专利名称：甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫层析法快速 检测甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸。
背景技术：
甲型Hmi流感病毒是一种新型的流感病毒，2009年在世界范围内大流行，严重 危害人类的健康。其“Ha”指的是血球凝集素(Hemagglutinin)、“Na”指的是神经氨酸酶 (Neuraminidase)，甲型流感病毒H有1 15型，有1 9型。Hmi是甲型流感病毒的一 种，也是危害最大的病毒之一。在历史上曾造成数次大流行。目前对甲型Hmi流感检测的主要方法是PCR基因扩增诊断方法，鼻咽试纸抗原诊 断方法等。在抗体检测方面，有ELISA等检测方法，但用胶体金类免疫层析技术对甲型Hmi IgM抗体进行检测尚未有相关报道。对Hmi IgM和总抗体抗体检测主要有已下作用1 对Hmi流感进行辅助诊断。 部分Hmi感染的病程较长，可达2周已上，而IgM在5-7天时即可检测出来，并且IgM的存 在时间较短，是现症感染的标志，对疾病的治疗有重要的作用；若检测只有IgG抗体而没有 IgM抗体，则是既往感染，可排除现症感染。对免疫接种的效果进行评价，从数据上看，目前 HlNl接种的有效率约为90%，尚有10%的人需要筛选出来重新接种或用其它方式进行该 病的预防。IgM的早期检出和IgG长期存能从两个方面评价疫苗的反应性和有效性。考虑 到感染和接种的人群巨大，运用一种快速、简便、有效的抗体检测方法是必要的。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，在抗体检测方面已得到较为广泛运用， 基本原理如下利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或 抗体，检测时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗粒和样品中配体相结 合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成肉眼可见的检测T线， 通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合 现场检测和经济实用等优点。
发明内容本实用新型的目的是提供一种甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，具有操 作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。本实用新型提供一种甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于塑料 支撑板8 —端连接上样垫1，上样垫1的一端紧密压接含有标记Hmi特异性的血球凝集素 Ha或Hmi特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫2，胶体金垫2 —端紧 密压接硝酸纤维素NC膜3，硝酸纤维素NC膜3包被有相互分离的检测线T15、检测线T26 和质控C线，检测线T15为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T26为包被在NC膜上的 HlNl特异性的血球凝集素Ha或Hmi特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，质控 C线7为包被在NC膜上的抗Hmi抗体，硝酸纤维素NC膜3的另一端连接吸样垫4形成试纸。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的抗原为Hmi 特异性的血球凝集素(Ha)和神经氨酸酶(Na)抗原，抗原可以从Hmi病毒中纯化提取或利 用基因工程重组表达。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的上样垫1为 玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫4由吸水滤纸构成。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包 被方法为以0. OlM PH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成l_2mg/ml的溶液， 以0. OlM pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人Hmi特异性的血球凝集素(Ha)和或神经氨 酸酶(Na)抗原配制成0. 5-2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参数进行划 线，包被T1、T2线，同时在NC膜上部包被抗Hmi抗体作为C线，划线后将NC膜在干燥间温 度20-25°C，湿度小于30%干燥2-5小时。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，所述的混合抗原 标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶 液，制备完成后取IOOml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2CO3调至pH8. 0，按IOOml胶体金溶 液加入0. 5-2mg Hmi特异性的血球凝集素(Ha)和(或)神经氨酸酶(Na)抗原，室温搅拌 2小时，加入牛血清白蛋白BSA，0. 聚乙二醇PEG20000封闭20min，12000r/m离心30 分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按Iml溶液铺22cm2的比例均勻地铺在玻璃纤 维膜或无纺布上，再置干燥间温度20-25°C，湿度小于30%干燥2-4小时，制成胶体金垫。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配 方法为在干燥室内(温度20-25°C，湿度小于30%)，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放 置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在 胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭 吸样垫的1/10)；最后用裁剪机将贴好塑料板切成2-5mm宽的试纸条。切好的试纸条可以 再装入塑料卡内，形成检测卡。所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于，检测方法为将被 检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-100U1被检样品， 样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察在20分钟内C、T线的出现情况，并 判定检测结果。本实用新型的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测甲型Hmi流 感病毒IgM和总抗体检测试纸。采用胶体金标记甲型Hmi流感病毒抗原，包被抗人IgM和 甲型Hmi流感病毒抗原实现对血液中抗甲型Hmi流感病毒抗体的检测。具有操作简便、 反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
附图为甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸结构示意图。附图符号说明1 上样垫；2 胶体金垫；3 :NC膜；4 吸样垫5 检测线Tl ；6 检测线T2 ；7 质控 (C)线；8 塑料支撑板
具体实施方式
