专利名称：一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测食源性土霉素残留的试纸条及其制备方法。
技术背景
土霉素(OTC)是常见的四环素类抗生素，分子量为460，为灰黄色结晶粉末，难溶 于水，盐酸盐在水中溶解度为500mg/mL，微溶于乙醇，在空气中稳定。土霉素抗菌谱广，对革 兰氏阳性菌和阴性菌、立克次氏体、支原体、衣原体等原核微生物均有抑菌作用且对某些酵 母及原生动物等真核微生物也有抑制效果。
由于土霉素抗菌效果好，价格低廉等优点而被广泛应用于水产养殖业，用于多种 水产动物的细菌性疾病防治，淡水鱼类烂鳃病、肠炎病、赤皮病等。但是由于养殖过程中土 霉素的长期滥用，导致了在水产品中的大量残留，其对人体健康、生态环境、水产品贸易等 方面造成了严重的危害。国家农业部规定土霉素在肌肉中最高残留限量为100 μ g/kg，在水 产品中的最高残留限量为100 μ g/kg。
目前，应用于土霉素抗生素残留的检测方法主要有仪器分析法和免疫分析法两大 类。前者主要包括高效液相色谱，高效液相色谱串联质谱等，具有精确度高、灵敏等优点，但 其存在操作繁琐、样品处理复杂、成本高、不适合现场检测等缺点。酶联免疫检测方法所需 试剂主要依赖进口，费用较高。发明内容
本发明是为了解决现有检测土霉素的方法操作繁琐，样品处理复杂，不适合现场 检测的问题，提供一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条及其制备方法。
本发明的一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条，由PVC背板、样品 垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成，在PVC背板上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝 酸纤维素膜和吸收垫，所述样品垫与所述结合垫之间有搭接，所述结合垫与所述硝酸纤维 素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫之间有搭接；所述结合垫上包被有抗土 霉素单克隆抗体-胶体金标记物，包被量为0. 1 μ g ；所述硝酸纤维素膜上分别包被有土霉 素-载体蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线，包被量均为0. 05 μ g。
上述的一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法，按以下步 骤进行一、土霉素人工抗原的合成将邻联甲苯胺(o-Tolidine)溶解于0. 2 0. 3mol/ L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光 反应0.5 lh，得到溶液A，称取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH值为 7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂缓冲液中，并加入上述溶液A，避光反应2 池，在0 4°C 条件下用0. lmol/L的磷酸盐缓冲液透析2 3天，每隔6 他换一次磷酸盐缓冲液，透 析完成后，于5000 6000r/min条件下离心5 lOmin，弃去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA;二、制备土霉素-载体蛋白偶联物，然后包被在硝酸纤维素膜上构4成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；三、制备抗土霉素单克隆抗 体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗土霉素单克隆抗体加入胶体金 溶液中，制得抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫上；五、在PVC背板 上依次连续粘附样品垫、步骤四所得结合垫、步骤二所得硝酸纤维素膜和吸水垫，然后切成 60mmX4mm的试纸条，即得到用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条；步骤一中每 毫克邻联甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克邻联甲苯胺加入0. 01 0. 03mL的 NaNO2溶液；步骤一中土霉素与牛血清白蛋白的质量比为1 1.5 2，硼砂缓冲液和溶液 A与土霉素的体积比分别为8 10 1和4 6 1 ；步骤二中土霉素-载体蛋白偶联物 和羊抗鼠IgG的包被量均为0. 05 μ g ；步骤四中抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物的包 被量为0. 1 μ g。
本发明的原理当待测样品溶液滴入试剂条的加样区后，样品溶液因纤维素膜载 体的毛细管作用向另一端扩散。在移动过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶 体金的颜色显示出来。如果样品溶液中含有土霉素残留，土霉素将与结合垫上的抗土霉素 单克隆抗体-胶体金标记物先行反应，因此当胶体金颗粒随着样品溶液扩散至检测线时， 胶体金颗粒上的抗体的活性位点因被样品溶液中的土霉素占据而无法与检测线上土霉素 特异性抗原结合；所以当样品中的土霉素含量超过试纸条检出限时，试纸条上的检测线将 较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中土霉素含量在试纸条检出限以下 或者无残留时，试纸条上的检测线显色与控制线相近偏深，判定为阴性。
