替代模板法制备拉米夫定分子印迹固相萃取柱及其应用的制作方法

文档序号:5879631阅读:279来源:国知局
专利名称:替代模板法制备拉米夫定分子印迹固相萃取柱及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体地说是涉及一种拉米夫定分子印迹固相萃取 (MISPE)柱及制备方法,并主要用于生物样品中拉米夫定的高选择性分离、富集和纯 化。
背景技术
拉米夫定(3TC),化学名为(2R-顺式)_4氨基-l-(2-羟甲基1,3_氧硫杂交环 戊-5基)IH-嘧啶-2酮。1995年被FDA批准用于治疗HIV感染,拉米夫定抗病毒作 用强,且能提高机体免疫能力[叶金朝.抗免疫缺陷病毒药-拉米夫定.国外医药合成 药、生化药、制剂分册,1998,19(2) 83 84]。由于生物样品中许多内源性物质的存在,使得样品净化成为必要步骤。目前, 生物样品中的拉米夫定前处理手段较多,如溶剂萃取和固相萃取法,结合高效液相色谱 法。溶剂萃取法需要大量的有机溶剂,耗时且存在严重的基体干扰,其它方法的仪器昂 贵。固相萃取法(SPE)出现于20世纪70年代,至今已成为许多领域样品预处理的常用 方法。传统的SPE吸附剂选择性不佳,在富集分析物过程中存在大量基体和干扰物质。 因此,发展快速、高效、高选择性、环境友好的样品前处理技术非常重要[中国科学B 辑化学,2009,39(8) 733]。分子印迹聚合物(MIP)是为模板分子量身定做的高分 子聚合物,具有预定性、实用性和识别性等特点[Chemistry of Materials,2008,20(3) 859 ; AnaLChem., 2009,81(4) 1615]。由于模板选择的多样性,使得MIP能广泛应用 于物质的分离与分析过程,它对于目标物质的高度选择性也是普通SPE填料所不能比拟 的[分析化学,2007,35(9) 1319 ; Analytical Letters, 2009,42(3) 600]。目前关于 拉米夫定MISPE柱的制备未见报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种拉米夫定MISPE柱及制备方 法和应用,以高效地选择性分离富集血清、血浆等生物样品提取液中的拉米夫定,结合 光度法或高效液相色谱即可实现生物样品中拉米夫定的快速分析。为实现上述目的,本 发明以拉米夫定为模板,衣康酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,以N, N-二甲基甲酰胺为致孔剂,偶氮二乙丁腈为引发剂,进行聚合制备出MIP后,填充在固 相萃取柱内得拉米夫定MISPE柱。仪器与试剂UV-2450紫外可见分光光度计、LOlOA高效液相色谱仪(日本岛津公司); Inertsil ODS-SP (5 μ m,4.6 X 250mm) C18 色谱柱;Humanpowerlll 超纯水处理器(韩 国);HC-2518微量高速离心机(安徽中科中佳科学仪器);5S1020固相萃取仪(北京振 翔工贸有限公司)。乙腈、无水乙醇、乙醚、二氯甲烷、四氯化碳、正庚烷、甲醇、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、盐酸、氢氧化钠、三水合醋酸钠均为市售分析纯。三甲氧基丙烷三 甲基丙烯酸酯(TRIM,东京化成工业株式会社生产),偶氮二乙丁腈(AIBN,化学纯, 上海试剂厂)。齐多夫定(AZT)、拉米夫定、奈韦拉平(NEV)为原料药(杭州大阳化工 有限公司生产)。


附图1为拉米夫定溶液在MIP与非印迹聚合物(NIP)上的吸附量随浓度变化曲线。附图2为0.5mg/L拉米夫定溶液HPLC图2a为拉米夫定标准品溶液;2b为拉 米夫定血清提取液_未经过MISPE柱;2c为拉米夫定血清提取液-经过MISPE柱。
具体实施例方式A)拉米夫定酯化物(3TC-ES)的合成将吡啶2.4mL和拉米夫定l.Og置于反 应瓶中,充分溶解后加入醋酸酐2mL,于室温下搅拌2小时后蒸出溶剂及未反应完的醋 酸酐,将得到白色粗产物用氯仿溶解,用水萃取,收集氯仿层,水层继续用氯仿提取3 次,合并氯仿溶液,蒸除氯仿,得到白色固体,将白色固体用乙醇重结晶,得到白色的 絮状拉米夫定酯化产物;B)将模板、功能单体、交联剂、按Immol 4mmol 20mmol的配比和引发剂 40mg、致孔剂氯仿16mL —起置于50mL圆底烧瓶中,充分溶解混勻,超声脱气5min, 通氮气15min,于45°C恒温油浴锅中加热24h。C)将步骤B)制备的聚合物磨碎成粉末,粉末过筛,收集粒径在38 75 μ m的 聚合物,用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9,V/V)溶液洗至无拉米夫定检出,继续 用甲醇洗去乙酸,最后真空干燥至恒重,得拉米夫定MIP颗粒。D)称取IOOmg上述拉米夫定MIP颗粒,均勻填充至空的固相萃取柱中,在聚合 物上放置聚乙烯塞板,制得本发明的拉米夫定MISPE柱。选取与3TC-ES具有不同结构类似程度的3TC、AZT以及NEV,考察它们在 3TC-ES分子印迹及非印迹聚合物材料所装填的固相萃取柱上的保留和被分离情况。萃 取柱对NEV基本没有保留能力,直接发生穿漏;AZT虽然在萃取柱上有一定吸附,但被 吸附的部分在经过除杂和洗脱后就全部脱落。这说明两种物质都与固相萃取柱结合比较 弱。实验表明,与模板分子结构类似程度最高的3TC全部被萃取柱保留。表各化合物MISPE上的回收率(% )
