 23bp的小干 扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)为效应分子，导弓丨 RISC 复合体(RNA-induced silencing compplex)识别并切割靴分子 mRNA 的过程(Scherer, L. J.，and Rossi， J.J. Approaches for thesequence—specific knockdown of mRNA. Nat Biotechnol 2003， 21,1457-1465.)。这三种方法各有优劣，但在实际应用中，往往面对相同的问题(1)基因 沉默的效率不高，导致靶基因的表达不能被有效抑制；(2)基因沉默的持续时间较短，导致 靶基因的表达回复较快，难以完成功能分析；(3)基因沉默的作用特异性不高，引起脱靶效 应或是免疫副反应，造成对结果的误判(Lin，Χ·，Ruan，X. ,Anderson,Μ. G.，McDowell，J. Α.， Kroeger, P.Ε. , Fesik, S. W. , and Shen, Y. siRNA—mediated off-target gene silencing triggered by a 7 ntcomplementation.Nucleic Acids Res 2005,33,4527-4535; Tschuch, C. , Schulz, A. , Pscherer, A. , fferft, W. , Benner, A. , Hotz-ffagenblatt, A. , Barrionuevo, L. S., Lichter, P. , and Mertens, D. Off-target effects of siRNA specificfor GFP. BMC Mol Biol 2008,9,60 ；Kleinman, Μ. Ε. , Yamada, K. , Takeda, Α., Chandrasekaran, V. , Nozaki, Μ. , Baffi, J. Ζ. , Albuquerque, R. J. , Yamasaki, S. , Itaya,M.，Pan, Y. Sequence—and target-independent angiogenesissuppression by siRNA via TLR3. Nature 2008，452，591-597.)。此外，对一个特定靶基因的mRNA来说，局部的二级结 构等特性又使得不同位点呈现出不同的可接近性(accessibility)，进而造成基因沉默效 果的巨大差异。因此，寻找有效的基因沉默方式和有效的靶基因作用位点，仍然是实际研究 工作中面临的巨大挑战。H19RNA是在多种肿瘤组织如人宫颈癌，人前列腺癌，人肝癌，乳腺癌等高表达的 非编码RNA，被认为是一个癌基因，具有促进癌症发生和发展的作用(mad J. Matouk, N. D.， Shaul Mezan,Suhail Ayesh, Rasha Abu-Iai1, Abraham Hochberg,Eithan Galun. The H19 Non-Coding RNA Is Essential for Human Tumor Growth. PLoS ONE 2007,2,1-15. ；Tomomi Yoshimizu, A.M. , Marie-Anne Ripoche, AnneGabory, Maria Vernucci, Andrea Riccio, Sabine Colnot, Cecile Godard, BenoitTerris, Helene Jammes, and Luisa Dandolo. The H19 locus acts in vivo asa tumor suppressor. PNAS 2008，105，12417—12422.)。因此， 发展一种有效的基因沉默技术敲除或敲低H19 RNA在恶性肿瘤组织中的表达，将为实现相 关疾病的基因治疗提供新的药物靶点和新的治疗方式，这无疑具有重要的应用价值和发展 前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种靶向沉默非编码癌基因H19 RNA表达的 单链反义RNA及其效果检测方法。为达到上述目的，本发明采用了如下的技术措施本发明所提供的单链反义RNA是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位 点，设计并合成的23 39nt单链反义RNA(sasRNA)，其5’和3’均为羟基，不带有其它化学 修饰；所述的单链反义RNA包括如下序列(序列方向均为5’ -3’ )sasRNA-23, H0-UUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUC-0H ；sasRNA-27, H0-UCUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG-0H ；sasRNA-31，H0-U⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶-OH ；sasRNA-35，H0-G⑶⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶UC-0H ；sasRNA-39，H0-AUG⑶⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶UCCU-0H。