专利名称：用于检测病原微生物的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种微流控生物芯片，特别涉及一种针对病原微生物样品分选/ 富集、内涵物裂解和生物发光定量检测的集成化微流控芯片。
背景技术：
强致病性病原微生物往往致病力强，如幽门螺杆菌大肠杆菌0157:H7(E. coli 0157:H7)的最低感染剂量可少于10个病原菌。因此，发展对环境、食品和临床标本中病原 微生物的快速、灵敏、特异的分析检测方法是人类社会预防传染性疾病扩散，确保人类健康 的迫切需要。目前，常规的病原微生物检测方法主要有培养法、免疫学检测法和分子生物学 法，且都因其自身研究手段的局限性而存在许多不足传统的细菌培养法和生化鉴定法特 异性低、耗时费力、对培养环境和操作人员要求严格，不适宜病原菌的快速检测。免疫学检 测方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)、生物发光免疫分析法、免疫胶体金技术等一般需要 提供数量较多的纯化细菌，或需对样品进行浓缩富集，同样难以在短时间内获得检测结果。 PCR及其相关技术虽具有高度的特异性和灵敏度，但由于方法过度敏感，在检测过程中，因 为样本污染、RNA非法转录、靶RNA低水平表达、引物设计不合理以及实验条件未优化、取材 的局限等常常出现假阳性或假阴性结果。相对于现有检测技术的缺陷，20世纪90年代初期出现的微流控芯片技术以其高 度的集成化、微型化、分析手段的多样化、分析速度快、准确度高等特点，在技术上呈现出独 特的优势，适合病原微生物快速检测的多项要求首先，微流控芯片系统具有多种操作单元 灵活组合、整体可控和规模集成的特点，可将整个病原微生物的样品处理和检测分析过程 整合在一块芯片上；第二，通过MEMS加工，可以很容易的在芯片上刻蚀密集的分析通道阵 列，大大增加了分析通量，并且芯片每一通道之间均相互独立，避免了样本的交叉干扰，分 离分析过程完全在一个相对密闭的通道中进行，降低了操作者被感染的危险性。第三，鉴于 芯片微通道的结构(微升级或纳升级)，微尺度下的高比表面积，流体传质、传热快，有效地 降低了样品和试剂的消耗量，大大缩短整个分析时间，达到快速分析的目的。因此，利用微 流控芯片技术进行微生物研究越来越受到人们的重视。目前，经过十多年的发展，各种基于微流控技术开展的病原微生物预处理(Inami H, et al.Biosens Bioelectron. 2009,24(11) 3299-3305 ；KulinskiMD, et al. Biomed Microdevices. 2009,11(3) :671_678·)、富集 / 分选(Bao N, et al. J Chromatogr A，2008， 1181(1-2) 153-158 ；Qiu J, et al. Talanta. 2009,79(3) :787_795·)以及分离检测(Lee SJ, et al. Sensors and ActuatorsB,2008,132(2) 443448 ；Zordan MD, et al. Cytometry Α. 2009,75(2) :155_162.)的新方法不断涌现。但现有的技术和方法主要是针对病原微生 物分析检测中的某一单元或步骤，如富集/分选、预处理或分离检测展开的，通常检测需要 分几次完成，有检测误差大、时间长、检测时消耗的药品和试剂量大等缺点。因此，在同一微流控芯片上实现病原微生物的分选/富集、内涵物裂解、生物发光 反应和检测一步完成的芯片，是目前亟待即将的问题。
发明内容本实用新型目的在于提供一种用于病原微生物检测的微流控芯片，采用本案所述 微流控芯片，能够实现免疫亲和识别/富集、内涵物裂解、生物发光反应和检测等一体化操 作，大大简化病原微生物的分析检测过程，显著降低样品用量和试剂耗量，并且还具有检测 误差小、时间短、成本低、携带方便、消耗的药品和试剂量少的优点。为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案用于检测病原微生物的微流控芯片，所述微流控芯片包括盖片和基片，盖片和基 片封接贴合，盖片上设置有两条流体传输通道、六边形识别/富集腔、生物发光检测单元和 两个储液池，填充有抗体修饰的微珠的识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通 道连通，第一储液池与第一流体传输通道连接、第二储液池与第二流体传输通道连接，第 一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第 二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔为台阶状。所述第一流体传输通道为入口通道，第二流体传输通道为出口通道；第一流体传 输通道宽200 μ m、深70μπκ长Icm ；第二流体传输通道宽200 μ m，深30 μ m，长1. 8cm。所述第二流体传输通道深度小于免疫富集腔深度。所述识别/富集腔腔体长7mm、宽3mm，其腔体深度为大于微珠直径的1倍并小于 微珠直径的2倍。所述识别/富集腔与通道相连的两斜边之间的夹角α为60°。所述识别/富集腔富集腔内的微珠呈单层排列。