专利名称：一种雨生红球藻粉及提取物虾青素含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种虾青素含量的测定方法，具体涉及采用分光光度计和/或高效 液相色谱法测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物或其制剂中虾青素含量的方法。
背景技术：
雨生红球藻(Haematococcus)是一种单细胞绿藻，在逆境条件下可积累大量的虾 青素，被公认为自然界天然虾青素的主要来源。采用超临界流体CO2技术的雨生红球藻 提取物除富含有天然抗氧化剂虾青素外，还含有维生素Bi、B2、B6、B12、单不饱和脂 肪酸、多不饱和脂肪酸等人体必需的营养成分。虾青素(astaxanthin)是一种红色的天然类胡萝卜素，具有清除氧自由基的强 大能力，其抗氧化活性是维生素的550倍、类胡萝卜素的10倍，被誉为“超级抗氧化 齐[J” (1、 Nakagawa K, Kang S， Park D, et al.Inhibition bybeta carotene and astaxanthin of NADPH dependent mi crosomal phospholipidperoxidation[J],Nutrit Sci Vitam in, 1997, 43, 3: 345 ； 2、 Naguib YMAAntioxidant activities of astaxanthinand related carotenoids[J], Agric FoodChem, 2000，48，1150.)，对人体绝对安全(1、Nishikawa Y, Minenaka Y, Ichimura Μ.Physiological and biochemical effects of carotenoid beta caroteneand astaxanthin on rat J Kashien Daigku Kiya 1997, 25: 19; 2、Aquasearch IncTechnical Report TR.3005.001. Haematococcus pluvialis and astaxanthinsafety for human consumption, 1999.)。 动物禾口临 床试验研究证明，虾青素有增强免疫功能、抑制肿瘤发生、预防心血管疾病、防止皮肤 衰老、维护眼睛及中枢神经系统健康等多种生物功能(Tanaka T，Morishita Y，SuzuiM, et al.Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesisgy naturallyoccurring caroteniod astaxanthin[J],Carcing Enesis, 1994, 15(1) 15-19; Jyonouchi, et al.2000.)。维生素Bl能促进血液循环、辅助盐酸制造、血流形成及糖类代谢；有助于人体 感知，并使脑功能发挥最佳状态；对能量代谢、生长、食欲、学习能力均起着积极的作 用；帮助人体抵抗衰老及烟酒对人体的不利影响。维生素B2是红细胞形成、抗体制造及 细胞呼吸作用及生长必须的。维生素B6有利于盐酸合成及脂肪、蛋白质的吸收，协助维 持体内钠钾平衡，促进红细胞的形成；另外还有利于解决体内水分滞留带来的不便，帮助脑和免疫系统发挥正常的生理机能；控制细胞增长和分裂的DNA、RNA等遗传物质的 合成也离不开B6。B6还可以活化体内的许多种酶，并有助于B12的吸收。维生素B12 是抗贫血所需的，它可协助叶酸调节红细胞的生成并有利于铁的利用；而且消化机能的 正常，食物的消化和蛋白质的合成，脂肪和糖类的代谢均需要维生素B12。此外B12还 有助于防止神经损伤，维持生育能力，促进正常的生长发育及防止神经脱髓鞘的作用。单不饱和脂肪酸具有降血糖作用(施万英，徐甲芬，蔺淑贤.单不饱和脂肪酸肠 内营养制剂(Clucema)用于2型糖尿病[J].中国临床营养杂志，2004，12(1) 39-42.)； 调节血脂作用(王军波，肖颖，梁学军，等.膳食脂质对中老年胆固醇血症患者血清胆 固醇的影响[J].卫生研究，2000，29(3))及降低胆固醇作用等。多不饱和脂肪酸对动脉血栓形成和血小板功能有明显影响，防止血栓形成(钟耀光.功能食品[M].北京化学工业出版社，2004，8 121-128.)。大量实验表明，多不饱和脂肪酸具有较好的抗癌作 用，其能通过降低胆固醇水平，抑制癌细胞生长；并参与细胞基因表达调控，提高机体 免疫能力，减少肿瘤坏死因子；多不饱和脂肪酸还能大大增加细胞膜的流动性，有利于 细胞代谢和修复，阻止肿瘤细胞的异常增生(1、钟耀光.功能食品[M].北京化学工业 出版社，2004，8 121-128.2、刘冀红，曹伟新.ω-3多不饱和脂肪酸在肿瘤防治中的意 义[J].肠外与肠内营养，2004，11(1) 54-56.)。由此可见，雨生红球藻提取物中含有大量对人体有益和人体必需的功能成分， 其用于保健品原料，应用前景十分广阔。