专利名称：一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法
技术领域：
一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
烷基酚类化合物(Alkyl Phenol，APs)，属于内分泌干扰物质中重要的一种，具有 明显的环境雌激素效应。该类化合物多为脂溶性有机化合物，化学稳定性较强，一旦摄入就 不易降解排出，有生物累积性，危害性较大，即使微量也可对生物产生影响。同时其在环境 中分布也十分广泛，并且含量较低。烷基酚类化合物Ah是重要的精细化工原料，在表面活 性剂、润滑油添加剂、油溶性酚醛树脂及绝缘材料、纺织印染、造纸助剂、农药乳化剂、工业 用洗涤剂、橡胶塑料的防老抗氧剂、油田及炼油厂化学品等领域具有广泛用途。APs中最重 要的是壬基酚(Nonyl Phenol, NP)和辛基酚(Octyphenol，OP)，二者只在长碳链相差一个 甲基，它们同属于联合国UNEP制订的持久性有毒化学污染物。NP和OP等APs内分泌干扰 物主要为烷基酚聚环氧乙烷醚(Alkylphenolethoxylater，ΑΡΕ0)在环境降解过程中的中 间产物。一般随着APEO的排放进入环境，并且在环境中分布比较广泛。Ah类化合物可以 对生物体形成外因性雌性激素作用，其中又以OP为最强，NP次之，而其它APs类化合物则 依照亲水端链从短到长，作用程度依次削减。Ah类化合物是促乳房癌细胞活性化与增殖现 象的环境内分泌干扰物。同时烷基酚类化合物对细胞的DNA有明显的损伤作用，并且DNA 的损伤程度与化学结构有一定的关系，苯酚环中增加其他基团，可使致突变活性增强，并且 随着苯酚环中氯原子数的增加，致突变活性也增强；随着苯酚对位碳原子数增多，其致突变 活性也增高等。因此，APs类物质也逐步被列入强制性禁用范围，一些国家纷纷制定法规限 制APs的生产和使用。欧盟第2003 / 53 / EC号指令规定纺织品中NP和NPEO含量均不 能高于0. 1%。这些措施成为我国纺织品出口欧盟面临的又一大技术贸易壁垒，因此对APs 检测方法的研究提上日程。现今烷基酚主要的分析方法有高效液相色谱法、气相色谱法、 LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是 样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度 高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫 原。目前为止，国内外尚没有针对烷基酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成 了以烷基酚的降解产物壬基酚NP为半抗原的用于烷基酚类结构检测的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品 用于烷基酚类结构的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了更好的必需的人工抗原。本发明的技术方案一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法，以壬基酚为半 抗原，用活性酯法将其与载体蛋白BSA偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比。 步骤为(1)人工抗原的合成壬基酚、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺、牛血清白蛋白控制 摩尔比为80 120 136 1的比例反应，壬基酚溶液溶于含二甲基吡啶的戊二酸酐的无 水乙醇和吡啶混合溶液中，65°C搅拌反应24h后用真空旋转蒸发提纯，再加N，N- 二甲基甲 酰胺DMF溶剂溶解后，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和碳二亚胺搅拌反应6h，为A液；牛血 清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，为B液；将A液逐滴加入B液中，室温下搅拌反应3h，离心 取上清液得壬基酚-BSA混合液，即为烷基酚类药物通用人工抗原混合液；
透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS溶液透析2次，再用每次 2L的去离子水透析2次，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得壬基 酚-BSA偶联物，即是烷基酚类药物通用人工抗原；
(2)人工抗原的鉴定壬基酚-BSA偶联物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽 然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的 原理建立起来的。凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量来鉴定合成的人工抗原。 SDS-聚丙烯酰胺电泳利用迁移率只与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用 SDS-聚丙烯酰胺电泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。本发明采用10%的分离 胶，5%的压缩胶，对牛血清白蛋白BSA、偶联物NP-BSA进行电泳鉴定。利用FR980生物电泳 凝胶成像系统软件得出偶联比r ^ 23。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5min，每个浓 度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原 溶液按一定比例稀释，在595nm处测定壬基酚-牛血清白蛋白抗原溶液的吸光值，从曲线上 得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白浓度为10. 96mg · mL—1。本发明的有益效果本发明成功合成了烷基酚类药物通用人工抗原壬基酚-BSA 偶联物，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的 途径，可以满足国内对其研究的需要。
