专利名称：欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接elisa检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域内的动物疾病诊断技术，以PRRSV JXAl株和LV株的相似的抗原表位Maa 58aa缺失的Nsp7基因表达蛋白作为抗原，建立了一种鉴别欧、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法。
背景技术：
按照 2005 年国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)第八次报告，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Procine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)在分类上属动脉炎病毒禾斗(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)。根据各分离株的序列分析及血清学试验结果将PRRSV分为两个型分别为欧洲型(代表毒株为LV)和北美洲型(代表毒株为VR2332)，前者主要流行于欧洲地区，后者主要流行于美洲和亚太地区。1987年该病首次在美国的衣阿华、北卡罗纳等州暴发，并在全美迅速蔓延，随后在短短的几年，迅速遍及全球各养猪业发达的国家和地区。1991年荷兰中央兽医研究所用猪肺泡巨噬细胞首次分离到病原，并命名为Lelystad病毒(PRRSV欧洲型代表株)；1992年美国研究人员用CU621细胞也分离到PRRSV(美洲型代表株VR2332)。1996年，哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似PRRS病例中分离到PRRS病毒，从而证实了本病在我国的存在。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病为主要特征。该病几乎在所有的国家流行，严重影响养猪业的发展。我国在2006年春夏交接之际，南方地区发生了以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病，而后迅速蔓延至周边地区，至2007年已遍及全国绝大部分省份，对我国养猪业造成巨大损失，涉及十几个省的2000000头猪发病，且造成400000头猪死亡。2007年1 月，农业部最终确定“高热病”即“高致病性蓝耳病”。同时，欧洲型PRRSV在我国的发生也已有报道，并从浙江宁波地区和福建地区的临床发病猪场中检测到了欧洲型PRRSV，其部分序列在GenBank中的登录号为EF473138 和EF592535，该序列与疫苗株AMERVAC-PRRS/A3弱毒疫苗株序列的同源性较高。欧洲型 PRRSV弱毒疫苗的使用增加了国内PRRSV流行的复杂性，而且在自然界中还有可能发生病毒重组，我们实验室于2009年分别在内蒙和北京分离到两株欧洲株(登录号⑶047345和 ⑶047344)。两者与LV株的同源性分别为87. 01 %, 91. 48% 目前，对猪蓝耳病的预防和控制是世界各国面临的难题，为了更好的预防和控制本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS的方法。 PRRS感染常用的分型诊断方法包括建立在免疫学基础和基因差异基础上。在免疫学基础上，有文献记载可以利用针对M蛋白的单抗建立的可鉴别NA-PRRSV和EU-PRRSV的间接免疫荧光技术，但无商品化的试剂盒；以分子生物学为基础的诊断主要依据PRRSV的0RF5、0RF6、0RF7和3，NCR等在NA-PRRSV和EU-PRRSV之间同源性较低 差异显著的基因片段建立的基因分型技术，方法包括常规RT-PCR、PCR-RFLP、荧光定量RT-PCR等，如由中国动物疫病预防控制中心研制、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的鉴别NA-PRRSV和 EU-PRRSV的荧光定量RT-PCR试剂盒。但是这些诊断方法在应用中需要特殊的仪器和设备、 耗时长、工作量大，已不能满足当前诊断PRRS感染的需要，特别是不适合大规模的临床样品检测与开展流行病学调查。本研究在Nsp7蛋白的基础上剔除了欧洲型和美洲型PRRSV型间的相似的抗原表位，利用原核表达的融合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRSV抗体的鉴别间接ELISA方法，以期为我国PRRSV型间抗体的鉴别提供一种快捷的技术手段。
发明内容
本发明的目的是研制一种能够区分欧洲型、美洲型的PRRSV抗体检测试剂盒，最终为大规模的临床样品的检测与开展流行病学调查提供ELISA检测方法。本发明专利是通过以下技术方案实现的(1)抗原表位的计算机筛选运用计算机软件(DNAMAN，DNAStar等)对猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp7基因进行同源性分析。抗原表位的筛选主要通过 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)和DNAMAN软件对欧洲型、美洲型PRRSV的非结构蛋白 Nsp7进行分析分别得到10个和12个多肽，经分析发现美洲型PRRSV Nsp7基因的部分抗原表位(JXA1 :38-GQFIEAAYAKALRIELAQLVQVDKV-62,23-DFKCFVSA-30)与欧洲型 PRRSV 的非结构蛋白 Nsp7 的部分抗原表位(LV 38-GQYIEAAYAKALRQELASLVQID-60, 23-NFKCFVSAS-31) 相似。(2)目的基因的扩增及表达载体的构建针对美洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白表位1 23及59 259的氨基酸序列的原核重组表达载体pET-32a-JXAl- Δ Nsp7 ；针对欧洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白表位 1 23及59 269的氨基酸序列的原核重组表达载体pET_32a_LV-Δ Nsp7。(3)目的蛋白的表达及纯化在表达菌E. coli BL2KDE3)中进行诱导表达。通过使用最佳的诱导表达的时间、 诱导的温度和诱导剂的浓度，获得重组融合蛋白JXAl_ANsp7，LV-ANsp7。采用亲和层析的方法对表达的重组融合蛋白进行纯化。