所述第一储液池和第二储液池的直径分别为1. 5mm和3mm。所述微珠材料为玻璃或聚苯乙烯材料，所述盖片材料为聚合物聚二甲基硅氧烷。所述微珠的表面固载的探针分子抗体为具有靶向各类病原微生物有机体的抗体。本实用新型具有如下的优点1.将病原微生物样品的进样，分选/富集、加试剂、混合、反应和内涵物的高灵敏 检测等功能集成在微芯片上，可大大简化分析流程，降低样品和试剂的消耗量，减少因多次 检测操作所带来的操作误差，避免样品转移所产生的样品损失，提高检测的分析速度、检测 准确度和灵敏度。2.以抗体为识别分子，可增强检测特异性，利用共价修饰可便利地将相应抗体固 载于微珠表面。微珠价格低廉，可根据样本的需要控制微珠的数量，保证检测灵敏度和检测 范围。同时，利用微流控技术，可便利地将微珠导入/导出微芯片，芯片可反复多次使用而 无污染，能保证测定的准确度。3.微米级或纳米级微珠具有较大的比表面积，可增加抗原/抗体的结合几率，有 利于加快免疫反应，缩短分析时间，提高病原微生物的检出速度。4.将样品预处理(包括识别/富集、内涵物裂解)、生物发光反应和检测等功能集 成至单一微流控芯片上，可使微流控芯片装置构造更为紧凑，利于发展微型化、便携化的病 原微生物检测系统。
图1为本实用新型芯片的结构简图；[0023]图2为本实用新型芯片的侧视图；图3为本实用新型芯片的结构简图，其中α为识别/富集腔斜边与通道向识别/ 富集腔内的延长线之间的夹角。图中，1为第一流体传输通道，2为识别/富集腔，3为第二流体传输通道，4为微 珠，5为第一储液池，6为第二储液池。
具体实施方式
运用模塑法(孟斐等.高等学校化学学报· 2002，23 (7) 1264-1268 ；刘长春等，微 细加工技术，2004，1 :58-61)制作出如图1所示微结构的PDMS盖片，经紫外光光化学处理 后，将此盖片与玻璃基片封接即可得到完整的微流控芯片。参见图1、图2及图3，该芯片由 流体传输通道1、3、识别/富集腔2、生物发光检测单元4和第一、第二储液池5、6组成。盖 片上设置有第一、第二流体传输通道1、3、六边形识别/富集腔2、生物发光检测单元4和第 一、第二储液池5、6，填充有抗体修饰的微珠4的识别/富集2腔的两端分别与第一、第二 流体传输通道1、3连通。识别/富集腔富集腔内的微珠呈单层排列。第一流体传输通道为 入口通道，第二流体传输通道为出口通道；第一流体传输通道宽200 μ m,深70 μ m，长Icm ； 第二流体传输通道宽200 μ m,深30 μ m，长1. 8cm。第一储液池和第二储液池的直径分别为 1. 5mm和3mm。第一储液池5与第一流体传输通道1连接、第二储液池6与第二流体传输通 道3连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端。所述识别/富集腔腔体长7mm、宽3mm，深 70 μ m0识别/富集与通道相连的两斜边之间的夹角α为60°，其腔体深度为大于微珠直 径的1倍并小于微珠直径的2倍。采用这种结构的六边形微腔，使其具有较大的有效腔体 面积，可拥有较高的微珠填充率；六边形的稳定结构，可使装填的微珠排列为稳定的六边形 晶格聚集模式，不易受到液流剪切的影响而保持其排列的稳定性；而且六边形腔体结构较 相同体积的圆形、方形、菱形等几何形状具有更大的径向长度，液流进/出腔体时，流体的 线速度沿腔体径向呈线性改变，减少了流速较大时腔体内产生死体积的可能性。腔内填充 有经抗体修饰的微珠，微珠粒径为微米级，略小于腔体深度，使其在微腔内呈单层排列。微 珠采用玻璃或聚苯乙烯材料。微珠的表面固载的探针分子抗体为具有靶向各类病原微生物 有机体的抗体，所述盖片材料为聚合物聚二甲基硅氧烷。储液池与外部传输装置相连，生物 发光检测单元位于第二流体传输通道3的末端或第二储液池6，本实施例的发光检测位点 位于出口储液池6中。第二流体传输通道深度小于富集腔深度，使第二流体传输通道3与 免疫富集腔2为台阶状，防止微珠流入出口通道。微珠的表面固载的探针分子抗体的方法如下准确称取IOmg直径50 μ m玻璃微珠于离心管中，用Piranha溶液(H2SO4 H2O2 =3 1)浸泡过夜后，再用无菌超纯水洗涤5次，然后置于70°C干燥30min。在离心 管中加入2% APTES丙酮溶液反应lmin，依次用丙酮和无菌超纯水清洗5次。在10 μ L Img .mL—1 抗体工作液中加入 50 μ L MES 缓冲液、8 μ L 4mg 'mL^EDC C2mmol Γ1)禾口 12 μ L 4mg · Iiir1NHS C2mmol · ml/1)，室温反应 15min 后，加入 120 μ L 0. Imol · L-1PBS 缓冲液终止 NHS-抗体活化酯形成反应，即得到抗体浓度为50 μ g .mL-1的反应液。将反应液加入上述装 有玻珠的离心管中，室温反应2h。反应完毕后用0. Imol ^r1PBS清洗3次，得到经抗E. coli 0157:H7多克隆抗体修饰的免疫微珠，置于4°C备用。[0029]将芯片依次用75%酒精、无菌超纯水清洗后，用小牛血清白蛋白(BSA)封闭 30min,再用pH = 7. 20的0. Olmol · IZ1PBS缓冲液清洗。将经抗体修饰后的微珠加入已 注满0. Olmol · L-1PBS的芯片微通道入口储液池内，利用注射泵以10 μ 1 · mirT1流速正压 驱动填充入免疫微腔内。