专利名称：一种检测原花青素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于天然物质、药品、保健食品、饮料和化妆品中原花青素含量的 检测方法。
背景技术：
原花青素(Proanthocyanidins)，也口 L]做缩合鞋质(condensed tannins),是一种 由若干个儿茶素类化合物聚合而成，具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物，存在于自 然界多种植物中，银杏叶、葡萄籽、越橘、松树皮、莲房、玫瑰花等植物中均含有原花青素。经 研究证实，原花青素具有很强的抗氧化和自由基清除能力，对心脑血管有较好的保护作用。由于原花青素是一类成分及其复杂的化合物，同时又缺少商业可用的对照，因此， 目前原花青素的含量测定方法多为比色法，包括酸性丁醇法、香草醛法、4-二甲基氨基肉桂 醛法、钼酸铵法、硫酸高铈铵、高铁盐-铁氰化钾等。酸性丁醇法的原理是将原花青素在酸 性条件下转化成为具有颜色的花青素，从而通过测定吸光度来计算原花青素的含量；香草 醛法的原理是在酸性条件下，香草醛转变成阳离子分子，与黄烷-3-醇结构中A环的间苯三 酚或间苯二酚亲核位点结合形成有颜色的物质，利用吸光度来计算原花青素的含量；4- 二 甲基氨基肉桂醛法的原理与香草醛法相似，4-二甲基氨基肉桂醛在酸性条件下转变成阳 离子分子，与黄烷-3-醇结构中A环的间苯三酚或间苯二酚亲核位点结合形成有颜色的物 质，利用吸光度来计算原花青素的含量。而其他方法多是检测多酚的方法，对于那些含黄酮 类成分较高的产品来说，这些方法的测定值会显著偏高。但是特异性相对较高的酸性丁醇 法和香草醛法在测定银杏原花青素时，也存在着明显的不足酸性丁醇法易受到花青素及 副产物的影响，结果重复性和可靠性较差；4-二甲基氨基肉桂醛法虽然灵敏度高于香草醛 法，但是由于单体的吸收系数明显高于聚合体的吸收系数，因此其测定结果容易受到单体 的影响而明显偏高。目前最常用的测定方法是香草醛法，但是文献报道的方法同样存在着明显的不 足，且方法多样，至今还未统一。香草醛-硫酸法鲍俊竹，陈月坤，徐桂花.测定葡萄籽提 取物中原花青素含量的方法.农业科学研究，2005，沈(1) :43-45.在检测过程中，加入硫 酸时会产生很大的热量，因此其测定结果受到原花青素的氧化降解而明显偏低；最初的香 草醛-盐酸法赵益，黄宇玫，杨彦平.葡萄原花青素含量测定方法的研究进展.甘肃中医 学院学报，2006，23 (6) :43-46.，显色剂为6mL 4%的香草醛甲醇溶液和3mL的浓盐酸混合 溶液，避光反应15小时；后经改良李春阳，许时婴，王璋.低浓度香草醛-盐酸法测定葡 萄籽、梗中原花青素含量的研究.食品工业科技，2004，25 (6) :128-130.，采用4%的盐酸 和0. 5%的香草醛甲醇液进行显色，控制反应温度30°C，反应时间30分钟。但是上述的香 草醛法的反应溶剂均为甲醇，毒性大，用于产品在线生产检测极为不便，需在专门的实验室 环境下进行；而且这几种方法检测时间都很长，反应时间均在半小时以上，不能做到快速检 测，由于在线检测讲究速度与准确度，目前这几种方法都不能满足在线检测的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测原花青素含量的方法，其能对含原花 青素的样品在常温常压下进行，所需时间短且无毒，检测结果准确。为此，本发明采用以下技术方案1.样品处理将含原花青素的样品预处理后溶于质量百分比为60-95%的乙醇溶液。2.显色剂配制将盐酸和香草醛分别用无水乙醇溶液定容然后混合组成显色反应液，盐酸在显色 反应液中的体积占比为6-15%，香草醛在显色反应液中的质量占比为0. 5-2% ；3.样品检测将配置好的原花青素乙醇溶液与显色反应液常温下反应5-12分钟，然后用分光 光度计测定反应液在496nm处的吸光度值，标准曲线法计算原花青素含量。根据含原花青素的不同样品来源，样品预处理有不同的方法1.在线生产成品或干粉样品用质量百分比为60-95%的乙醇替代传统香草 醛-盐酸法中的甲醇作为溶解样品的溶剂，样品在温度40-50。V，用超声辅佐溶解，结果解 决了检测样品不能完全溶解于高浓度乙醇的问题；并用无水乙醇替代传统香草醛-盐酸法 中的甲醇作为显色剂配置的溶液，解决了用甲醇检测毒性问题。2.