专利名称：一种虫草菌丝体中粗多糖含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种粗多糖的测定方法，特别是涉及一种虫草菌丝中粗多糖含量的测定方法。
背景技术：
虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，虫草多糖是由甘露糖、虫草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、岩藻糖组成的多聚糖。大量医学实验证实，虫草多糖可活化巨噬细胞，刺激抗体产生，提高人体免疫能力，升高白细胞抑制肿瘤生长，并具有抗肿瘤、抗辐射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用， 此外，虫草多糖还能抗心律失常，抗心肌缺血，扩张外周血管，降压，降血脂，抑制血小板聚集。目前，虫草菌丝体中的粗多糖含量的测定方法通常采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法，均是以葡萄糖或葡聚糖为标准品，通过绘制标准曲线，进而对虫草菌丝体样品中的粗多糖含量进行定量。其步骤主要包括1、对样品进行预处理；2、绘制葡萄糖或葡聚糖标准曲线；3、通过标准曲线测定样品的含量；为了使得测定的结果能够反应虫草菌丝体中粗多糖的真实含量，对不同批次样品进行含量测定时，均需绘制标准曲线。这种方法即耗时又消耗实验试剂；另外在配制标准溶液和绘制标准曲线时还会因称量、定容、稀释等操作步骤产生人为误差，影响结果的准确性。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能够快速、准确地测定虫草菌丝体中粗多糖的含量，操作方法简便、人为误差少的虫草菌丝中粗多糖含量的测定方法。本发明的技术方案概述如下一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备a、称取m克的虫草菌丝体供试品，置于体积为V1HiL的容量瓶中，加入所述V1HiL容量瓶体积的2/3的蒸馏水，在100°C恒温水浴中浸提3-8小时，定容至V1HiL,过滤，除去不溶杂质，收集滤液；b、吸取滤液V2mL，加入4倍于V2ml的无水乙醇，用于沉淀滤液中的多糖，醇沉6_8 小时，离心，收集多糖沉淀；C、将所述多糖沉淀溶于V3HiL蒸馏水中，使沉淀溶解，即得到供试品溶液；(2)标准曲线的制备a、将纯度大于99. 0%的葡萄糖标准品于80°C干燥至恒重，精确称取0. Olg，置于 IOOml容量瓶中，加入80ml蒸馏水，超声15分钟，使葡萄糖充分溶解，放冷至室温，定容摇勻，即得0. 10mg/mL葡萄糖标准溶液；b、精密吸取所述葡萄糖标准溶液 OmUO. 20ml,0. 40ml,0. 60ml、0. 80ml、1. 0ml，分别置于6个IOml具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为1. 0ml，再加质量浓度为5%的苯酚水溶液1. 0ml，摇勻，滴加浓硫酸5. 0ml，振荡摇勻后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到标准待测液；用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定各个标准待测液的吸光度，以标准待测液中葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线；(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定a、供试品待测液的制备取步骤(1)获得的供试品溶液V4mL，加蒸馏水使体积为 1. 0ml，加质量浓度为5%的苯酚水溶液1. 0ml，摇勻，滴加浓硫酸5. 0ml，振荡摇勻后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到供试品待测液，体积记为V5 ；b、吸收系数的确定用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定所述供试品待测液的吸光度；由步骤(2)所得标准曲线中吸光度A与浓度C的对应关系，得到供试品待测液中粗多糖的浓度C，根据朗伯-比尔定律A = ECL，计算出供试品待测液中粗多糖的吸收系数E1;(4)按步骤(1)-(3)重复η次，获得多个供试品待测液的吸收系数&、E3, E4…… En,计算Ep E2、E3、E4……En的平均值Ε，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；(5)利用确定的吸收系数E根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量a、按照步骤(1)所述的方法另取M克虫草菌丝体，制备虫草菌丝体溶液，获得该溶液的Vp v2、v3值;b、按照步骤(3)中a所述的方法制备体积为V5的虫草菌丝体溶液，获得该溶液的 V4和V5值；C、用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定步骤b所得虫草菌丝体溶液的吸光度A;d、根据步骤(4)得到的吸收系数E，按下式计算虫草菌丝体中粗多糖含量，
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EXIOOxF4 XF2 xM式中X——虫草菌丝体中粗多糖含量，以葡萄计；A——供试品待测液的吸光度；E——吸收系数M——虫草菌丝体质量，单位为g。本发明的方法只需对样品进行预处理，无需进行标准曲线的绘制，根据公式即可获得虫草菌丝体中的粗多糖含量。省去了标准曲线法中，配置标准溶液和绘制标准曲线法的步骤，减少了实验步骤，从而减少实验过程中的人为误差。同时，由于实验步骤的减少，还缩短了实验时间，节约了实验试剂，既提高了工作效率又节约了成本。
图1是虫草菌丝体粗多糖含量测定标准曲线的制备。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1