权利要求
1.一种拉米夫定分子印迹固相萃取(MISPE)柱,其特征是固相萃取柱中填充有拉米 夫定分子印迹聚合物(MIP)颗粒。
2.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱,其特征在于上述拉米夫定MIP颗粒大小 为 38 75 μ m。
3.拉米夫定MISPE柱的制备方法,其特征在于包括以下步骤A)拉米夫定酯化物(3TC-ES)的合成将吡啶2.4mL和拉米夫定l.Og置于反应 瓶中,充分溶解后加入醋酸酐2mL,于室温下搅拌2小时后蒸出溶剂及未反应完的醋 酸酐,将得到白色粗产物用氯仿溶解,用水萃取,收集氯仿层,水层继续用氯仿提取3 次,合并氯仿溶液,蒸除氯仿,得到白色固体,将白色固体用乙醇重结晶,得到白色的 絮状拉米夫定酯化产物;B)将拉米夫定酯化物(0.3133g,lmmol)、甲基丙烯酸(0.3444g,4mmol)、40mg偶 氮二异丁腈(AIBN)、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(6.5mL,20mmol),16mL氯仿置于 50mL圆底烧瓶中,充分溶解混勻,超声脱气5min,通氮气15min,密封。将圆底烧瓶放 入45°C恒温水浴锅中加热24h得到白色块状聚合物。将块状聚合物用研钵磨碎,过筛收 集得到粒径在38 75 μ m,含有拉米夫定的MIP颗粒;C)将上述含有拉米夫定的MIP颗粒,用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9,V/ V)溶液洗至无拉米夫定检出,继续用甲醇洗去乙酸,再经甲醇反复沉降,滤去甲醇,将 获得的颗粒物真空干燥至恒重,即为拉米夫定MIP颗粒;D)称取IOOmg上述拉米夫定MIP颗粒,均勻填充至空的固相萃取柱中,在聚合物上 放置塞板,制得拉米夫定MISPE柱。
4.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱,其特征在于将上述拉米夫定MIP颗粒填 充在聚丙烯固相萃取柱内得拉米夫定MISPE柱。
5.如权利要求1所述的拉米夫定MISPE柱用途,其特征在于利用该拉米夫定MISPE 柱分离富集生物样品中的拉米夫定。
6.如权利要求5所述的拉米夫定MISPE柱的用途,其特征在于用该拉米夫定MISPE 柱分离富集血清(或血浆)样品拉米夫定提取液,以正庚烷四氯化碳=11为上样溶 齐U、4%乙醇-四氯化碳为淋洗剂、甲醇为洗脱溶剂。
7.如权利要求6所述的拉米夫定MISPE柱应用于血清(或血浆)样品拉米夫定提取 液,其特征在于上述血清样品拉米夫定提取液制备方法是取空白牛血清0.3mL样品,置 具塞离心管中,精密加入1.0g/L拉米夫定的水溶液0.3mL,涡旋混勻lmin,加入乙腈 2.4mL混勻后,于4000r/min离心30min除去蛋白质,精密量取上清液l.OmL作为生物样 品提取液。
全文摘要
本发明涉及吸附材料的制备及其在药物分离、富集中的应用,是一种拉米夫定分子印迹聚合物和拉米夫定分子印迹固相萃取柱的制备及其应用。通过酯化合成得到拉米夫定酯化物。该分子印迹聚合物以拉米夫定酯化物为模板,以甲基丙烯酸为单体、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂,氯仿为致孔剂,采用本体聚合法合成分子印迹聚合物,将分子印迹聚合物颗粒均匀填充于固相萃取柱内,得到拉米夫定分子印迹固相萃取柱。本发明实现了生物样品中拉米夫定的高效分离、富集与纯化,与以往普通溶剂萃取法、C18固相萃取法等相关技术相比,选择性高,并且拉米夫定分子印迹固相萃取柱可以重复使用,成本低,可望成为生物样品中拉米夫定前处理的必备手段。
文档编号G01N30/08GK102008946SQ20101051388
公开日2011年4月13日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者努尔买买提·库达巴尔地, 吐尔洪·买买提, 曾何华 申请人:新疆大学
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