专利名称：一种基于生物活性检测的熟地黄品质评价方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种基于生物活性检测的熟地黄品质评价方法。
背景技术：
现行中药内在品质评价和质量控制采取部分指标性成分定性检测和/或含量测定的模式，由于目前绝大多数中药药效物质不明确，这种模式既难以保证该类中药质量的一致性和稳定性，也难以关联或反映其临床使用的安全性和有效性。《中国药典》2010年版编制大纲明确指出，要建立符合中医药特点的质量标准体系，逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分及和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化。由此而制定的“中药生物活性测定指导原则”已被《中国药典》(一部)2010年版(出版日期2010年1月)附录收载。中药熟地是临床最常用的补益类中药之一，当前的质量标准主要是测定单一指标毛蕊花糖苷的含量，而地黄的化学本底较为复杂，地黄苷、地黄多糖、麦角留苷等等都是它的有效成分，其质量控制指标与药效的相关性有待于进一步研究。生物活性测定法引入中药质量控制和品质评价体系，对于成分多样、结构复杂、理化方法不能表征其含量、理化测定不能反映生物活性和疗效的中药能凸显其优越性。因此， 以地黄为研究对象，建立以药效为基础的中药质量生物测定方法，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和品质评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的思路和参考，是需要认真解决的技术问题。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于生物活性检测的熟地黄品质评价方法，可有效解决从多重角度评价熟地黄的品质、进而保证熟地黄药用质量的问题。本发明解决的技术方案是，工艺步骤(流程)为药材一前处理一制备供试品一清除自由基反应实验一测定自由基清除率一供试品与工作对照品进行比较一计算效价一方法学考察一适用性研究(测定多批次样品效价值)一进行品质评价，即将熟地黄粉碎干燥，取粉末于容器中，用乙醇超声提取，水浴挥去乙醇，干燥，再将干燥物溶于乙醇中制成梯度乙醇溶液，成供试品，备用；再选取多批熟地黄均勻取样，分别粉碎，等量选取粉末混合， 溶于乙醇中制成工作对照品，备用；然后将二苯代苦味酞基自由基(DPPH*)溶解于无水乙醇中，避光保存；上述三种溶液制备后进行加样与检测，分别测定各溶液的吸光度并计算供试品对二苯代苦味酞基自由基(DPPH*)的清除率，然后进行样品与对照品的对比检定，计算供试品的效价，以实现对熟地黄的品质评价。本发明以熟地黄为对象，建立以药效为基础的中药质量生物测定方法，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和品质评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的技术条件。
四
图1为本发明中熟地黄清除DPPH*活性量效关系图。图2为本发明中熟地黄清除DPPH*活性量效关系线性分析图。图3为本发明中样品测定结果趋势对比图。
五具体实施例方式以下结合具体情况，对本发明的具体实施方式
作详细说明。首先要指出的是，熟地黄具有抗氧化、清除自由基作用，是临床最常用的传统补益类中药之一，现代药理研究表明抗氧化、清除机体过氧自由基是其增强体质、调节免疫主要作用机制之一。研究表明熟地黄的不同提取物具有显著地体内外抗氧化和清除过氧自由基的作用。二苯代苦味酞基自由基(DPPtf)化学结构为1，1_ 二苯基-2-三硝基苯胼(1， 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2, 2-Diphenyl-l-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl)分子式=C18H12N5O6是一种自由基，带有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色。当有抗氧化(清除自由基)成分存在时，可与其单电子配对而使其吸收逐渐消失， 其褪色程度表明了抗自由基成分与DPPH*单电子结合的数量或能力，因而可用分光光度计进行测定反应体系吸光度的变化，而定量表征抗氧化成分或物质的抗氧化能力，如测定生物试样、化学物质和食品等的抗氧化能力。本发明方法中使用以下仪器与试剂分析天平，上海精密电子仪器有限公司， FA200KA型；离心机，北京医用离心机厂，LD4-2型；UV-2201分光光度计，日本岛津公司； SY-360超声波提取仪，上海宁商超声仪器有限公司；XDW-6B低温粉碎机；101-1A电热鼓风