一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备a、称取1. Og的虫草菌丝体供试品，置于体积为IOOmL(VllIiL)的容量瓶中，加入所述IOOmL容量瓶体积的2/3的蒸馏水，在100°C恒温水浴中浸提5小时，定容至IOOmL,过滤， 除去不溶杂质，收集滤液；b、吸取滤液5mL(V2mL)，加入20mU4倍于V2ml)的无水乙醇，用于沉淀滤液中的多糖，4°C静置醇沉6小时，3000rpm离心，收集多糖沉淀；C、将所述多糖沉淀溶于25mL (V3HiL)蒸馏水中，使沉淀溶解，即得到供试品溶液；(2)标准曲线的制备a、将纯度大于99. 0%的葡萄糖标准品于80°C干燥至恒重，精确称取0. 010g，置于 IOOml容量瓶中，加入80ml蒸馏水，超声15分钟，使葡萄糖充分溶解，放冷至室温，定容摇勻，即得0. 10mg/mL葡萄糖标准溶液；b、精密吸取所述葡萄糖标准溶液 0ml、0. 20ml,0. 40ml,0. 60ml,0. 80mlU. 0ml，分别置于6个10ml具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为1. 0ml，再加质量浓度为5%的苯酚水溶液1. 0ml，摇勻，滴加浓硫酸5. 0ml，振荡摇勻后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到标准待测液；用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定各个标准待测液的吸光度，以标准待测液中葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线，结果见表1和图 1 ；表1虫草菌丝体粗多糖含量测定标准曲线的制备
权利要求
1. 一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，其特征包括如下步骤(1)供试品溶液的制备a、称取m克的虫草菌丝体供试品，置于体积为V1HiL的容量瓶中，加入所述V1HiL容量瓶体积的2/3的蒸馏水，在100°C恒温水浴中浸提3-8小时，定容至V1HiL,过滤，除去不溶杂质， 收集滤液；b、吸取滤液V2mL，加入4倍于V2ml的无水乙醇，用于沉淀滤液中的多糖，醇沉6_8小时， 离心，收集多糖沉淀；c、将所述多糖沉淀溶于V3HiL蒸馏水中，使沉淀溶解，即得到供试品溶液；(2)标准曲线的制备a、将纯度大于99.0%的葡萄糖标准品于80°C干燥至恒重，精确称取0. Olg，置于IOOml 容量瓶中，加入80ml蒸馏水，超声15分钟，使葡萄糖充分溶解，放冷至室温，定容摇勻，即得0.10mg/mL葡萄糖标准溶液；b、精密吸取所述葡萄糖标准溶液OmUO.20ml,0. 40ml,0. 60ml,0. 80ml、1. 0ml，分别置于6个IOml具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为1. 0ml，再加质量浓度为5%的苯酚水溶液1.0ml，摇勻，滴加浓硫酸5. 0ml，振荡摇勻后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到标准待测液；用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定各个标准待测液的吸光度，以标准待测液中葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线；(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定a、供试品待测液的制备取步骤(1)获得的供试品溶液V4mL，加蒸馏水使体积为 1. 0ml，加质量浓度为5%的苯酚水溶液1. 0ml，摇勻，滴加浓硫酸5. 0ml，振荡摇勻后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到供试品待测液，体积记为V5 ；b、吸收系数的确定用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定所述供试品待测液的吸光度；由步骤(2)所得标准曲线中吸光度A与浓度C的对应关系，得到供试品待测液中粗多糖的浓度C，根据朗伯-比尔定律A = ECL，计算出供试品待测液中粗多糖的吸收系数E1 ；(4)按步骤(1)-(3)重复η次，获得多个供试品待测液的吸收系数E2、&、E4……En,if 算Ep E2、E3、E4……En的平均值E，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；(5)利用确定的吸收系数E根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量a、按照步骤(1)所述的方法另取M克虫草菌丝体，制备虫草菌丝体溶液，获得该溶液的 V V2J3 值；b、按照步骤C3)中a所述的方法制备体积为V5的虫草菌丝体溶液，获得该溶液的V4和 V5值；c、用光程为Icm的比色皿，在490nm波长处测定步骤b所得虫草菌丝体溶液的吸光度A；d、根据步骤(4)得到的吸收系数E，按下式计算虫草菌丝体中粗多糖含量，、， AxK xK xV, …，X =-^~1~！~ χ 100%ExIOOxF4 XF2 χ M式中X——虫草菌丝体中粗多糖含量，以葡萄计； A——供试品待测液的吸光度； E——吸收系数M——虫草菌丝体质量，单位为g。
全文摘要
本发明公开了一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤(1)供试品溶液的制备；(2)标准曲线的制备；(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定；(4)按步骤(1)-(3)重复n次，获得多个供试品待测液的吸收系数E2、E3、E4……En，计算E1、E2、E3、E4……En的平均值E，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；(5)利用确定的吸收系数E根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量，本发明的方法只需对样品进行预处理，无需进行标准曲线的绘制，根据公式即可获得虫草菌丝体中的粗多糖含量。节省了步骤，从而减少检测过程中的人为误差。同时缩短了检测时间，节约了实验试剂，既提高了工作效率又节约了成本。
文档编号G01N21/31GK102252978SQ20101060494
公开日2011年11月23日 申请日期2010年12月24日 优先权日2010年12月24日
发明者李星芝, 童艳, 赵晓娟 申请人:天津天狮生命源有限公司, 天津天狮生物发展有限公司, 天狮集团有限公司