本发明用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条特异性强，灵敏度高，检出 限为5 μ g/kg，重复性好，使用时样品制备简单，检测操作简易，适于实地现场操作。
图1为具体实施方式
一制备的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的 示意图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一结合图1说明本实施方式，本实施方式用于检测肉类及水产品 中土霉素残留的试纸条，由PVC背板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5组 成，在PVC背板1上依次连续粘附有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5，所述 样品垫2与所述结合垫3之间有搭接，所述结合垫3与所述硝酸纤维素膜4之间有搭接，所 述硝酸纤维素膜4与所述吸收垫5之间有搭接；所述结合垫3上包被有抗土霉素单克隆抗 体-胶体金标记物，包被量为0. 1 μ g ；所述硝酸纤维素膜4上分别包被有土霉素-载体蛋 白偶联物构成的检测线T和羊抗鼠IgG构成的质控线C，包被量均为0. 05 μ g。
本实施方式中的PVC背板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5均购 自上海金标生物科技有限公司。
本实施方式用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的示意图如图1所示。
本实施方式用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条特异性强，灵敏度高，检出限为5yg/kg。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是硝酸纤维素膜4上包 被的土霉素-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为卵清蛋白(OVA)。其它与具体实施方式
一相 同。
具体实施方式
三本实施方式用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制 备方法，按以下步骤进行一、土霉素人工抗原的合成将邻联甲苯胺(o-Tolidine)溶解于 0. 2 0. 3mol/L的0 4°C的HCl溶液中，然后逐滴加入；35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于 4°〇，避光反应0.5 11!，得到溶液六，称取土霉素(OTC)和牛血清白蛋白(BSA)，溶解于pH 值为7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂缓冲液中，并加入上述溶液A，避光反应2 池，在0 4°C条件下用0. lmol/L的磷酸盐缓冲液透析2 3天，每隔6 他换一次磷酸盐缓冲液， 透析完成后，于5000 6000r/min条件下离心5 lOmin，弃去沉淀，得到土霉素免疫抗原 OTC-o-Tolidine-BSA ；二、制备土霉素-载体蛋白偶联物，然后包被在硝酸纤维素膜4上构 成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜4上构成质控线；三、制备抗土霉素单克隆 抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗土霉素单克隆抗体加入胶体金 溶液中，制得抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫3上；五、在PVC背板 1上依次连续粘附样品垫2、步骤四所得结合垫3、步骤二所得硝酸纤维素膜4和吸水垫5， 然后切成60mmX4mm的试纸条，即得到用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条；步 骤一中每毫克邻联甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克邻联甲苯胺加入0. 01 0.03mL的NaNO2溶液；步骤一中土霉素与牛血清白蛋白的质量比为1 1.5 2，硼砂缓冲 液和溶液A与土霉素的体积比分别为8 10 1和4 6 1 ；步骤二中土霉素-载体蛋 白偶联物和羊抗鼠IgG的包被量均为0. 05 μ g ；步骤四中抗土霉素单克隆抗体-胶体金标 记物的包被量为0. lyg。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤一中每毫克邻联 甲苯胺加入0. ISmL的HCl溶液。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三或四不同的是步骤一中每毫克 邻联甲苯胺加入0. 02mL的NaNO2溶液。其它与具体实施方式
三或四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
三至五之一不同的是步骤一中透 析完成后，于^OOr/min条件下离心5min。其它与具体实施方式