(4)重组蛋白的免疫反应活性分析Western-blotting试验分别用欧、美洲型PRRSV的标准阳性血清作为一抗，做免疫印迹分析，经 Western-blotting鉴定重组蛋白的特异性，见图5 8。(5)欧洲型、美洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV Δ Nsp7分别建立间接ELISA方法，确定美洲型ANsp7蛋白抗原包被浓度为0. 5ug/ml，欧洲型ANsp7蛋白抗原包被浓度为0. 5ug/ml ； 抗原包被条件均为37°C包被Ih加4°C过夜；血清的稀释度和反应时间均为1 80，Ih ；使用5%的脱脂奶粉封闭，封闭时间均为lh，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度和反应时间均为 1 35000，Ih ；常温下，底物反应时间为lOmin。针对美洲型PRRSV ANsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0. 35，即当样本OD45tl彡0. 35，判定为阳性；当样本OD45tl < 0. 35，判定为阴性；针对欧洲型PRRSV ANsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为0. 4，即当样本OD45tl ^ 0. 4，判定为阳性；当样本OD450 < 0. 4，判定为阴性；在验证该ELISA方法的特异性发现两者皆不与 CSFV、PRV、JEV、PPV阳性血清发生交叉反应和阻断试验结果显示随血清稀释倍数的增加，经阻断的阳性血清与阴性血清OD45tl值逐渐接近，当血清稀释到640 1280倍时，达到完全阻断，表明建立的间接ELISA方法是特异的，且重复性很好；美洲株血清样品检测时，与法国 LSI试剂盒进行比较，其敏感性和特异性分别是90%和94. 2 %，说明两种检测方法无显著性差异。
图 IPRRSV-JXA1-Nsp7 和 PRRSV_LV_Nsp7 上、下游基因片段的扩增1 4 分另Ij 为 JXA1-PRRSV-Nsp7 上游(103bp) ；LV_PRRSV_Nsp7 上游(103bp)； JXA1-PRRSV-Nsp7 上游(636bp) ；LV_PRRSV_Nsp7 上游(668bp)。图 2PRRSV-JXAl_ANsp7 禾口 PRRSV-LV_ANsp7 基因片段构建1: JXAI-PRRSV- ΔNsp7(672bp) ；2 =LV-PRRSV- ΔNsp7(702bp)。图 3 表达载体 pET-3h-JXAl_ANsp7 和 pET_32a_LV-Δ Nsp7 的鉴定1 4 : PCR 扩增 JXAl-PRRSV-ANsp7 ；表达载体 pET_3h_JXAl-Δ Nsp7 的双酶切；PCR 扩增 LV-PRRSV- Δ Nsp7 ；表达载体 pET_3h_LV- Δ Nsp7 的双酶切。图4重组融合蛋白JXAl- Δ Nsp7和LV- Δ Nsp7的诱导表达SDS_PAGE鉴定1 2 重组融合蛋白LV_ANsp7 ；重组融合蛋白JXAl_ANsp7。图5 重组融合蛋白JXAl-Δ Nsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定 (一抗为美洲株标准血清)1 4:融合蛋白JXAl-ANsp7上样量分别为20ul、15ul、10ul、 5ul ο图6 :重组融合蛋白LV_ANsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为美洲株标准血清)1 4 融合蛋白LV-ANsp7上样量分别为20ul、15ul、10ul、5ul。图7 重组融合蛋白LV_ANsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定(一抗为欧洲株标准血清)1 4 融合蛋白LV-ANsp7上样量分别为:20ul、15ul、10ul、5ul。图8 重组融合蛋白JXAl-Δ Nsp7的免疫反应活性分析-Western-blotting鉴定 (一抗为欧洲株标准血清)1 4 融合蛋白JXAl-ΔNsp7上样量分别为:20ul、15ul、10ul、 5ul ο
具体实施例方式下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。本发明首先参考已发表的关于PRRSV非结构蛋白Nsp7免疫反应的相关研究报道， 利用计算机软件对欧洲型与美洲型PRRSV的抗原表位进行分析，分别设计两对引物，利用 PCR方法克隆了 PRRSV JXAl株(EF112445)和LV株(AY588319)的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位Maa 58aa缺失的部分，利用限制性内切酶将目的片段和原核表达载体pET-3h进行酶切，T4连接酶连接，获得构建原核表达载体，分别命名为pET-32a-JXAl-ANsp7，pET_32a_LV-Δ Nsp7。
用pET-32a_JXAl- Δ Nsp7, pET_32a_LV- Δ Nsp7 分别转化受体菌 BL21 (DE3)，获得单个菌落，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实ANsp7基因的表达，并确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间分别为ImM和3. 5小时。将SDS-PAGE后的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行Western-blotting试验，证实了所表达的重组蛋白大小相符具有免疫反应活性，且无交叉反应。通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验，建立了鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA 检测方法。 实施例1抗原表位的计算机筛选利用计算机软件(DNAMAN，DNAStar等)对猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp7基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析。美洲株JXAl (EFl 12445)和 VR2332(AY150564)在氨基酸和核苷酸方面的同源性分别为89. 8%,90. 0%;欧洲株之间在氨基酸和核苷酸方面的同源性均在90%以上；美洲株和欧洲株在氨基酸和核苷酸方面的同源性分别为50. 3%，47%。表1猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因在核苷酸水平的同源性比较