在线生产时的半成品溶液通过调整半成品溶液的乙醇浓度至60-95%，解决 了传统香草醛-盐酸法需要先对半成品溶液蒸干并再用甲醇溶解样品的繁琐步骤，大大缩 短了操作时间，减少了原花青素使用原检测方法时蒸干过程中的降解，加快了反应速度，提 高了检测的准确性，解决了甲醇在线检测的难题。在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案所述含原花青素样品溶于质量百分比为80%的乙醇溶液，或将在线生产时的半成 品溶液调整乙醇浓度至80%。盐酸在显色反应液中的体积比为10 %，所述香草醛在显色反应液中的质量占比为1%。反应时间为8分钟，反应温度为常温。所述待测的含原花青素的样品为银杏叶提取物、葡萄籽提取物、松树皮提取物、越 橘提取物、莲房提取物、玫瑰花提取物等。由于采用本发明的上述技术方案，本发明通过对香草醛法的改进，用乙醇代替甲 醇做为溶剂，在较高温度及超声下溶解干粉样品，使之完全溶解，解决了样品在高浓度乙醇 中难以完全溶解的缺点；同时通过调整半成品溶液的乙醇浓度，解决了传统香草醛-盐酸 法需要对半成品溶液先蒸干再用甲醇溶解样品的繁琐步骤，减少了原花青素在蒸干过程中 的降解等问题。能对含原花青素的成品、半成品或原料在常温常压下进行，所需时间短且无 毒而适于在生产现场实时进行检测，检测结果准确，真正做到准确快速简便，提高产品的生 产效率。本发明相对于之前的测定原花青素的方法更加便捷、操作更加简单、结果的重复性 好、准确性高，特别适用于产品生产过程中原花青素含量的实时监测。
图1为乙醇浓度对吸光度的影响图。图2为盐酸浓度对吸光度的影响图。图3为香草醛浓度对吸光度的影响图。图4为反应时间对吸光度的影响图。
具体实施例方式实施例1，最佳反应体系的建立(1)、以乙醇代替甲醇作为反应体系的溶剂，来配制显色剂10ml盐酸入50ml容量 瓶，用无水乙醇定容，制得显色剂A ； Ig香草醛入50ml容量瓶，用无水乙醇溶解定容，制得显 色剂B;临用时，将显色剂A和B按体积比1 1混合而成。(2)样本制备时，最佳乙醇浓度的确定称取原花青素对照，先用无水乙醇溶解， 再将原花青素对照样本用水稀释到同一浓度，设置不同乙醇浓度梯度50^^60%,70%、 80%、90(%、95(%，用步骤1的显色剂测定各样本吸光度(见图1)，确定质量百分比为 60-95%时为生产过程中测定原花青素含量的乙醇浓度，其中80%为生产过程中测定原花 青素含量的最佳；60-95%为乙醇浓度检测成品中原花青素含量的乙醇浓度，其中95%为 乙醇浓度检测成品中原花青素含量的乙醇浓度。以上百分比为质量百分比。(3)反应体系最大吸收波长的确定对80%乙醇浓度和95%乙醇浓度的样本显色 反应后，进行全波长扫描，确定496nm为最大吸收波长。(4)反应体系最佳盐酸浓度的确定香草醛反应终浓度为1%，改变反应体系盐酸 的终浓度1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%，用步骤1的显色剂测定各样本吸光度 (见图2)，确定体积比6-15%为反应盐酸浓度，其中10%为反应最佳盐酸浓度。(5)反应体系最佳香草醛浓度的确定盐酸反应终浓度为10%，改变反应体系香 草醛的终浓度0. 25%,0. 5%U%>1. 5%、2%，用步骤1的显色剂测定各样本吸光度(见图 3)，确定0.5-2%为反应香草醛浓度，其中为反应最佳香草醛浓度。以上百分比为质量 百分比。(6)反应体系最佳反应时间的确定(见图4)盐酸反应终浓度为10%，香草醛反 应终浓度为1%，确定5 12分钟为反应时间，其中8分钟为最佳反应时间。实施例2几种常用的方法在测定银杏叶提取物中原花青素含量的比较(1)本发明建立的方法分别称取35. 9,34. 0,37. 7,33. 9,47. 5,38. 6mg银杏叶提 取物入IOml容量瓶，用80%的乙醇溶解在46°C下用超声溶解后定容。用含体积百分比10% 盐酸和质量百分比香草醛的无水乙醇显色液常温下反应8分钟，496nm处检测吸光度 值，用标准曲线法检测，得平均原花青素含量为8. 34%, RSD = 1. 09%。(2)文献中的盐酸-香草醛法分别称取27.9、40.0、36.9、34.0、30.8mg银杏叶提 取物入IOml容量瓶，用甲醇溶解定容。用含体积百分比4%盐酸和质量百分比香草醛 的甲醇显色液30度反应30分钟，500nm处检测吸光度值，得平均原花青素含量为8. 