文献报道的红球藻提取方法有溶剂法、超临界法、微波法、超声法等，而微波 法、超声法很少用于规模生产。由于虾青素油是雨生红球藻中主要的功效性成分，具有 较强抗氧化性，对光、热、氧、湿敏感不稳定，因此采用通常溶剂的提取工艺极易造成 氧化变质，若改成低温浸出法，化学试剂耗用量较大，油中类脂物及伴随物多给精炼带 来困难且有溶剂残留。国外利用以虾青素为主要功效成分的红球藻提取物制备保健食品及化妆品，其 产品定位主要是眼睛、免疫系统、皮肤保护、降低密度脂蛋白等方面。目前开发上市 的产品主要有口服制剂(软胶囊、硬胶囊)、化妆品(唇膏、面部护理霜、防晒霜、防 皱霜)，其功能定位主要是抗氧化(延缓衰老)、营养皮肤、缓解运动疲劳、降低密度 脂蛋白、防止皮肤免受紫外线损伤等。产品主要以美国Twinlab公司保健胶囊、美国 Cyanotech 公司的 Bioastin> 美国 Aquasearch 公司的 Astafactor Sport Formula> 日本Natureal 公司的Astacure系列化妆品为代表。现有的虾青素含量测定方法主要采用湖北荆州市天然虾青素有限责任公司企业 质量标准制定的方法。具体操作如下精确称取红球藻粉提取物0.5mg，置于带有刻度 的IOmL离心管中，向离心管中加入约5mL含有5%NaOH、30%甲醇的水溶液，将离心 管放入温度调控为70°C的恒温水浴中保温5分钟，保温过程中要经常摇动离心管，3500 转/min离心3min，去上清液，藻渣备用；向离心管中加入约2mL含有少量醋酸(1滴/ mL)的DMSO(二甲基亚砜)，摇勻，70°C保温5分钟，保温过程中要不断摇动离心管； 3500转/min离心3min，将上清液移入IOmL容量瓶中。剩余在离心管底部的藻渣应无色 或仅有很浅的颜色，如发现藻渣带有红色，再重复上述操作步骤，直到藻渣无色或仅有 很浅的颜色；将几次收集的上清液用DMSO精确定容至IOmL,取ImL放入另一个IOmL 的容量瓶中，用DMSO精确定容至IOmL,此溶液待测；将待测溶液放入Icm光径比色 杯中，在492nm波长下测定吸光值A;用下式计算所测溶液中虾青素的浓度C1=A492XlOOO/Al%cmXlOO式中C1——被测溶液中虾青素的浓度/(mg/mL)A492——492nm波长被测溶液吸光值A1%lcm——消光系数/(2220)用下式计算虾青素的含量
权利要求
1.一种虾青素含量的测定方法，所述方法采用分光光度计和/或高效液相色谱来测定虾青素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用分光光度计测定虾青素的含量 包括以下步骤1)将样品溶于丙酮中；2)于474nm处读取样品溶液吸光值；3)按下式计算虾青素质量百分比
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱测定虾青素的含 量包括以下步骤1)将样品溶于丙酮，并加入胆留醇酯酶溶液水解，使溶液中的虾青素酯水解为游离 虾青素；2)测定虾青素的色谱条件如下C18柱，流动相为丙酮、水和乙酸乙酯，流速为 1.2mL/min,梯度洗脱条件为O 20分钟(82%丙酮+8%水+10%乙酸乙酯)，20 24 分钟(29%丙酮+1%水+70%乙酸乙酯)，24 30分钟(82%丙酮+8%水+10%乙酸乙 酯)，检测波长为474nm;3)按下式计算虾青素含量RF-虾青素=[P (trans-asta)标+1.2P(9-cis)+1.6P(13_cis)]/C 标C 样=[P (trans-asta)样+1.2P(9-cis)+1.6P(13_cis)]/RF-虾青素其中，RF-虾青素=虾青素响应因子；C标(μ g/mL)为虾青素标准品浓度，该值可 由下式计算出(其中92%为虾青素比例系数，V(mL)为总稀释体积)
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述虾青素为雨生红球 藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻提取物制剂中包含的虾青素。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述雨生红球藻提取物是通过以CO2为 萃取介质的超临界流体萃取方法制备的，具体的萃取条件如下温度为60 80°C，压力 为35 45MPa，CO2流速为15 25L/h，时间为2 4小时。
全文摘要
本发明提供一种测定虾青素含量的方法。本发明提供的测定虾青素含量的方法，采用分光光度计与高效液相色谱测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻提取物制剂中包含的虾青素，适用范围广，测定的可靠性和准确性高。
文档编号G01N21/31GK102012363SQ20101054823
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者张秋玲, 杜伟春, 杨瑜, 王朝军, 龙祥 申请人:云南绿A生物工程有限公司