专利名称：一种特异性含巯基氨基酸的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种简便、快速、高灵敏度、低检测限检测含巯基氨基酸的新方法。
背景技术：
含巯基氨基酸主要有半胱氨酸、同型半胱氨酸等，它们在血液中的平衡影响着人 类健康。半胱氨酸是一种天然产生的氨基酸，它的缺失会导致水肿。同型半胱氨酸是蛋氨酸 和半胱氨酸代谢过程中重要的中间产物，也是身体健康的重要指标，在健康状态下，其在血 液中的含量很低。如果身体代谢平衡失调，血液中的同型半胱氨酸将会积蓄，从而增加患病 风险。与之相关的疾病有50多种，包括心脏病、中风、某些癌症、糖尿病、忧郁症和老年性痴 呆等。研究证实血清同型半胱氨酸水平升高是动脉粥样硬化性血管病，动、静脉血栓栓塞以 及周围血管性疾病的一个重要的危险因素。目前，各种检测方法包括高效液相色谱、气-质 联用技术，电化学方法以及荧光检测能够有效检测含巯基氨基酸，但是这些检测方法过程 复杂、耗时、需要倚仗昂贵和高精密仪器，因此开发新型快速、特异性检测含巯基氨基酸方 法显得格外重要。本发明使用的方法实现了简便、快速、可视化检测含巯基氨基酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、高灵敏度、低检测限检测含巯基氨基酸的方 法。1)非修饰银纳米的合成6mL浓度为IOmM的NaBH4和200mL浓度为0. 25mM含有0. 25mM柠檬酸钠的AgNO3 溶液混合，充分搅拌30min，产生黄色溶液，静置过夜；2)ssDNA对银纳米的保护将步骤1)得到的98 μ L的银纳米溶液中加入2 μ L浓度为100 μ M ssDNA室温下 放置1小时，使ssDNA充分保护银纳米；3)含巯基氨基酸的标准溶液的检测将不同浓度的含巯基氨基酸的标准溶液分别加入步骤2)得到的ssDNA充分保护 的银纳米溶液中，静置1小时，加入IOOmM的NaNO3后，观察或者紫外分光法检测；4)待测样品检测检测样品加入步骤2)得到的ssDNA充分保护的银纳米溶液中，然后再加入IOOmM 的NaNO3,两分钟后稀释到500 μ L，观察颜色或者使用紫外吸收光谱仪进行分析。本发明原理见图1，银纳米颗粒本身由于其表面的静电效应分散于水溶液中形成 稳定的黄色的水溶胶，其静电作用非常小，以至于加入盐后，静电作用被屏蔽，发生聚沉，颜 色由黄色转变为深棕色。单链DNA(ssDNA)通过静电作用吸附在银纳米的表面，保护银纳米 颗粒抵抗盐诱导的聚集，当存在盐溶液时，颜色将不会发生改变。另一方面，含巯基氨基酸 通过Ag-S键吸附在银纳米颗粒的表面，由于其Ag-S键的作用强于ssDNA与银纳米之间的 静电吸附作用，当加入含巯基氨基酸检测物时，ssDNA被挤开从而失去其保护作用，银纳米
3在盐的诱导下发生聚沉，其溶液颜色发生变化，紫外吸收峰值降低，从而达到检测的目的。 同时，其它不含巯基的氨基酸则不能吸附在银纳米的表面，ssDNA的保护作用仍然存在，颜 色不发生改变(图幻。说明该方法具有很强的特异性。通过紫外吸收光谱仪分析可得知(图3、图4)图3显示，在没有同型半胱氨酸存 在的条件下，紫外吸收峰值非常高，随着同型半胱氨酸的加入，其峰值越来越低，其最低检 测线可以达到20nM。通过观察颜色我们可以看到，银纳米溶液颜色由黄色向棕色转变，其颜 色变化的临界浓度约为300nM，可知，用观察颜色法可以检测到300nM的同型半胱氨酸。通过本发明方法，实现了对血清样中的含巯基氨基酸特异性、快速检测。该方法与 传统方法相比，不仅具有较高灵敏度和特异性；同时，检测时间短、样品处理简单，在不使用 任何仪器条件下就可以实现对血样中含巯基氨基酸进行可视化便捷分析，节省了成本和时 间。