38%， RSD = 1. 79%。(3)盐酸正丁醇法精确称取IOmg样品，以甲醇溶解并定容至100ml。反应时，取 Iml样本溶液，6ml 5%的HCL/n-BuOH溶液，0. 2ml 2%硫酸铁铵溶液，沸水浴40分钟后，用冷水迅速冷却，546nm处测定吸光度。该法测定原理是将原花青素水解为花青素，但该反应会生成无色的副产物，因此 测定结果会偏低。由该法测定得到银杏叶提取物中原花青素含量为7. 43%,RSD = 5. 88%。(4)硫酸-香草醛法精确称取IOmg样品，以甲醇溶解并定容至10ml。反应时，取 0. 5ml样品溶液，2. 5ml质量百分比3%香草醛甲醇溶液，2. 5ml体积百分比30%硫酸，30°C 避光反应20min，500nm处测定吸光度。由该法测定得到银杏叶提取物中原花青素含量为8. 29%, RSD = 3. 16%。(5)4- 二甲基氨基肉桂醛法精确称取25mg样本，以70乙醇溶解并定容至50ml。 反应时，取Iml样本溶液，3ml 4-二甲基氨基肉桂醛溶液，常温下反应25分钟，640nm处测 定吸光度。由该法测定得到银杏叶提取物中原花青素含量为8. 47%，RSD = 2. 11%。通过与别的方法比较，本发明所使用方法所需时间最短，结果相对标准偏差小，测 量结果与其它方法基本一致。而且本发明所采用试剂均为无毒试剂，可用于产品生产的在 线检测。实施例3银杏叶中原花青素含量的检测(1)称取20g银杏叶，粉碎，入250ml圆底烧瓶，加入150ml 80乙醇，90度回流提 取1小时，过滤，再重复提取2次，合并滤液，得滤液Sl约430ml。取Iml滤液，用本发明提 供的所述检测方法测得原花青素含量为0. 148mg/ml，测定时间为10分钟(测定时间从取 样到结果计算的总时间)。另称取20g银杏叶，粉碎，入250ml圆底烧瓶，加入150ml 80乙醇，90度回流提取 1小时，过滤，再重复提取2次，合并滤液，得滤液S2约430ml。取IOml滤液，减压干燥，加 入IOml甲醇溶解，用文献报道的香草醛法测得原花青素含量为0. 146mg/ml，测定时间为56 分钟。实施例4银杏叶提取物生产过程中原花青素含量的检测(1)取银杏叶提取过程中的在线前期半成品乙醇溶液200ml，将溶液减压浓缩至 无醇味，上样于处理好的大孔树脂，水洗后，用质量百分比70 %乙醇洗脱，得70 %乙醇洗脱 部位S3约150ml。取Iml样本，用无水乙醇调整乙醇浓度至质量百分比90%，用本发明提 供的所述检测方法测得原花青素含量为0. 206mg/ml，测定时间为11分钟。(2)取银杏叶提取过程中的在线70%乙醇洗脱半成品200ML，经减压干燥，得银 杏叶提取物46%ig，用本发明提供的所述检测方法测得原花青素为37. 20mg，重量百分比为 8. 02%，原花青素得率为0. 186%，测定时间为10分钟。实施例5葡萄籽提取物生产过程中原花青素含量的检测(1)葡萄籽原料检测 称取IOg葡萄籽，粉碎，入250ml圆底烧瓶，加入IOOml质量百分比50 %乙醇，90摄 氏度回流提取1小时，过滤，再重复提取2次，合并滤液，得滤液约^Oml。取Iml滤液，用本 发明提供的所述检测方法测得原花青素含量为1. 668mg/ml,即原花青素总量为467. 04mgo(2)葡萄籽中间产物检测取葡萄籽提取过程中的滤液减压浓缩至无醇味，上样于处理好的大孔树脂，水洗 后，用质量百分比70%乙醇洗脱，得70%乙醇洗脱部位约150ml。取Iml样本，用本发明提供的所述检测方法测得原花青素含量为2. 579mg/ml,即原花青素总量为386. 85mg。(3)葡萄籽提取物检测取葡萄籽提取物787. 69mg，用本发明提供的所述检测方法测得原花青素总量为 382. 17mg，重量百分比为45. 52%，原花青素得率为3.82%。实施例6松树皮提取物生产过程中原花青素含量的检测(1)松树皮原料检测称取IOg松树皮，粉碎，入250ml圆底烧瓶，加入IOOml质量百分比50%乙醇，90摄
