专利名称：检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板及试剂盒的制作方法
技术领域：
实用新型涉及人全血中他克莫司药物的检测，特别涉及一种检测人全血中他克莫 司药物浓度的试剂盒。
背景技术：
他克莫司(tacrolimus)是大环内酯类免疫抑制剂，1989年首次应用于临床。他 克莫司与其结合蛋白FKBP12相结合，而在细胞内蓄积产生效用。FKBP12-他克莫司等复合 物会专一性地结合以及抑制钙调神经磷酸酶的活性，阻断T细胞激活过程，同时还有他克 莫司所不具备的T-细胞依赖性抗体的生成，阻断细胞因子的转录，呈现双重的免疫抑制作 用，其免疫抑制作用较他克莫司强100倍，其临床上主要用于肝肾等器官移植后的免疫排 斥抑制治疗。他克莫司的个体吸收率和清除率差别很大，且用药剂量与血药浓度之间缺乏 紧密的相关性，在高血浓度时有一定的毒性，主要是神经毒性、肾毒性和糖代谢异常等。由 于其治疗窗窄，给临床治疗增加了相当的难度，因此需要反复测定期血中浓度以调整用药 剂量。大部分(75% 80% )的他克莫司药物连结在红细胞上，导致全血药物浓度较血 浆药物浓度为高，两者不相关，全血和血浆中药物浓度的分布与多种因素有关。药代动力学 研究表明，他克莫司全血而非血浆浓度能够更好的表明他克莫司的药代动力学特征，故血 液检测中以该药品以全血药物浓度为依据。如前所述，他克莫司在血液中主要和红细胞上的结合蛋白结合，因此在他克莫 司血液浓度检测前，必须对全血样本进行处理，使红细胞破裂，他克莫司与其绑定蛋白分 离。由于他克莫司水溶性较差，目前常用有机溶剂如甲醇、DMSO裂解沉淀法，酶消化法来提 取他克莫司，这些方法都需要使用离心机对样品进行高速离心以除去沉淀蛋白，这使得他 克莫司不能直接在自动化平台上检测，而需要前处理操作。同时这一前处理方式有很多缺 点，如所用有机溶剂往往有毒性，操作需谨慎，同时这些有机溶剂易于挥发，如果在样品前 处理完成后不能及时检测，结果将有较大变化等等。为了实现他克莫司检测的完全自动化， 同时克服有机溶剂提取前处理法的缺点，科学家已经找到一些无需有机溶剂沉淀和离心的 方法。在美国专利7186518中，作者合成了一个他克莫司的衍生物，该化合物能够竞争性的 与他克莫司结合蛋白结合，将他克莫司从其结合蛋白中置换出来，但是却不与他克莫司单 克隆抗体结合，研究表明雷帕霉素也可以起到这样的作用。因此作者首先将全血样品用超 声波进行破碎，然后在样品中加入含一定浓度的他克莫司衍生物的提取液，混合均勻，样品 即可用于检测，结果显示此法的结果优于有机溶剂提取法。在美国专利2007/0087396中， 作者用分别用非离子去垢剂如Triton XlOO作为红细胞裂解剂，胆酸盐作为提取剂来处理 样品，处理过的样品可以直接用于他克莫司检测而无需其他任何处理。这两项技术使得使 用自动化平台全过程检测他克莫司成为可能，同时也为他克莫司的快速半定量检测提供了 样品处理的方法目前测定全血Π(506浓度的方法主要有，受体结合法、高效液相-质普测定法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、微粒子酶联免疫测定法(MELA)以及化学发光微粒子 免疫法等。其中受体结合法主要用于药物研究；液质联用是目前最准确、灵敏度最高、具有 特异性的冊506浓度分析方法，最低检测限为0. 2 μ g/L，但其稳定性不是很好且成本较高， 需要大型设备仪器，仍主要用于科研领域；微粒子酶联免疫测定法(MELA)以及化学发光微 粒子免疫法(CMIA)是目前最常用的检测方法，这两种方法检测结果准确，操作相对简便， 但是试剂目前均需要进口，价格高昂，而且必须配以昂贵的专有设备使用，因此只适用于一 些大型医院使用。目前所用的ELISA试剂盒也依赖进口，价格昂贵。使用过程反应时间较 长，需要对样品进行酶消化、震荡等处理，使用不是很方便。基于以上情况，目前仅有一些大型医疗机构可以进行他克莫司药物浓度的检测， 远离大城市的患者往往需要长途跋涉到达医院或是通过邮寄标本的方式才能进行此项测 试，费时费力，而且不能得到及时的检测。即使在大型医院，由于使用大型机器成本的问题， 往往也是积攒够一定数量样品后，才进行检测，检测往往被延误，以至于医生不能即使指导 病人用药。因此市场急切的需要一种快捷简单、价格低廉、不依赖任何仪器设备，同时又能 准备、灵敏的检测他克莫司浓度范围的手段，这一手段可以供所有医疗机构甚至患者自己 使用，为患者提供血药浓度范围的基本信息，为是否需要进行下一步精确检测提供依据。