三至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤二中制备土霉 素-载体蛋白偶联物的具体步骤为将125mg邻联甲苯胺溶解于22. 5mL的0. 2mol/L的0°C 的HCl溶液中，然后逐滴加入35mg/mL的NaNO2溶液2. 5mL,于4°C避光反应lh，得到溶液A， 称取0. 08g 土霉素和0. 085g卵清蛋白(OVA)，溶解于IOmL的pH值为7. 4的0. lmol/L的硼 砂缓冲液中，并加入5mL上述溶液A，避光反应2小时，用0. lmol/L的磷酸盐缓冲液于4°C 透析3天，每隔他换一次磷酸盐缓冲液，透析完后，于5000r/min离心5min，弃去沉淀，即得 到土霉素-载体蛋白偶联物。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤二中检测线和质控 线的制备方法为a、用点膜机将土霉素-载体蛋白偶联物和羊抗小鼠IgG包被在纤维素膜 上，分别作为检测线和质控线；b、然后于37°C恒温箱中固定15min，再经封闭液封闭30min， 然后用PBST缓冲液冲洗3次后，于37°C烘干，即完成检测线和质控线的制备；其中步骤a中土霉素-载体蛋白偶联物和羊抗小鼠IgG的包被量均为0. 05μ g ；步骤b中的封闭液由 0. 01mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液和质量浓度1 %的牛血清白蛋白组成；步骤b中 的PBST缓冲液为含0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤三中制备抗土霉 素单克隆抗体的具体步骤为a、将1001^土霉素免疫抗原0几-0-1101丨肚1^-834溶解于 100 μ L生理盐水中，然后与等体积的弗氏佐剂混合乳化，乳化完全，然后首次免疫采用皮 下多点注射BALB/c小鼠，注射剂量为ImL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳化土霉素 免疫抗原，采用腹腔注射小鼠，注射剂量为0. 3mL/只；C、之后每隔一周使用弗氏不完全佐 剂乳化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射免疫小鼠，注射剂量为0. 3mL/只，第5次免疫后，尾 静脉采血，血液置于4°C静置Mh，然后于5000r/min离心lOmin，取上清采用间接非竞争 ELISA测定抗血清效价，当抗血清效价达到1 6400以上，取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞进 行细胞融合；d、用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞；e、向小鼠腹腔注射0. 5mL 无菌液体石蜡，取阳性杂交瘤细胞，于2500r/min离心5min，将沉淀用磷酸盐缓冲液冲洗3 次，之后将沉淀用无血清培养基稀释至细胞浓度为IO5个/mL，注入小鼠腹腔，待腹腔膨大， 采集腹水，于4°C且转速2500r/min条件下离心IOmin取上清，采用辛酸-硫酸铵法进行纯 化，获得抗土霉素单克隆抗体。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤四中采用柠檬酸三 钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤为a、取一个250mL三角瓶，加IOOmL双蒸水及ImL质 量浓度为的氯化金，加热至沸腾；b、加入2. 5mL质量浓度为1 %的柠檬酸钠水溶液，混 勻，继续加热沸腾30min ；c、溶液颜色首先变黑，再逐渐变紫红，冷却后，于4°C下保存，即完 成胶体金溶液制备。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤四中制备抗土霉 素单克隆抗体-胶体金标记物的具体步骤为a、将pH值为7. 2的胶体金溶液置于磁力搅拌 器上，将抗土霉素单克隆抗体逐滴加入胶体金溶液中，5min加入Img抗土霉素单克隆抗体， 搅拌30min ；加入牛血清白蛋白至终浓度为1%，继续搅拌30min ；然后置于4°C作用池后， 于4°C，2000r/min条件下离心20min，去沉淀；上清继续在4°C，10000r/min条件下离心lh， 去上清，得沉淀，即完成抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备。其它与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
十二 本实施方式用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试 纸条的制备方法，按以下步骤进行一、土霉素人工抗原的合成将125mg邻联甲苯胺 (o-Tolidine)溶解于22. 5mL的0. 2mol/L的0 °C的HCl溶液中，然后逐滴加入2. 5mL的 35mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光反应lh，得到溶液A，称取0.08g 土霉素(OTC)和 0. 145g牛血清白蛋白(BSA)，溶解于IOmL的pH值为7. 4的0. lmol/L的硼砂缓冲液中，并 加入5mL上述溶液A，避光反应2h，在4°C条件下用0. lmol/L的磷酸盐缓冲液透析3天，每 隔几换一次磷酸盐缓冲液，透析完成后，于5000r/min条件下离心5min，弃去沉淀，得到土 霉素免疫抗原OTC-o-Tolidine-BSA ；二、制备土霉素-载体蛋白偶联物，然后包被在硝酸纤 维素膜4上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜4上构成质控线；三、制备抗 土霉素单克隆抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗土霉素单克隆抗 体加入胶体金溶液中，制得抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫3上；五、在PVC背板1上依次连续粘附样品垫2、步骤四所得结合垫3、步骤二所得硝酸纤维素膜 4和吸水垫5，然后切成60mmX4mm的试纸条，即得到用于检测肉类及水产品中土霉素残留 的试纸条；其中步骤二中土霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的包被量均为0. 05 μ g ；步 骤四中抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物的包被量为0. 1 μ g。