氏度回流提取1小时，过滤，再重复提取2次，合并滤液，得滤液约^Oml。取Iml滤液，用本 发明提供的所述检测方法测得原花青素含量为0. 462mg/ml,即原花青素总量为129. 36mg。(2)松树皮中间产物检测将松树皮提取过程中的滤液减压浓缩至无醇味，上样于处理好的大孔树脂，水洗 后，用质量百分比70%乙醇洗脱，得70%乙醇洗脱部位约150ml。取Iml样本，用本发明提 供的所述检测方法测得原花青素含量为0. 701mg/ml,即原花青素总量为105. 15mg。(3)松树皮提取物检测取松树皮提取物487. 69mg，用本发明提供的所述检测方法测得原花青素总量为 102. 33mg,重量百分比为20. 98 %，原花青素得率为1.02%。
权利要求
1. 一种检测原花青素含量的方法，其特征其采用了以下步骤1.样品处理将含原花青素的样品预处理后溶于质量百分比为60-95%的乙醇溶液；II.显色剂配制将盐酸和香草醛分别用无水乙醇溶液定容然后混合组成显色反应液，盐酸在显色反应 液中的体积占比为6-15%，香草醛在显色反应液中的质量占比为0. 5-2% ；III.样品检测将配置好的原花青素乙醇溶液与显色反应液常温下反应5-12分钟，然后用分光光度 计测定反应液在496nm处的吸光度值，标准曲线法计算原花青素含量。
2.如权利要求1所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述含原花青素的 样品为在线生产的成品或干粉样品时，样品在温度40-50°C，用超声辅助溶解。
3.如权利要求1所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述含原花青素的 样品为在线生产时的半成品溶液时，调整半成品溶液乙醇浓度至60-95%。
4.如权利要求1所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述盐酸在显色反 应液中的体积占比为10%，所述香草醛在显色反应液中的质量占比为1%。
5.如权利要求1所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于反应时间为8分钟。
6.如权利要求2所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述待测的含原花 青素的成品为银杏叶的原花青素提取物。
7.如权利要求2所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述待测的含原花 青素的成品为银杏叶。
8.如权利要求1所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述待测的含原花 青素的样品为银杏叶提取物生产过程中的在线产品。
9.如权利要求6所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于所述银杏叶提取物 用重量百分比为80%的乙醇在46°C下用超声辅佐溶解，用含体积百分比10%盐酸和质量 百分比香草醛的无水乙醇显色液常温下反应8分钟，496nm处检测吸光度值，用标准曲 线法测定其含量。
10.如权利要求7所述的一种检测原花青素含量的方法，其特征在于对银杏叶采用以 下预处理步骤(1)、称取银杏叶，粉碎，用质量百分比80%乙醇回流提取3次，合并滤液；(2)、将滤液减压浓缩至无醇味，上样于处理好的大孔树脂，水洗后，用质量百分比70% 乙醇洗脱，得质量百分比70%乙醇洗脱部位；(3)、将质量百分比70%乙醇洗脱部位减压干燥，得银杏叶提取物，以此银杏叶提取物 配置乙醇溶液。
全文摘要
本发明提供了一种检测原花青素含量的方法，包括样品处理、显色剂配制、样品检测步骤，本发明用乙醇代替甲醇做为溶剂，在较高温度及超声下溶解干粉样品，使之完全溶解，解决了样品在高浓度乙醇中难以完全溶解的缺点；同时通过调整半成品溶液的乙醇浓度，解决了传统香草醛-盐酸法需要对半成品溶液先蒸干再用甲醇溶解样品的繁琐步骤，减少了原花青素在蒸干过程中的降解等问题，能对含原花青素的成品、半成品或原料在常温常压下进行，所需时间短且无毒而适于在生产现场实时进行检测，检测结果准确，真正做到准确快速简便，提高产品的生产效率。本发明相对于之前的测定原花青素的方法更加便捷、操作更加简单、结果的重复性好、准确性高。
文档编号G01N1/28GK102141519SQ20101061609
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者乔洪翔, 叶剑锋, 夏亚君, 姜迅知, 徐春玲, 徐洪明 申请人:浙江现代中药与天然药物研究院有限公司