专利名称：一种dab2ip基因的实时荧光pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
自适应及自我加速生长是恶性肿瘤发生发展的必经之路，作为重要的表达网络调 节者，DAB2IP归属于RAS-GTP酶激活蛋白家族，具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，能通过多种 复杂的通路抑制肿瘤生长及转移。DAB2IP可减弱H-RAS，R-RAS和TC21等癌基因的表达， 并与TNF-a介导的肿瘤细胞凋亡相关。作为EZH2的靶基因，DAB2IP可能参与EZH2参与的 肿瘤表观遗传学沉默调节。此外，DAB2IP可介导PI3K-Akt通路失活，该通路是重要的肿瘤 细胞信号传导途径，调节肿瘤的增殖，存活和转移。最新研究发现，04821 还可通过顺-!^8 途径阻断肿瘤转移，并在关键的上皮-间质转化(EMT)过程中具有潜在的调节能力。因此， DAB2IP的表达高低与肿瘤生长，转移以及侵袭等多种重要特性密切相关，精确检测DAB2IP 可明晰这一独特的抑癌基因在人体的表达，指导个体化抗肿瘤研究，治疗及预后判断。目前DAB2IP研究方兴未艾，常规测定DAB2IP表达的方法仍然以免疫组化及半定 量PCR为主，前者较难在外周血中测定，后者只能起到定性的作用。实时荧光定量PCR技术 具有快速、准确、可定量等优点，能真实反映待测定样本的DAB2IP表达高低，从而协助临床 甄别可能的抑癌活性，同时为肿瘤基础研究提供重要支持。
发明内容
本发明目的是提供一种检测DAB2IP基因的荧光检测试剂盒及其检测方法，以实 现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测。本发明采用的技术方案是一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、 PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针 序列如下上游引物5‘ -TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3 ‘下游引物5‘ -ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3 ‘荧光探针5'-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本 领域常规进行选择，该试剂盒可用作DAB2IP基因的定性检测，也可加入标准品进行定量检 测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。为达到精确定量测定的效果，所述试剂盒还包括可DAB2IP基因标准品，所述标准 品序列如下TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGT GCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样 品DNA的拷贝浓度。一种DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法如下(1)提取待测样本DNA ；也可提取样本RNA后，进行逆转录获得其cDNA作为待测样 本DNA ；上述DNA或RNA提取方法或逆转录方法可按本领域常规方法进行；本发明中样本RNA提取可采用RNAi Plus (大连宝生物，D19108A)提取总RNA，按
照下述体系进行逆转录2 X RT buffer10. 0 μ LdNTP (各 IOmM)1 μ LOligo dT(IOuM)1 μ LRNAinhibitor0.5 μ LRTase1 μ L总RNA1 μ g水补足至20 μ L。逆转录条件:30°C, 10分钟；42°C，30分钟；95°C，5分钟。(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品逆转录产物cDNA配成PCR反应体系，于同等条件 下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5‘ -TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3 ‘下游引物5‘ -ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3 ‘荧光探针5 ‘ -FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3‘其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3 15个循环的荧光信号， 以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值 线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含有该靶基因的非人源性 细胞。在对多个样品进行检测时，可根据样品DNA测得的Ct值大小，粗略判断不同样品之 间DAB2IP基因表达量的差异(通常是Ct值越大，其DAB2IP基因表达量越低)。进一步，所述方法同时以梯度浓度的前述标准品的DNA溶液在与样品DNA相同条 件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵 坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，具体的，本发明中PCR 反应条件如下95°C变性2分钟，95°C 15秒、60°C 45秒，进行40个循环扩增。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度):1XPCR buffer,0. 3 0· 5μ M的引 物、0. 1 0. 3μΜ的荧光探针、1 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs，通常取2μ L 的模板，反应总体积通常为20 50 μ L0本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测DAB2IP基因的方法，并经检测肿瘤病人临床样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术，使得DAB2IP 基因检测的灵敏度大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了 常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的样本中获得准确、详实的样本信息。本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高灵 敏度的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR 模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果 经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR 产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定 量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析 带来影响，从而影响定量这一目的。对于一些使用管家基因进行半定量分析的方法，由于引 物间扩增效率不一致，导致管家基因和目的基因的PCR扩增产物比例不能真实的反应目的 基因表达量的变化。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板 的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技 术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。本发明的有益效果主要体现在采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高， 特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和 分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进 行相对定量检测。