本实施方式制备的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的使用方法
1、样品制备称取2g待检样品(肉类或水产品)，用4mL甲醇旋涡振荡2min，过 滤，滤液用PBST缓冲液稀释10倍，得待测液，备用。
2、检测步骤将制备的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条插入上述1 制备的待测液中，竞争反应5min后取出，目视辨别颜色深浅。
3、结果判断读取结果时，将试纸条水平放置于观察者正面。
阴性结果检测线T的颜色比质控线C深或者与质控线C 一样深，表明样品中土霉 素浓度低于5 μ g/kg或者无土霉素残留。
阳性结果检测线T显色比质控线C浅，或者检测线T无显色，表明样品中土霉素 浓度高于5 μ g/kg ；检测线T或质控线C越浅，表明样品中土霉素浓度越高。
无效若质控线C不显色，可能是操作不当或者试剂条已经失效。
权利要求
1.一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条，其特征在于用于检测肉类及水 产品中土霉素残留的试纸条，由PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成，在 PVC背板上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述样品垫与所述结 合垫之间有搭接，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述 吸收垫之间有搭接；所述结合垫上包被有抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，包被量为 0. Iug ；所述硝酸纤维素膜上分别包被有土霉素-载体蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠 IgG构成的质控线，包被量均为0. 05 μ g。
2.根据权利要求1所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条，其特征在于 硝酸纤维素膜上包被的土霉素-载体蛋白偶联物中的载体蛋白为卵清蛋白。
3.如权利要求1所述的一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方 法，其特征在于用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法，按以下步骤进 行一、土霉素人工抗原的合成将邻联甲苯胺溶解于0. 2 0. 3mol/L的0 4°C的HCl溶 液中，然后逐滴加入35 36mg/mL的NaNO2溶液，置于4°C，避光反应0. 5 lh，得到溶液 A，称取土霉素和牛血清白蛋白，溶解于pH值为7. 2 7. 4的0. lmol/L的硼砂缓冲液中， 并加入上述溶液A，避光反应2 池，在0 4°C条件下用0. lmol/L的磷酸盐缓冲液透析 2 3天，每隔6 他换一次磷酸盐缓冲液，透析完成后，于5000 6000r/min条件下离心 5 lOmin，弃去沉淀，得到土霉素免疫抗原；二、制备土霉素_载体蛋白偶联物，然后包被 在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；三、制 备抗土霉素单克隆抗体；四、采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，然后将抗土霉素单克 隆抗体加入胶体金溶液中，制得抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫 上；五、在PVC背板上依次连续粘附样品垫、步骤四所得结合垫、步骤二所得硝酸纤维素膜 和吸水垫，然后切成60mmX4mm的试纸条，即得到用于检测肉类及水产品中土霉素残留的 试纸条；步骤一中每毫克邻联甲苯胺加入0. 16 0. 2mL的HCl溶液，每毫克邻联甲苯胺加 入0.01 0.03mL的NaNO2溶液；步骤一中土霉素与牛血清白蛋白的质量比为1 1. 5 2，硼砂缓冲液和溶液A与土霉素的体积比分别为8 10 1和4 6 1;步骤二中土 霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG的包被量均为0. 05μ g ；步骤四中抗土霉素单克隆抗 体-胶体金标记物的包被量为0. 1 μ g。
4.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法， 其特征在于步骤一中每毫克邻联甲苯胺加入0. ISmL的HCl溶液。
5.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法， 其特征在于步骤一中每毫克邻联甲苯胺加入0. 02mL的NaNO2溶液。