本发明所提供的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤(1) sasRNA转染人类肿瘤细胞将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20 μ M浓度的溶液，贮存于_80°C超低 温冰箱；使用LipofectamindOOO脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞；(2) Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平Trizol法提取转染后各细胞样品的总RNA，部分总RNA用于Northern blot检测； 部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引 物检测H19RNA和内参β -actin mRNA的表达水平，2_Δ 方法计算H19RNA的敲除水平；(3)碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶(PI)对基因组DNA进行染色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布。(4) sasRNA是否激活免疫副反应终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤、细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA， 半定量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β -actinmRNA ；(5) sasRNA是否造成脱靶效应选取人类基因组中mRNA序列与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA后 48h收集样品，半定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为β -actin mRNA。进一步的技术方案是SYBR Green I 荧光定量 PCR(real_time PCR)的方法检测 H19 RNA 的 表达水平，所用的定量 PCR 引物为H19QF，GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC ； H19QR, GCTGCTGTTCCGATGGTGT ；内参 β-actin mRNA 的定量 PCR 弓丨物为ActQF， CGTGGACATCCGCAAAGAC ；ActQR, TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。用Northern blot的方法检测H19RNA的表达水平，所用特异探针的序列为 H19RNA的探针序列为GCTGCTGTTCCGATGGTGT ；内参β -actin mRNA的杂交探针序列为 TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。检测sasRNA是否激活免疫副反应，所用的检测干扰素系统相关基因的特 异引物为0AS1-F，TCTCAGAAATACCCCAGCCAA，OAS 1-R, GAAGACAACCAGGTCAGCGTC ； IFNG-F, AGATGTAGCGGATAATGGAACTCT, IFNG-R, TCTTCCTTGATGGTCTCCACACTC ； IFNK-F, CACCCTATCCCTGGACTGTAAC, IFNK-R, TGGGGCAACTCAAAAGCTATGT ； ISG20-F, ACTGAAACAGGGTCGGGATG, ISG20-R, GCCGGATGAACTTGTCGTAC ；IFNB1-F, CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT, IFNB1-R, AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG。检测sasRNA是否造成脱靶效应，所检测的部分同源基因及其特异引 物为:KeratinF, GTGGCATTGGTGGTGGCATC, KeratinR, GGCTTTCAGCAAGTGGGCTC ； USP9xF, CAAACAGATACAGCCCACCCT, USP9xR, TAGAGGGCCAAAGGTCAAATC ；GAL10F, CAGTGGAGAAAAGAACCCGACG, GAL10R, GCTGGTGGAAGCCATAGATTG ；ZNF420F, CTCAGGAAGAGTGGGAATGCC, ZNF420R, TGCTTCTCCATCTTGCCTTTG。作为对照，本发明还合成相应的小干扰RNA (siRNA) 21bp siRNA, Guide AUG⑶⑶CUU UGAUG UUGG dTdT, Pasenger =CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT ；所有的RNA寡核苷酸由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，5’和3’端均为 羟基，不带有其它任何修饰，PAGE纯化，电泳显示为单一、纯净条带；DNA寡核苷酸由英骏生 物科技有限公司(Irwitrogen，上海)合成，两侧均为羟基，不带有其它任何修饰，PAGE纯 化，电泳显示为单一、纯净条带。靶位点和寡核苷酸的位置信息见附图1。H19RNA由五个外显子和四个短的内含子 组成，靶位点位于第五外显子的5’端部分。靶位点的序列，化学合成的sasRNA和siRNA的 序列如图所示。上游引物Pl和下游引物P2为荧光定量PCR引物的退火位置。综合上述内容并结合实施例所示的信息，本发明所提供的单链反义RNA及其效果 检测方法，具有如下的优势(1)相对于同一位点的siRNA及其它对照效应分子，sasRNA在低剂量转染条件下， 即可具有强劲的基因沉默能力，能够高效抑制靶基因H19 RNA的表达。