实施例制备甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸1主要材料1. 1特异性甲型Hmi流感病毒Ha抗原Sino Biological Inc.产品，为重组抗 原，用于胶体金标记；鼠抗人IgM:军事医学科学院产品，抗Ha抗体，用Ha免疫山羊自制，用 于NC膜包被；氯金酸Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜Millipore公司产品；牛血清 白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试 剂。1. 2临床血清由公司在相关医院获得，其中在近期接种Hmi疫苗样本80份，未接 种疫苗样本120份。1. 3 甲型 HlNl 流感病毒 IgM 和 IgG ELISA 试剂盒，Sino Biological Inc.产品。2 方法2. 1甲型Hmi流感病毒Ha重组抗原的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法 制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2M K2CO3将溶液调 到pH7. 0、pH8. 0和pH9. 0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入 0. 5mg、lmg、l. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入 到终浓度为0. 1 %的PEG2000和1 %的BSA进行封闭20min,标记结束后以12000r/m离心， 弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金工作液硼酸盐缓冲液，PH8. 0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按Iml溶液铺22cm2的比例加样于无纺 布上，在温度20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫。2. 2NC膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS将鼠抗人 IgM分别稀释成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ ml，甲型Hmi流感病毒Ha重组抗原分别稀释成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪 在NC膜下部按lul/cm进行分别划线包彼，同时在NC膜上部包被抗Ha抗体，用于产品的质 控，包被完成后将NC膜在在温度20-25°C，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2_5小时。2.3甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度 20-25°C，相对湿度< 30% )取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘 贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴 上样垫(搭胶体金垫的1/5)；在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10)；然后用裁 剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成 甲型Hmi流感病毒IgM抗体检测试剂卡。2. 4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂卡平放，在 上样垫上加入50-100U1被检样品，若样品中含抗甲型Hmi流感病毒IgM或IgG抗体，则和 样品垫上的标记甲型Hmi流感病毒抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一 步层析，当遇到包被在NC膜上Tl线处的鼠抗人IgM时，复合物则又和包被抗IgM抗体结 合，被捕获在包被处；当遇到包被在NC膜上T2线处的Hmi抗原时，复合物则又和包被抗原 体结合，被捕获在包被线T2处；当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉 眼可见的T或T2线；若血清中不含特异性抗体，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线， C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在5、10、15、20,30和45分钟内C、T线的出现情况，并判定检测结果。2. 5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利 用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。2. 6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有临床血清进行检测，同时用Sino Biological Inc. IgM和IgG抗体检测ELISA试剂进行对照检测。3 结果3. 1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8. 0 ；重组 混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为IOmM硼酸酸盐缓 冲液，pH8. 0，含0. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM包被 浓度为lmg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-20分钟。但以上参数在制备不同批次产品 时可能需要适当调整。3. 2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份近期接种甲型Hmi流感病毒疫苗人 员的样本中，在对Hmi IgM抗体的检测中，本试剂IgM检测出阳性65份，ELISA检测出IgM 阳性血清72份，灵敏度=65/72 = 90. 1% ；本试剂IgM对120份未接种Hmi疫苗人员样 本中检出阴性为112份，和ELISA试剂的检测出率完全一致，相对特异性100%。P > 0. 05。 在对Hmi IgG抗体的检测中，80份近期接种甲型Hmi流感病毒疫苗人员的样本中，检测出 阳性70份，ELISA检测出阳性血清72份，灵敏度=70/72 = 97.2% ；本试剂对120份未接 种Hmi疫苗人员样本中检出阴性为110份，ELISA试剂的检测阴性为112分，相对特异性 为 110/112 = 98. 2%o P > 0. 05。临床检测表明本试剂的性能和ELISA试剂相比无显著性差异，适合临床检测需要。
权利要求一种甲型H1N1流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于塑料支撑板(8)一端连接上样垫(1)，上样垫(1)的一端紧密压接含有标记H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原的胶体金垫(2)，胶体金垫(2)一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(3)，硝酸纤维素NC膜(3)包被有相互分离的检测线T1(5)、检测线T2(6)和质控C线，检测线T1(5)为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，检测线T2(6)为包被在NC膜上的H1N1特异性的血球凝集素Ha或H1N1特异性的血球凝集素Ha和神经氨酸酶Na抗原，质控C线(7)为包被在NC膜上的抗H1N1抗体，硝酸纤维素NC膜(3)的另一端连接吸样垫(4)形成试纸。
2.根据权利要求1所述的甲型Hmi流感病毒IgM和总抗体检测试纸，其特征在于所述 的上样垫(1)为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫(4)由吸水滤纸构成。
专利摘要本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒H1N1IgM和总抗体联合检测试纸，采用胶体金标记甲型H1N1流感病毒抗原，包被抗人IgM和甲型H1N1流感病毒抗原实现对血液中抗甲型H1N1流感病毒抗体的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/543GK201637745SQ201020142108
公开日2010年11月17日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者李洲, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司