该芯片免疫富集腔内的微珠易于导入和导出，在富集腔内成单层 紧密排列。本实施例采用标准菌株E. coli 0157:H7和经抗E. coli 0157:H7多克隆抗体 (Kirkegaard&Perry Laboratorieslnc，USA)修饰的微珠进行微流控芯片的分析检测。上述方法根据不同的抗体，选择不同的试剂和反应条件，可以得到不同的抗体修 饰的微珠。采用本实用新型所述芯片检测病原微生物的方法如下将含有病原微生物的样品通过第一储液池5，在泵压驱动下通过第一流体传输通 道1进入免疫识别/富集腔2中；腔内填充有经抗体修饰的微珠，通过特异性的免疫识别反 应，样品中的病原微生物被识别、捕获，并被富集于微珠表面；反应结束后，驱动生物发光试 剂经第一储液池5、第一流体传输通道1进入免疫识别/富集腔2，富集的病原微生物被其 中的裂解剂裂解后，释放出内涵物并生成发光复合物，将生成的发光复合物洗脱至第二流 体传输通道3和第二储液池6，以第二储液池6作为发光检测点检测生物发光强度。根据发 光强度的大小即可判断样品中目标病原微生物的是否存在和含量的多少，从而得到检测结
果 ο如将LB培养基37 "C增菌8h的E. coli 0157:H7菌液用pH = 7. 20的 0. Olmol · L-1PBS缓冲液稀释10倍。取此细菌悬液1 μ L加入至芯片入口储液池中， 以5μ L · mirT1流速正压驱动至芯片内，再用pH = 7. 20的0. Olmol · L^1PBS缓冲液以 IOyL-mirT1流速冲洗5min，以降低或消除芯片壁、微珠间隙产生的非特异性吸附或残留。 将生物发光试剂(BacTiter-Glo Microbial CellViability Assay，Promega，USA)以 1 μ L · mirT1流速正压传输至芯片中，于芯片出口储液池为发光检测点检测发光强度。
权利要求一种用于检测病原微生物的微流控芯片，所述微流控芯片包括盖片和基片，盖片和基片封接贴合，其特征在于盖片上设置有两条流体传输通道、六边形识别/富集腔、生物发光检测单元和两个储液池，填充有抗体修饰的微珠的识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通道连通，第一储液池与第一流体传输通道连接、第二储液池与第二流体传输通道连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔为台阶状。
2.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第一 流体传输通道为入口通道，第二流体传输通道为出口通道；第一流体传输通道宽200 μ m、 深70μπκ长Icm ；第二流体传输通道宽200 μ m，深30 μ m，长1. 8cm。
3.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第二 流体传输通道深度小于免疫富集腔深度。
4.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述识别/ 富集腔腔体长7mm、宽3mm，其腔体深度为大于微珠直径的1倍并小于微珠直径的2倍。
5.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述识别/ 富集腔与通道相连的两斜边之间的夹角α为60°。
6.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述识别/ 富集腔富集腔内的微珠呈单层排列。
7.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述第一 储液池和第二储液池的直径分别为1. 5mm和3mm。
8.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述微珠 材料为玻璃或聚苯乙烯材料，所述盖片材料为聚合物聚二甲基硅氧烷。
9.根据权利要求1所述的用于检测病原微生物的微流控芯片，其特征在于所述微珠 的表面固载的探针分子抗体为具有靶向各类病原微生物有机体的抗体。
专利摘要本实用新型涉及一种用于检测病原微生物的微流控芯片，所述芯片包括盖片和基片，盖片上设置有流体传输通道、识别/富集腔、生物发光检测单元和储液池，识别/富集腔的两端分别与第一、第二流体传输通道连通，第一、二储液池分别与第一、二流体传输通道连接，第一、二储液池分别位于芯片的两端，储液池与外部传输装置相连，生物发光检测单元位于第二流体传输通道的末端或第二储液池，第二流体传输通道与免疫富集腔为台阶状。采用本案所述微流控芯片，能够实现免疫亲和识别/富集、内涵物裂解、生物发光反应和检测等一体化操作，大大简化病原微生物的分析检测过程，显著降低样品用量和试剂耗量，具有检测误差小、时间短、成本低、携带方便的优点。
文档编号G01N33/569GK201628717SQ20102011073
公开日2010年11月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者张惠静, 张莉, 毕颖楠, 管潇, 郝敦玲 申请人:中国人民解放军第三军医大学