(2)相对于同一位点的siRNA及其它对照效应分子，sasRNA对H19 RNA的基因沉 默效应可以持续至少6天以上，具有持久性的特点，这为进行H19 RNA的功能研究提供了新 基因沉默技术体系。(3) sasRNA对靶基因H19RNA的沉默效应是特异的，既不会引起免疫副反应，也不 会造成脱靶效应，因而其生物学效应也是特异的。(4) sasRNA介导的H19RNA的基因沉默导致肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，显 著影响细胞周期进程，减缓细胞的分裂速度。这为以H19RNA为药物靶点的肿瘤治疗提供了 新的方法和手段。(5)操作简便易行，成本低廉，检测方法稳定可靠。
图1H19 RNA的靶位点和sasRNA以及siRNA的序列信息。图2荧光定量PCR检测sasRNA的基因沉默效果。图3Northern blot检测sasRNA的基因沉默效果。图4低剂量的sasRNA可介导高效的基因沉默。图5sasRNA可介导持久的基因沉默效应。图6sasRNA沉默H19 RNA的表达引起Hela细胞周期的阻滞。图7sasRNA沉默H19 RNA的表达引起PC3细胞周期的阻滞。图8sasRNA不会激活免疫副反应。图9sasRNA不会造成脱靶效应。
具体实施例方式本发明所提供的单链反义RNA是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位 点，设计并合成的23 39nt单链反义RNA(sasRNA)，其5’和3’均为羟基，不带有其它化学 修饰；本发明所提供的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤(1) sasRNA转染人类肿瘤细胞将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20 μ M浓度的溶液，贮存于_80°C超低 温冰箱；使用LipofectamindOOO脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞；(2) Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平Trizol法提取转染后各细胞样品的总RNA，部分总RNA用于Northern blot检测； 部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引 物检测H19 RNA和内参β -actin mRNA的表达水平，2_Δ 方法计算H19RNA的敲除水平；(3)碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶(PI)对基因组DNA 进行染色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布。(4) sasRNA是否激活免疫副反应终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤、细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA， 半定量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β -actinmRNA ；
(5) sasRNA是否造成脱靶效应选取人类基因组中mRNA序列与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA后 48h收集样品，半定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为β -actin mRNA。本发明的优势和特点，可以从下面对实施例的详细描述和附图包含的信息中得到 明显的体现.实施例IsasRNA的合成与制备及质量控制(附图1)所用sasRNA的序列为sasRNA-23, H0-UUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUC-OH ；sasRNA-27, H0-UCUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG-OH ；sasRNA-31，H0-U⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶-OH ；sasRNA-35, H0-G⑶⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶UC-0H ；sasRNA-39，H0-AUG⑶⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶UCCU-0H。方向为5’_3’，由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，PAGE纯化，不带修饰。对照siRNA 的序列为21bp siRNA, Guide =AUGGU GUCUU UGAUG UUGG dTdT, Pasenger =CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT。由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成， PAGE纯化，不带修饰。双链siRNA duplex由Guide和Passenger等摩尔退火形成。