图1 壬基酚NP-BSA等的电泳图。图2利用间接ELISA方法测得的壬基酚-BSA偶联物的抑制曲线。
具体实施例方式实施例1
(1)人工抗原的制备
取 220.;35mg (Immol )壬基酚 NP 和 1. 140g (IOmmol )戊二酸酐，以及 22. 4mg (0.2 mmol ) 二甲基吡啶DMAP到圆底烧瓶里，然后再加入9mL无水乙醇和ImL无水吡啶，最后放 入65°C水浴反应Mh。产物溶液用真空旋转蒸发提纯，再加入DMF溶液溶解以备下一步反 应。取0. 5mL含有IOmg (0. 04538 mmol )壬基酚NP衍生物的N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液到棕色小瓶中，再加入14. 77mg (0. 06807 mmol )N_羟基硫代琥珀酰亚胺Sulf-NHS和 14. 78mg (0.07715 mmol )碳化二亚胺 EDC，室温反应 6h，为 A 液。将 37. 55mg (0. 56725 umol )牛血清白蛋白BSA溶解到0.01M、pH7. 4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液。然后将 A液缓慢滴加到B液中，室温反应3h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min,保存在4°C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0. OlM的磷酸盐PBS溶液和2X2L 的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原壬基 酚NP-牛血清蛋白。(2)壬基酚人工抗原的鉴定
偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定 方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立 起来的.凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量来鉴定合成的人工抗原。SDS-聚丙烯 酰胺电泳利用迁移率只与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用SDS-聚丙 烯酰胺电泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。本实验采用10%的分离胶，5%的压 缩胶，对牛血清白蛋白BSA、偶联物NP-BSA进行电泳鉴定。利用FR980生物电泳凝胶成像系 统软件得出偶联比r ^ 23。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5min，每个浓 度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶 液按一定比例稀释，在595nm处测定壬基酚-牛血清蛋白抗原溶液的吸光值，从曲线上得到 抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为10. 96mg · mL—1。试验结果表明我们制得的壬基酚-牛血清白蛋白偶联物产生了针对烷基酚类药 物是非常好的抗体，相关实验结果数据见表1和图2。表1不同兔子血清的抗体效价
免疫原血清编码效价工作浓度包被原浓度抗血清稀释浓度1号1号兔子抗血清180001:3000 1:80001号2号兔子抗血清220001:4000 1:8000
权利要求
1. 一种烷基酚类药物通用人工抗原的合成方法，其特征在于以壬基酚为半抗原，用活 性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联 比；步骤为(1)人工抗原的合成壬基酚、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺、牛血清白蛋白控制 摩尔比为80 120 136 1的比例反应，壬基酚溶液溶于含二甲基吡啶的戊二酸酐的无 水乙醇和吡啶混合溶液中，65°C搅拌反应24h后用真空旋转蒸发提纯，再加N，N- 二甲基甲 酰胺DMF溶剂溶解后，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和碳二亚胺搅拌反应6h，为A液；牛血 清白蛋白溶于磷酸盐缓冲液中，为B液；将A液逐滴加入B液中，室温下搅拌反应池，离心 取上清液得壬基酚-BSA混合液，即为烷基酚类药物通用人工抗原混合液；透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的PBS溶液透析2次，再用每次 2L的去离子水透析2次，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得壬基 酚-BSA偶联物，即是烷基酚类药物通用人工抗原；(2)人工抗原的鉴定壬基酚-BSA偶联物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其偶联比。
全文摘要
一种烷基酚类药物的通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以壬基酚NP为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，制得壬基酚-牛血清白蛋白偶联物，即为烷基酚类药物通用人工抗原；用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了烷基酚类药物的通用人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
文档编号G01N33/53GK102120767SQ201010604420
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者刘丽强, 宋珊珊, 李灼坤, 王利兵, 胥传来, 邢常瑞 申请人:江南大学