权利要求
1.一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于步骤如下1)目的蛋白的表达及纯化针对Genbank登录号为EF11M45的美洲型PRRSV JXAl株的非结构蛋白Nsp7基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的Maa 58aa缺失的原核表达载体 pET-32a-JXAl-ANsp7 ；针对Genbank登录号为AY588319的欧洲型LV株的非结构蛋白Nsp7 基因中欧洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，构建Nsp7的Maa 58aa缺失的原核表达载体pET-32a-LV- Δ Nsp7，表达纯化蛋白制备美洲型Δ Nsp7蛋白抗原和欧洲型Δ Nsp7蛋白抗原。2)间接ELISA检测利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV Δ Nsp7分别建立间接ELISA方法，确定美洲型 ANsp7蛋白抗原包被浓度为0. 5ug/ml，欧洲型ANsp7蛋白抗原包被浓度为0. 5ug/ml ；抗原包被条件均为37°C包被Ih加4°C过夜；血清的稀释度和反应时间均为1 80，Ih ；使用5%的脱脂奶粉封闭，封闭时间均为lh，HRP-兔抗猪IgG的使用浓度和反应时间均为 1 35000，Ih ；常温下，底物反应时间为lOmin。
2.根据权利要求1所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接 ELISA检测方法，其特征在于，针对美洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为 0. 35，即当样本0D450彡0. 35，判定为阳性；当样本0D450 < 0. 35，判定为阴性。
3.根据权利要求1-2所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，针对欧洲型PRRSV ANsp7蛋白的样本的阴阳性临界值为 0.4，即当样本0D450彡0.4，判定为阳性；当样本0D450 < 0.4，判定为阴性。
4.根据权利要求1-3所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接 ELISA检测方法，其特征在于，美洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白和欧洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白皆不与CSFV、PRV、JEV、PPV阳性血清发生交叉反应。
5.根据权利要求1-4所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接 ELISA检测方法，其特征在于，阻断试验结果显示随血清稀释倍数的增加，经阻断的阳性血清与阴性血清0D450值逐渐接近，当血清稀释到640 1280倍时，达到完全阻断。
6.根据权利要求1-5所述的鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的间接 ELISA检测方法，其特征在于，美洲株血清样品检测时，与法国LSI试剂盒进行比较，其敏感性和特异性分别是90%和94. 2%，符合率为92. 2%。
7.如权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，制备pET-32a-JXAl-Δ Nsp7 所用的引物对为JXA1-Nsp 7-F1-GCGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTCJXA1-Nsp7-Rl-CCATGGTGCCTCGGACCTTATCAACATCAGTCCATTTCGTAAGGAAATCJXA1-Nsp7-F2-GATTTCCTTACGAAATGGACTGATGTTGATAAGGTCCGAGGCACCATGGJXA1-Nsp7-R2-CCCAAGCTT TTCCCACTGAGCTCTTCTATTC
8.如权利要求1所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，制备pET-32a-LV-Δ Nsp7所用的引物对为LV-Nsp7-F3-CGGAATTCTCCCTAACGGCTGCTTTAGCTTGLV-Nsp7-R3-GACAAAA CTCCTTTCATTTTGTCAATGTTCGTTAAGCTGGACAAAAAATCA LV-Nsp7-F4-TGATTTTTTGTCCAGCTTAACGAACATTGACAAAATGAAAGGAGTTTTGTC LV-Nsp7-R4-CCCAAGCTTTTTCAAGGCAGTTGTCAGGC
全文摘要
本发明提供一种鉴别欧洲型、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的血清学方法，该方法是针对美洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7蛋白的1～23和59～259氨基酸序列，建立美洲型PRRSV Nsp7蛋白的原核重组表达载体pET-32a-JXA1-ΔNsp7；针对欧洲型PRRSV Nsp7蛋白表位1～23和59～269氨基酸序列，建立欧洲型PRRSV非结构蛋白Nsp7的原核重组表达载体pET-32a-LV-ΔNsp7。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。利用经镍柱亲和纯化的美洲型Nsp7蛋白作为包被抗原制备用于美洲型PRRSV抗体检测的间接ELISA诊断试剂盒；以纯化的欧洲型Nsp7蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型PRRSV抗体检测间接ELISA方法；两种试剂盒的发明可用于PRRSV抗体的分型检测。
文档编号G01N33/569GK102175861SQ201010602100
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者倪建强, 曲萍, 田克恭, 翟新验, 邱鹏, 陈西钊, 顾小雪 申请人:中国动物疫病预防控制中心