用DEPC处理水将上述寡核苷酸稀释，并用Nanovue微量分光光度计准确测定各溶 液的浓度和纯度，调整为20 μ mol/L浓度的溶液，保存于-80°C。实施例2sasRNA转染Hela细胞敲除并检测对H19RNA的沉默效果(附图2)(1)采用反式转染方法将sasRNA转染人宫颈癌Hela细胞，具体步骤为将 生长状态旺盛的Hela细胞用胰酶消化为单细胞悬液，红细胞计数板计数细胞，调整为 4X104cells/100y 1。配制转染复合物，体系如下核酸+(Opti-MEM)Lipofectamine2000+(Opti-MEM)35nt sasRNA (20 μ mol/L) 1 μ 1 50 μ 1 1 μ 1 50 μ 121bp siRNA (20 μ mol/L) 1 μ 1 50 μ 1 1 μ 1 50 μ 1将上述各成分混合，室温放置20分钟，形成转染复合物。将4X104cells/100 μ 1与上述转染复合物混合，滴于24孔板中，补加300 μ 1完 全培养基，置于37°C，5% CO2的条件下培养。核酸的转染终浓度为40nmol/L。Opti-MEM为细胞培养级的无血清培养基，购自美国Gibco公司； Lipofectamine2000为脂质体转染试剂，购自美国Invitrogen公司。(2)48h后收获细胞， 以Trizol法提取细胞的总RNA，主要步骤为-每孔细胞用100μ 1 PBS清洗2次；-每孔细胞样品加入600μ 1 Trizol试剂，室温放置5分钟，使细胞裂解；-将裂解的细胞样品用移液枪转移到1.5ml离心管中，加入120 μ 1氯仿，上下颠倒 混勻；-在高速离心机上，以12，OOOg的转速，4°C的条件下离心15分钟；-吸取上清至新鲜离心管，加入300μ 11异丙醇，冰上放置10分钟；
-在高速离心机上，以12，OOOg的转速，4°C的条件下离心10分钟；-用移液枪将上清吸走丢弃，用75%的乙醇洗涤沉淀，室温下静置5分钟晾干，彻 底去除残余液体；-用20μ 1 DEPC处理的双蒸水溶解RNA ；-用Nanovue仪器测定RNA样品的浓度及纯度，此样品可长期保存于_80°C。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，氯仿、异丙醇、乙醇均购自国药集团，均为 分子生物学级别。(3)逆转录合成cDNA-取2μ g总RNA样品用于逆转录反应，首先去除痕量的基因组DNA污染，在0. 2ml 离心管中配制如下体系RNA (2 μ g)10 μ 1RQI DNA 酶2 μ 110 X DNA酶反应缓冲液2 μ 1DEPC处理双蒸水6 μ 1_总体积20 μ 1置于37°C反应30min，然后加入2μ 1 stop buffer，65°C温育10分钟失活DNase 的活性。RQI DNA酶购自美国Promega公司，反应缓冲液为产品自带。-在上述样品中加入下列成分上一步反应物8个寡核苷酸的随机引物(IOOymol5 X逆转录缓冲液IOmM dNTP mix (终浓度 Immo 1/L)M-MLV逆转录酶_总体积30 μ 1在42°C反应1小时，然后在70°C加热lOmin，失活逆转录酶。M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司，5X逆转录缓冲液为产品自带；8个寡核 苷酸的随机引物由美国Invitrogen公司(上海)合成；dNTP购自上海申能博彩生物科技 有限公司。(4)荧光定量PCR检测H19 RNA的丰度用基因特异引物进行荧光定量PCR反应，体系如下成分用量2 X SYBR Green I 混合物10 μ 1Plus solution2μ 1上游引物(10ymol/L)0. 25μ 1下游引物(10ymol/L)0. 25 μ 1模板 cDNA0. 5 μ 1
22 μ 1 /L) 0· 5 μ 1 6 μ 1 0. 5μ 1 1 μ 1
PCR级别双蒸水7μ1_总体积20 μ 1反应条件为95°C预变性2min，同时激活热启动TaqDNA聚合酶；95 °C 5sec, 60°C 20seC，40 50个循环，在60°C的退火/延伸时段采集荧光信号；溶解曲线分析(Melt curve analysis)，温度为 50°C 99°C，检测产物的单一性(uniformity)。H19 RNA 的定量 PCR 引物为H19QF，GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC ；H19QR, GCTGCTGTTCCGATGGTGT ；内参为 β -actin mRNA, H19 RNA 的丰度均一化到 mock 样 品。内参 β -actin mRNA 的定量 PCR 引物为ActQF，CGTGGACATCCGCAAAGAC ；ActQR, TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。采用 一 方法计算 Η19 RNA 的丰度。2X SYBR Green I 混合物和 Plus solution 购自日本 Toyobo。结果如附图2所示，当sasRNA的长度大于27nt时，其基因沉默效果显著高于相应 位点的siRNA。实施例3Northern blot检测35nt sasRNA对H19 RNA的基因沉默敲除效果(附 图3)在本实施例中，我们选取35nt sasRNA作为单一研究对象做进一步检测。本实施 例的部分步骤，包括35nt sasRNA和siRNA的合成与制备，转染Hela细胞，提取总RNA等， 与实施例1和实施例2的内容相同。下面主要叙述Northern blot的详细操作(1) RNA专用甲醛变性电泳-按下述方法制备甲醛变性胶(25ml)Agarose0. 3 克TdH2O21.75ml煮沸溶解，室温冷至60°C时加入。10 X MOPS2.5ml37% 甲醛0.75ml混勻后倒胶。-按下述体系处RNA样品RNA (5 μ g/ μ L) 1 μ L10 X MOPS1· 25 μ LFormamide (甲酰胺)6. 25 μ LEB (0. 5 μ g/ μ L) 0. 5 μ L将上述成分混勻，65°C变性5分钟，立即冰浴，加2.5yL 6X溴酚兰上样缓冲液点 样，100V，30min。(2)转移至尼龙膜先在电转仪上放置2层滤纸，再放上2层干净滤纸，事先将滤纸用0. 5 X TBE润湿。 然后胶体在上尼龙膜在下放好，再依次覆盖润湿的新鲜滤纸，开始转膜，50min ；电流的计算 公式为 0. 8mA/cm2。(4)探针标记按下述体系配制探针标记反应