图1为本发明的原理图；图2为采用本发明方法的氨基酸特异性检测图(Atl表示空白样品银纳米393nm处 紫外吸收峰值，Ax表示加入了各氨基酸后银纳米393nm处紫外吸收峰值)；图3为不同浓度同型半胱氨酸的检测；图4为不同浓度半胱氨酸和谷胱甘肽检测(正方形点表示半胱氨酸浓度，三角形 点表示谷胱甘肽浓度)；图5为模拟样品中同型半胱氨酸检测流程图；图6为模拟样品中各氨基酸检测结果。
具体实施例方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。1)非修饰银纳米的合成6mL浓度为IOmM的NaBH4和200mL浓度为0. 25mM含有0. 25mM柠檬酸钠的AgNO3 溶液混合，充分搅拌30min，产生黄色溶液，静置过夜；2) ssDNA对银纳米的保护将步骤1)得到的98 μ L的银纳米溶液中加入2 μ L浓度为100 μ M ssDNA室温下 放置一小时，使ssDNA充分保护银纳米；3)含巯基氨基酸的标准溶液的检测将不同浓度的含巯基氨基酸的标准溶液分别加入ssDNA充分保护的银纳米溶液 中，静置一小时，加入IOOmM的NaNO3后，观察或者紫外分光法检测；4)待测样品检测检测样品加入到ssDNA充分保护的银纳米溶液中98 μ L的银纳米溶液中加入 2 μ L浓度为100 μ M ssDNA,室温下放置一小时，然后再加入IOOmM的NaNO3,两分钟后稀释 到500 μ L，观察颜色或者使用紫外吸收光谱仪进行分析。通过该方法实现了对模拟血样牛血清蛋白中同型半胱氨酸的检测。模拟样品中同型半胱氨酸检测流程如图5所示。
模拟样品中各氨基酸检测结果如图6所示。
权利要求
1. 一种特异性含巯基氨基酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)非修饰银纳米的合成6mL浓度为IOmM的NaBH4和200mL浓度为0. 25mM含有0. 25mM柠檬酸钠的AgNO3溶液 混合，充分搅拌30min，产生黄色溶液，静置过夜；2)ssDNA对银纳米的保护将步骤1)得到的98 μ L的银纳米溶液中加入2 μ L浓度为100 μ M ssDNA室温下放置 1小时，使ssDNA充分保护银纳米；3)含巯基氨基酸的标准溶液的检测将不同浓度的含巯基氨基酸的标准溶液分别加入到步骤幻得到的ssDNA充分保护的 银纳米溶液中，静置1小时，加入IOOmM的NaNO3后，观察或者紫外分光法检测；4)待测样品检测待检测样品加入到步骤2)得到的ssDNA充分保护的银纳米溶液中；然后再加入IOOmM 的NaNO3,两分钟后稀释到500 μ L，观察颜色或者使用紫外吸收光谱仪进行分析。
全文摘要
本发明公开了一种特异性含巯基氨基酸的检测方法，包括以下步骤1)非修饰银纳米的合成；2)ssDNA对银纳米的保护；3)含巯基氨基酸的标准溶液的检测；4)待测样品检测。本发明方法实现了对血清样中的含巯基氨基酸特异性、快速检测。该方法与传统方法相比，不仅具有较高灵敏度和特异性；同时，检测时间短、样品处理简单，在不使用任何仪器条件下就可以实现对血样中含巯基氨基酸进行可视化便捷分析。
文档编号G01N21/78GK102087219SQ201010600608
公开日2011年6月8日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者何晔娟, 刘承斌, 席强, 罗胜联, 蔡青云, 陈章 申请人:湖南大学