6.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法， 其特征在于步骤二中制备土霉素-载体蛋白偶联物的具体步骤为将125mg邻联甲苯胺溶 解于22. 5mL的0. 2mol/L的0°C的HCl溶液中，然后逐滴加入:35mg/mL的NaNO2溶液2. 5mL， 于4°C避光反应lh，得到溶液A，称取0. 08g 土霉素和0. 085g卵清蛋白，溶解于IOmL的pH 值为7. 4的0. lmol/L的硼砂缓冲液中，并加入5mL上述溶液A，避光反应2小时，用0. Imol/ L的磷酸盐缓冲液于4°C透析3天，每隔他换一次磷酸盐缓冲液，透析完后，于5000r/min 离心5min，弃去沉淀，即得到土霉素-载体蛋白偶联物。
7.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法，其特征在于步骤二中检测线和质控线的制备方法为a、用点膜机将土霉素-载体蛋白偶联 物和羊抗小鼠IgG包被在纤维素膜上，分别作为检测线和质控线；b、然后于37°C恒温箱中 固定15min，再经封闭液封闭30min，然后用PBST缓冲液冲洗3次后，于37°C烘干，即完成 检测线和质控线的制备；其中步骤a中土霉素-载体蛋白偶联物和羊抗小鼠IgG的包被量 均为0. 05 μ g ；步骤b中的封闭液由0. 01mol/L的pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液和质量浓度 的牛血清白蛋白组成；步骤b中的PBST缓冲液为含0. 05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方法， 其特征在于步骤三中制备抗土霉素单克隆抗体的具体步骤为a、将IOOyg 土霉素免疫抗 原溶解于IOOyL生理盐水中，然后与等体积的弗氏佐剂混合乳化，乳化完全，然后首次免 疫采用皮下多点注射BALB/c小鼠，注射剂量为ImL/只；b、两周后，改用弗氏不完全佐剂乳 化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射小鼠，注射剂量为0. 3mL/只；C、之后每隔一周使用弗氏 不完全佐剂乳化土霉素免疫抗原，采用腹腔注射免疫小鼠，注射剂量为0. 3mL/只，第5次免 疫后，尾静脉采血，血液置于4°C静置Mh，然后于5000r/min离心lOmin，取上清采用间接 非竞争ELISA测定抗血清效价，当抗血清效价达到1 6400以上，取小鼠脾细胞，与骨髓瘤 细胞进行细胞融合；d、用间接酶联免疫吸附试验筛选阳性杂交瘤细胞；e、向小鼠腹腔注射 0. 5mL无菌液体石蜡，取阳性杂交瘤细胞，于2500r/min离心5min，将沉淀用磷酸盐缓冲液 冲洗3次，之后将沉淀用无血清培养基稀释至细胞浓度为IO5个/mL，注入小鼠腹腔，待腹腔 膨大，采集腹水，于4°C且转速2500r/min条件下离心IOmin取上清，采用辛酸-硫酸铵法进 行纯化，获得抗土霉素单克隆抗体。
9.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方 法，其特征在于步骤四中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液的具体步骤为a、取一个 250mL三角瓶，加IOOmL双蒸水及ImL质量浓度为1 %的氯化金，加热至沸腾；b、加入2. 5mL 质量浓度为的柠檬酸钠水溶液，混勻，继续加热沸腾30min ；c、溶液颜色首先变黑，再逐 渐变紫红，冷却后，于4°C下保存，即完成胶体金溶液制备。
10.根据权利要求3所述的用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条的制备方 法，其特征在于步骤四中制备抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物的具体步骤为a、将pH 值为7. 2的胶体金溶液置于磁力搅拌器上，将抗土霉素单克隆抗体逐滴加入胶体金溶液 中，5min加入Img抗土霉素单克隆抗体，搅拌30min ；加入牛血清白蛋白至终浓度为1 %，继 续搅拌30min ；然后置于4°C作用2h后，于4°C，2000r/min条件下离心20min，去沉淀；上清 继续在4°C，lOOOOr/min条件下离心lh，去上清，得沉淀，即完成抗土霉素单克隆抗体-胶体 金标记物的制备。
全文摘要
一种用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条及其制备方法，涉及一种检测食源性土霉素残留的试纸条及其制备方法。本发明为了解决现有检测土霉素的方法操作繁琐，样品处理复杂，不适合现场检测的问题。试纸条由PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。制备方法一、土霉素人工抗原的合成；二、制备土霉素-载体蛋白偶联物，制成检测线和质控线；三、制备抗土霉素单克隆抗体；四、制备胶体金溶液，制得抗土霉素单克隆抗体-胶体金标记物，然后包被在结合垫上；五、在PVC背板上依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，即得到用于检测肉类及水产品中土霉素残留的试纸条。应用于食源性土霉素残留检测领域。
文档编号G01N33/558GK102043057SQ20101054096
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者丁忠庆, 代翠红, 崔艳华, 徐桂连, 马莺 申请人:哈尔滨工业大学