探针(0. 2ug/ul)2. 5ul
10XT4多核苷·I激酶反应缓冲液1. 5ul
T4多核苷酸激酶(lOU/ul)Iul
双蒸水15ul
Y -32PATPIul
总体积16ul
37°C水浴 30min，-20°C保存。
-取Iul上述标记的探究与尼龙膜在5ml杂交液中孵育过夜，杂交液的配方为杂交液(IOOml)
成分终浓度母液浓度用量
SSPE5X20X25ml
SDS1%10%IOml
Denhardt' s5X50XIOml
双蒸水55ml
总体积100ml
-第二天将杂交液倒入专用的废液缸，用洗膜液将尼龙膜洗涤三次，洗膜液的配方
洗膜液(500ml)
终浓度 SSPE 2X SDS0. 1%
双蒸水
母液浓度 20X 10%
用量 25ml Iml 474ml
总体积500ml
-洗膜后，将尼龙膜晾干后放入磷屏夹中显影6h，在Typhoon扫描仪上读取信号并
为
0162]
0163]
0164]
0165]
0166]
0167]
0168]
0169] 生成图像。
0170]H19 RNA 的探针序列为GCTGCTGTTCCGATGGTGT ；内参 β -actin(3 -肌动蛋白) mRNA 的杂交探针序列为TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。
0171]由附图3可知，与同一位点的siRNA相比，35nt sasRNA能够更加有效地抑制H19 RNA的表达。
0172]实施例4低剂量的sasRNA可介导高效的基因沉默(附图4)
0173]在本实施例中，我们选取35nt sasRNA为研究对象，检测了它在不同浓度下对H19 RNA的基因沉默作用。同时，我们设置了 21bp siRNA, siRNA的两条单链分子(分别为Guide 和Passenger)，以及反义DNA作为对照分子。本实施例的部分步骤，包括总RNA的提取，逆 转录合成cDNA，荧光定量PCR(包括所用基因特异引物)等，与实施例2的内容相同，在此不 再赘述。 (1) RNA与DNA的合成与制备及质量控制
35nt sasRNA 的序列为H0_G⑶⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶UC-0H ；对照 siRNA 的序列为21bp siRNA，Guide AUGGU GUCUU UGAUG UUGG dTdT，Pasenger CCAAC AUCAA AGACA CCAU dTdT。由大连宝生物科技有限公司(Takara)合成，PAGE纯化，不带修 饰。双链siRNA duplex由Guide和Passenger等摩尔退火形成。对照反义DNA 的序列为 asDNA，GGTGTCTTTGATGTTGGGCTGATGAGGTCTGGTTC。上海英 骏生物科技有限公司合成，PAGE纯化。用DEPC处理水将上述寡核苷酸稀释，并用Nanovue微量分光光度计准确测定 各溶液的浓度和纯度，调整为20 μ mol/L, 1 μ mol/L,0. 1 μ mol/L三种浓度的溶液，保存 于-80"C。(2)转染 Hela 细胞采用反式转染法将五种不同的分子分别转染Hela细胞，具体步骤为将生 长状态旺盛的He Ia细胞用胰酶消化为单细胞悬液，红细胞计数板计数细胞，调整为 4X104cells/100y 1。配制转染复合物，体系如下
核酸(μι)Ορ -ΜΕΜ(μ1)Lipofectamine2000( μ )Ορ -ΜΕΜ(μ1 )35nt sasRNA(2(^mol/L)25015035nt sasRNA(2(^mol/L)15015035nt sasRNA(2(^mol/L)0.55015035nt sasRNA(2(^mol/L)0.255015035nt sasRNA(^mol/L)0.55015035nt sasRNA(0.^mol/L)0.55015035nt asDNA(2(^mol/L)25015035nt asDNA(2(^mol/L)15015035nt asDNA(2(^mol/L)0.55015035nt asDNA(2(^mol/L)0.2550150
权利要求
一种靶向沉默非编码癌基因H19 RNA表达的单链反义RNA，其特征在于其是以H19 RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23nt, 27nt, 31nt, 35nt,39nt单链反义RNA，其5’和3’均为羟基,不带有其它化学修饰。
2.如权利要求1所述的靶向沉默非编码癌基因H19RNA表达的单链反义RNA，其特征 在于所述的单链反义RNA包括如下序列HO-UUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUC-OH；H0-UCUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG-OH;HO-U⑶CUUUGAU⑶UGGGCUGAUGAGGUCUG⑶-0H;HO-G ⑶⑶ CUUUGAU ⑶ UGGGCUGAUGAGGUCUG ⑶ UC-0H;HO-AUG ⑶⑶ CUUUGAU ⑶ UGGGCUGAUGAG ⑶ CUGGUUCCU-0H。