干躁箱。生地黄(产地采集与药材市场采购相结合，共20批，均为上一年11——12月份收获，经河南中医学院陈随清教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmarmia glutinosa Libosch.的块根)。按《中国药典》(2010年1月版.一部)所收载“熟地”项下规定方法制成熟地黄。DPPH*(美国Sigma公司)；无水乙醇(分析纯，郑州连邦化工有限公司)；其余试剂均为分析纯。本发明在具体实施时，是由以下步骤实现的A、供试品(又称待测样品，以下同)的制备1)将熟地黄置低温粉碎机中，在-40°C状态下制成粉末，过40目筛；2)对所制样品粉末在60°C热风循环烘箱中干燥至含水量< 3%，置棕色瓶中密闭保存；3)称取样品粉末2g于锥形瓶中加入粉末重量的10倍乙醇，常温超声提取30分钟，所得提取液用滤纸滤过，弃去残渣，置表面皿中，水浴挥去乙醇，计算回收率后密封保存干燥物；4)将干燥物溶于乙醇中，分别制成浓度为Xg(生药) mL—1溶液(X分别等于1.0000、0· 5000、0· 2500、0· 1250、0· 0625、.........)；B、工作对照品的制备；20批熟地黄药材均勻取样充分混合之粉末为工作参照物，测定时，亦按A之步骤 3) 4)制备成溶液，作为工作对照品；C、DPPH*溶液的制备精密称取40mg DPPH*,溶解于480mL无水乙醇，再加无水乙醇定容至500mL。所得 DPPH*溶液的浓度为20mM，冰箱避光保存；D、加样与检测按表1加样于具塞试管中，充分混勻，室温静置30min，于517nm波长处测定吸光度 (以无水乙醇做空白)；表1加样方法与加样量
权利要求
1. 一种基于生物活性检测的熟地黄品质评价方法，其特征在于，由以下步骤实现的A、供试品的制备1)将熟地黄置于粉碎机中，在-40°C状态下制成粉末，过40目筛；2)对所制粉末在60°C热风循环烘箱中干燥至含水量<3%，置棕色瓶中密闭保存；3)称取粉末2g于锥形瓶中加入粉末重量的10倍乙醇，常温超声提取30分钟，所得提取液用滤纸滤过，弃去残渣，置表面皿中，水浴挥去乙醇，密封保存干燥物；4)将干燥物溶于乙醇中，分别制成浓度为每mL含生药为1.0000g、0. 5000g、0. 2500g、 0. 1250g、0. 0625g，成供试品；B、工作对照品的制备将20批熟地黄均勻取样，分别粉碎，选取等量的粉末充分混合，作为工作参照物，按步骤A制备成溶液，作为工作对照品；C、DPPH*溶液的制备称取40mg DPPH*,先溶解于480mL无水乙醇，再加无水乙醇至500mL，置冰箱内避光保存；D、加样与检测将2mL DPPH*溶液+2mL无水乙醇，将2mL DPPH*+2mL供试品溶液，将2mL无水乙醇+2mL 供试品溶液，分别置于试管中，充分混勻，室温静置30min，于517nm波长处测定吸光度，以无水乙醇做空白；E、加样量的调整为效价计算的方便，需根据预实验与供试品的效价估计，对供试品的加样量进行必要调整，保证反应强度围绕清除率P在士50%，并保证供试品与工作对照品反应的量效关系曲线平行；F、数据处理与效价计算1)根据下列公式计算测定液对DPPtf的清除率PP = [I-(Ai-Aj)/Ac] X 100%，其中Ac为2mL DPPH*溶液+2mL无水乙醇的溶液在测定波长处的吸光度；Ai为2mL DPP!T+2mL供试品溶液在测定波长处的吸光度；Aj为2mL无水乙醇+2mL供试品溶液在测定波长处的吸光度；2)效价计算设定工作对照品的效价Ps生药为1. OU · mg—1，根据平行线测定原理采用量反应的平行线测定法法，依照《中国药典》2010年1月版.二部附录XIV生物检定统计法，进行供试品与工作对照品效价的对比检定。
全文摘要
本发明涉及一种基于生物活性检测的熟地黄品质评价方法，可有效解决从多重角度评价熟地黄的品质、进而保证熟地黄药用质量的问题。本发明解决的技术方案是，工艺步骤为药材→前处理→制备供试品→清除自由基反应实验→测定自由基清除率→供试品与工作对照品进行比较→计算效价→方法学考察→测定多批次样品效价值→进行品质评价，本发明以熟地黄为对象，建立以药效为基础的中药质量生物测定方法，作为药典常规和化学测定的补充与提高，能够从多重角度共同把关其内在质量，完善现行质量控制和品质评价方法与标准，并能为其它药效物质不明确的中药质量控制与品质评价研究提供新的技术条件。
文档编号G01N21/31GK102175629SQ201010554359
公开日2011年9月7日 申请日期2010年11月23日 优先权日2010年11月23日
发明者刁青蕊, 吴宿慧, 张宾, 方晓艳, 李寒冰, 栗俞程, 王灿 申请人:河南中医学院