图1为实时荧光定量PCR标准品检测DAB2IP基因实时荧光定量PCR标准品检测 结果，从左至右分别为105、104、IO3UO2UO1C0Pies/μ L标准品；图2为实时荧光定量PCR标准曲线标准曲线为Y = -4.022XlgX+35. 12 ；Y 对应 的CT值；X :DAB2IP基因的拷贝数。图3为5例阳性临床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16. 18，16. 59， 27. 02,31. 93,32. 15,对应拷贝数为 5. 26 X IO6Copies/μ L，4· 24X IO6Copies/μ L， 1.1Χ IO3Copies/ μ L, 0. lcopies/ μ L 禾口 0. 05copies/ μ L。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 特异性引物、荧光探针1、材料RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR反应试剂均购自大连宝生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，ΜΧ3000Ρ型定量PCR仪为美国Agilent-Stratagene公 司广品。2、引物及探针设计与合成以DAB2IP基因序列(注册号为匪032552. 2)为模板，使用 PrimerExpress (V2. 0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组
5合。
检测用PCR引物和探针序列如下上游引物5‘ -TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3 ‘
下游引物5 ‘ -ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3 ‘荧光探针5'-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。均由大连宝生物工程有限公司合成。实施例2 荧光定量PCR法检测DAB2IP基因1、临床样本检测5例临床肿瘤组织标本，采用RNA提取试剂RNAi Plus (大连宝生物，D19108A)提 取总 RNA，分别取 1. Oug进行逆转录反应，2 X RT buffer, 10. 0 μ L ；dNTP (IOmM)，1 μ L ；Oligo dT (IOuM) ,IuL ；RNA inhibitor，0. 5 μ L ;RTase，1 μ L ；总 RNA 1 μ g，水补足至 20 μ L。逆转 录条件30°C，10分钟；42°C，30分钟；95°C，5分钟后取Iul cDNA做模板，用检测用上下游 引物在Agilent-Stratagene MX3000P定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应液组成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L检测用上游引物(10 μ Μ)IuL检测用下游引物(10 μ Μ)IuL检测用荧光探针(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 15秒、60°C 45秒进行40个循环扩增。构建以不含有标准品序列的质粒片段为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以 阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值 线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。同时在相同条件下以不同浓度标准品(TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCG GCCGCTGA CCTCCCAGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。)进 行检测，并绘制标准曲线。待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中DAB2IP基因的 拷贝数。以非人源性细胞为待测样品，按照上述方法进行检测，检测结果均为阴性，说明本 发明方法特异性强。2、样品检测结果标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。5例患者样本检出含有DAB2IP基因的不同拷贝数，检测结果参见图3:5例临 床样本荧光定量PCR检测结果，CT值为16. 18，16. 59，27. 02，31. 93，32. 15，对应拷贝数为 5. 26 X IO6Copies/ μ L,4. 24X IO6Copies/ μ L, 1. 1 X IO3Copies/μ L，0· lcopies/μ L 和 0.05copies/μ L0由以上检测结果可知DAB2IP具有抑癌基因活性，表达降低可致相应癌基因活跃 复制，诱发肿瘤的增殖，浸润及转移。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
权利要求
1.一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR 缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序 列如下上游引物5 ‘ -TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括DAB2IP基因标准 品，所述标准品序列如下TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCCAGAGCACCAGGGCA ACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
3.一种DAB2IP基因的荧光定量PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反 应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下 上游引物5 ‘ -TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMARA为荧光淬灭基团；(3)选择荧光检测模式FAM荧光对应波长，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈 值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液 在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐 标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线，根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样 品 DNA 的拷贝浓度；所述标准品序列如下TGCGAAGTGGATCCCAGCAAGTGCTCGGCCGCTGACCTCCC AGAGCACCAGGGCAACCTCAGATGTGCTGCGAGCTGGCCTTCTGCAAGATCATCAACTCCTACTGTGT。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件如下95°C变性2分 钟，95°C 15秒、60°C 45秒，进行40个循环扩增。
全文摘要
本发明提供了一种DAB2IP基因的实时荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5′-TGTGAAGTGGACCCAAGCAA-3′，下游引物5′-ACGCAGTAGGAGTTGATGATTTTG-3′，荧光探针5′-FAM-CCCGAGCACCAGGGCAACCTC-TAMRA-3′，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在采用本发明方法，DAB2IP基因的检测灵敏度高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对DAB2IP基因快速、准确、特异检测和分析，也可加入标准品进行定量检测，同时还可以加入管家基因(如β-actin基因等)进行相对定量检测。
文档编号G01N21/64GK102002524SQ201010540450
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者徐农, 方维佳, 林才照 申请人:浙江大学