3.权利要求1所述的单链反义RNA的效果检测方法，包括如下步骤 (1) sasRNA转染人类肿瘤细胞将化学合成的sasRNA用DEPC处理水稀释为20 mol/L浓度的溶液，使用 Lipofectamine2000脂质体转染试剂将sasRNA分别反式转染人类肿瘤细胞； Northern blot和荧光定量PCR检测H19 RNA的表达水平(2)Trizol法提取各转染后细胞样品的总RNA，部分总RNA用于Northernblot检测； 部分总RNA用于逆转录反应合成cDNA，采用SYBR Green I荧光定量PCR方法以基因特异引 物检测H19 RNA和内参β-actin mRNA的表达水平，2_Δ Δα方法计算H19 RNA的敲除水平；(3)碘化丙啶染色结合流式细胞仪分析细胞周期的时相分布变化转染48小时后用胰酶消化处理细胞制备单细胞悬液，碘化丙啶对基因组DNA进行染 色，流式细胞仪分析不同处理组的细胞周期时相分布；(4)sasRNA是否激活免疫副反应终浓度40nmol/L的sasRNA转染肿瘤细胞，48h后收集细胞，Trizol提取总RNA，半定 量RT-PCR检测干扰素系统标志基因的表达情况，内参为β -actin mRNA ；(5)sasRNA是否造成脱靶效应选取人类基因组中与sasRNA存在相似性的4个基因，转染sasRNA，48h后收集样品，半 定量RT-PCR检测这四个基因的mRNA水平，内参为β -actin mRNA。
4.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于所使用的人类肿 瘤细胞包括人宫颈癌Hela细胞和人前列腺癌PC3细胞。
5.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于SYBRGreen I荧光定量PCR的方法检测H19 RNA的表达水平，所用的定量PCR引物为H19QF， GGAAATGAATATGCTGCACTTTACAACC； H19QR, GCTGCTGTTCCGATGGTGT；内参 β-actin mRNA的 定量 PCR 引物为ActQF, CGTGGACATCCGCAAAGAC； ActQR, TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。
6.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于用Northern blot的方法检测H19 RNA的表达水平，所用特异探针的序列为H19 RNA的探针序列为 GCTGCTGTTCCGATGGTGT ；内参 β-actin mRNA 的杂交探针序列为TGGAAGGTGGACAGCGAGGC。
7.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于检 测sasRNA是否激活免疫副反应，所用的检测干扰素系统相关基因的特异引物为0A Sl-F, TCTCAGAAATACCCCAGCCAA, OASl-R, GAAGACAACCAGGTCAGCGTC ； IFNG-F, AGATG TAGCGGATAATGGAACTCT, IFNG-R, TCTTCCTTGATGGTCTCCACACTC；IFNK-F, CACCCTATCCCT GGACTGTAAC,IFNK-R, TGGGGCAACTCAAAAGCTATGT;ISG20-F, ACTGAAACAGGGTCGGGAT G, ISG20-R, GCCGGATGAACTTGTCGTAC； IFNBl-F, CCAACAAGTGTCTCCTCCAAAT, IFNB1-R, AATCTCCTCAGGGATGTCAAAG。
8.根据权利要求3所述的单链反义RNA的效果检测方法，其特征在于检 测sasRNA是否造成脱靶效应，所检测的部分同源基因及其特异引物为=KeratinF, GTGGCATTGGTGGTGGCATC, KeratinR, GGCTTTCAGCAAGTGGGCTC； USP9xF, CAAACAGATACA GCCCACCCT, USP9xR, TAGAGGGCCAAAGGTCAAATC ； GALlOF, CAGTGGAGAAAAGAACCCGACG, GALlOR, GCTGGTGGAAGCCATAGATTG ； ZNF420F, CTCAGGAAGAGTGGGAATGCC, ZNF420R, TGCTTCTCCATCTTGCCTTTG。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种沉默非编码癌基因H19RNA表达的单链反义RNA及其效果检测方法。所述单链反义RNA是以H19RNA的第五外显子的部分序列作为靶位点，设计并合成的23nt,27nt,31nt,35nt,39nt单链反义RNA，其5’和3’均为羟基,不带有其它化学修饰。采用脂质体介导法转染人宫颈癌Hela细胞和人前列腺癌PC3细胞，sasRNA能够持久、高效、特异地抑制H19RNA的表达。流式细胞检测sasRNA介导的H19RNA表达水平的下调导致细胞周期阻滞于G2/M期。本发明的单链反义RNA效果明显，检测方法操作简便，成本低廉，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N21/64GK101935661SQ20101027829
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者付向东, 姜黎, 张翼, 毕延震, 王龙, 马钧 申请人:武汉大学