专利名称：碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
抗药性细菌KPC也就是碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae carbapenamase)，最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中被发现，属于Bush分类的2f 组，Ambler分类的A类，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素。目 前已有5个KPC亚型被国内外研究发现，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌属于2型。碳青霉烯 类药物通常用于对付其他抗生素无法应付的细菌感染，具有非常广泛的抗菌活性，因能抵 抗大多数内酰胺酶的水解，故常用于产超广谱-内酰胺酶(ESBL)和/或去阻遏AmpC-内酰 胺酶(AmpC)菌株引起严重感染的治疗。但是碳青霉烯耐药肠杆菌的出现，给临床治疗带来 了极大困难。从2000年以后，KPC酶家族陆续在美国的新英格兰和亚特兰大地区被发现， 主要在克雷伯菌属中，也在其他菌株中被发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感染菌，其 对碳青霉烯类抗菌药物的耐药给临床抗感染治疗带来了极大困难。KPC细菌被视为突破了 临床治疗的最后一道防线碳青霉烯类抗生素的生物体，碳青霉烯类抗生素都对它起不了作 用。据报道，巴西卫生部门2010年10月19日表示，截至10月15日，这种KPC超级细 菌已经在首都巴西利亚造成15人死亡，另有135人被感染，发病数量在过去几个星期以来 人数不断激增。美国卫生员说，现有抗生素几乎全都无法控制的一种超级细菌，已出现在美 国35州医院，其中纽约和新泽西出现感染最多。这种具有新基因的超级细菌也在世界其他 地方扩散。美国医院发现的这些细菌尤其容易感染危重病人，而且4亡率高达30%至60%。 美国疾病预防控制中心说，虽然KPC细菌在纽约和新泽西州最常见，可是美国一半以上的 州都发现其踪影。10年前美国各地医院发现的KPC细菌，只有对碳青霉烯类抗生素具 有抗药性，现在比率已超过8%。我国KPC-2酶基因主要见于我国华东地区，而其它地区鲜 有报道。由于KPC细菌对临床抗生素的使用产生极大影响，因此有必要建立一种碳青霉烯 酶肺炎克雷伯氏菌(KPC)快速、有效的诊断方法。
发明内容
本发明目的是根据碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因设计引物和TaqMan探针，提 供一种检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对碳青霉 烯酶肺炎克雷伯氏菌进行快速、准确、特异检测。本发明采用的技术方案是一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性 引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧 光探针序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘
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下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘荧光探针5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本 领域常规进行选择，该试剂盒可用作碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的定性检测，也可加入标 准品进行定量检测。优选的，所述试剂盒中还可包括碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因标准品，所述标 准品序列如下 :ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值 与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获 得样品DNA的拷贝浓度。本发明还涉及一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩 增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5'-TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3‘荧光探针5‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择非靶细菌，如副溶血性弧菌、 志贺菌、沙门菌、非耐药肺炎克雷伯氏菌等。(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线 刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈 良好的对数增长，则判断为阳性。为达到定量检测的要求，所述方法可同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在 与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为 横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准 曲线，获得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggcgcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcgaggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，优选的，所述PCR扩增 反应条件如下95°C变性2分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)PCR buffer终浓度为1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的荧光探针、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (约50ng/ μ 1)的模板，反应总体积通常为20 50 μ L。PCR buffer终浓度 为IX，是指缓冲液中各组分终浓度与IXPCR buffer相同，通常采用市购2XPCR buffer,体积用量为PCR反应液体系总体积的1/2。IXPCR buffer组成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgCl2L 5mM。本发明建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的 方法，并经检测临床样本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术，使得碳 青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌检测的敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特异 性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足够 的监测信息。本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏 感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR 模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果 经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR 产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定 量水平，因为即使PCR条件已优化到最佳程度，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给 结果分析带来影响，从而影响定量这的结果。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以 真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特 异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。本发明的有益效果主要体现在碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的检测敏感性高，特 异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌快速、准 确、特异检测。
图1为实时荧光定量PCR标准品检测碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌实时荧光定量 PCR标准品检测结果，从左至右分别为ΙΟ7、ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、103、IO2UO1Copies/ μ L标准品。图2为实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线为Y =-3. 494XlgX+34. 916 ;Υ:对 应的CT值；X 碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因的copies。图3为不同浓度的5例临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为24. 32、 25. 09,28. 15,28. 91 和 32. 97，拷贝数分别为 6. 58 X IO4Copies/μ L、3. 09 X IO4Copies/μ L、 7. 41 X IO2Copies/μ L、2. 25 X 102copies/μ L 和 0. 003copies/μ L。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 1、材料细菌基因组DNA提取试剂购自大连宝生物工程有限公司；限制性内切酶购自美国 LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系统、Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，测序试剂、 377 型测序仪、Bio-Rad icycler PCR 仪、Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 仪(Qiagen 公 司)。2、引物及探针设计与合成
以碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列(注册号为AY034847)为模板，使用 Primer Express (V2. 0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。标准品PCR序列上游引物5，-GGCACGGCAAATGACTATGC-3，，下游引物5，-CCCTCGAGCGCGAGTCTAGC-3，，检测用PCR序列为上游引物5‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘下游引物5‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘荧光探针5'-FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。均由上海辉睿生物科技有限公司合成。3、检测标准品制备采用ABI 394寡核苷酸合成仪根据碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌基因序列中标准 品PCR序列的位置，全基因合成140bp的寡核苷酸片段。用标准品上下游引物在Bio-Rad i eye Ier PCR仪上进行PCR扩增PCR反应液组成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L标准品上游引物(10 μ Μ)IuL标准品下游引物(10 μ Μ)IuLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ LdNTPs (各 250mM)1· 6 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板 DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR条件为94°C 5分钟变性，94°C 20秒、55°C 20秒、72°C 20秒进行35个循环扩 增，最后于72°C延伸5分钟后置4°C。PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆 经测序验证。回收140bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。4、结果经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下 ggcacggcaa atgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggccgtctacaccc gggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcggctagactcg cgctcgaggg(SEQ ID No. 4)。实施例2 荧光定量PCR法检测临床样本1、标本检测5例人工模拟标本，采用基因组DNA提取试剂提取基因组DNA，分别取LOyL做模 板，用检测用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR仪(Qiagen公司)上进行PCR 扩增。
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PCR反应液组成如下2 X PCR buffer10. 0 μ L检测用上游引物(10 μ Μ)IuL检测用下游引物(10 μ Μ)IuL检测用荧光探针(10 μ Μ)0. 5uLDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 2 μ L
dNTPs (各 250mM)1· 60 μ L(dATP、dTTP、dCTP、dGTP 物质的量比 1 1 1 1)模板DNA (50ng/ μ L)1 μ L水补足至20 μ L。PCR反应条件为95°C预变性2分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。以非耐药肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)为阴性对照于相同条件下进行PCR检 测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过 阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性，否则判断为阴性。同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的碳青霉烯酶 肺炎克雷伯氏菌基因的数量。以副溶血性弧菌(ATCC 17802)、志贺菌(ATCC 12022)、沙门菌(ATCC 50035)、金 黄色葡萄球菌(ATCC 25933)、非耐药肺炎克雷伯氏菌(ATCC 13883)和空肠弯曲菌(ATCC 33560)菌株按照上述方法进行PCR检测，检测结果均呈阴性，说明本发明方法特异性好。2、样品检测结果标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2。5例临床标本检出碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌阳性，检测结果参见图3 :5例阳 性临床标本荧光定量PCR检测结果，CT值分别为24. 32、25. 09、28. 15、28. 91和32. 97， 拷贝数分别为 6· 58X IO4Copies/μ L、3. 09X IO4Copies/μ L、7. 41 X IO2Copies/μ L、 2. 25 X 102copies/ μ L 和 0. 003copies/ μ L。本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
权利要求
1. 一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引 物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性 引物和荧光探针序列如下上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括碳青霉烯酶肺 炎克雷伯氏菌基因标准品，所述标准品序列如下ggcacggcaaatgactatgc cgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacacccgggcgcctaa caaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcgcgctcgaggg。
3. 一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反 应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下 上游引物5 ‘ -ACTGGGCGCGCACCTA-3 ‘ 下游引物5 ‘ -TCGCTGTGCTTGTCATCCTT-3 ‘ 荧光探针5 ‘ -FAM-CCGTCTACACCCGGGCGCC-TAMRA-3 ‘ 其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线刚好 超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好 的对数增长，则判断为阳性。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶 液在与样品DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横 坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获 得样品DNA的拷贝浓度；所述标准品DNA序列如下ggcacggcaa atgactatgccgtcgtctgg cccactgggc gcgcacctat tgtgttggcc gtctacaccc gggcgcctaacaaggatgac aagcacagcg aggccgtcat cgccgctgcg gctagactcg cgctcgaggg。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下95°C变性2 分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。
全文摘要
本发明提供了一种碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的荧光检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5′-ACT GGG CGC GCACCTA-3′，下游引物5′-TCG CTGTGC TTG TCATCC TT-3′，荧光探针5′-FAM-CCG TCT ACACCCGGG CGC C-TAMRA-3′，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本发明的有益效果主要体现在使用本发明检测试剂盒，碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现对碳青霉烯酶肺炎克雷伯氏菌的快速、准确、特异检测。
文档编号G01N21/64GK102002529SQ20101055497
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者张政, 程苏云, 罗芸, 金大智, 韩建康 申请人:浙江省疾病预防控制中心