实用新型内容本实用新型根据上述领域的空白及需求，提供一种检测人全血中他克莫司药物浓 度的试剂盒。检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板，其特征在于所述酶标板的反应孔内 包被有他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物。检测人全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，包括盒内支架和酶标板，其特征在于 所述盒内支架上设置有酶标板放置槽，所述酶标板放置槽中放置上述酶标板。所述盒内支架上设置若干试剂容器槽，试剂容器槽中放置的容器分别为盛装他克 莫司抗体液、酶标记抗体液、样品前处理液、样品稀释液、底物液终止液、浓缩洗液和/或他 克莫司标准品的是试剂瓶或试剂管。本实用新型提供一种检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板，该酶标板的反应 孔内包被的物质为他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物。检测时，采用间接竞争ELISA 法检测人全血中他克莫司的浓度，向微孔板中加入样品稀释液，待测样品和他克莫司抗体 液，样品中的他克莫司与包被在微孔板上的他克莫司竞争结合他克莫司抗体，反应终止后 洗涤，加入酶标二抗，反应后洗涤，再加入底物液显色，显色终止后，用酶标仪测定吸光度， 样品中他克莫司的浓度将与吸光度值呈负相关，用校准品拟合标准曲线，样品与标准曲线 比较即可得到他克莫司的浓度。酶标板可以同时检测包括标准品在内的很多个样品，适合 批量检测。本实用新型进一步提供一种包括上述酶标板的试剂盒，试剂盒内设置了 一个用于 存放各种试剂容器的盒内支架，盒内支架上设置若干试剂管放置槽，其中一个为酶标板槽， 用于放置上述酶标板，该设计便于试剂盒的存放和运输。本实用新型优选所述盒内支架上设置若干试剂容器槽，所述若干试剂容器槽中的 容器分别为盛装他克莫司抗体液、酶标记抗体液、样品前处理液、样品稀释液、底物液、终止液、浓缩洗液、他克莫司标准品的试剂瓶或试剂管。这些试剂为检测中的必须试剂，因此在 试剂盒中设置了放置盛装这些试剂的容器的位置，最大程度地提供便捷的即用型检测试剂 盒，只要有酶标仪，买到本实用新型试剂盒就可以检测。
图1.本实用新型检测人全血中他克莫司药物浓度的试剂盒内部结构俯视示意图图2.本实用新型试剂盒检测的校准品曲线。其中1-盒内支架，2-酶标板，3-反应孔，4-他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶 联物，5-试剂管放置槽。
具体实施方式
如图1所示，本实用新型检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板，其特征在于 所述酶标板2的反应孔3内包被有他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物4。检测时，在 反应孔3中加入抗他克莫司抗体液与待测样品的混合液，包被的他克莫司半抗原与载体蛋 白分子的偶联物4与样品中的他克莫司竞争性地域抗体液中的抗体结合，反应结束后，加 入洗液洗掉没有与包被有他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物4结合的物质，然后加 入二抗及显色底液，在酶标仪上检测显色吸光值，样品中他克莫司的浓度将与吸光度值呈 负相关，在校准标准曲线上找到该吸光值对于的他克莫司浓度。本实用新型提供的酶标板 能够一次完成包括制备标准曲线在内的标准品及其其它若干样品，一次得出若干样品的检 测值。本实用新型还提供了包括上述酶标板2的试剂盒，试剂盒内设置了一个用于存放 各种试剂容器的盒内支架1，盒内支架1上设置若干试剂管放置槽5，其中一个为酶标板槽， 用于放置上述酶标板2，该设计便于试剂盒的存放和运输。本实用新型优选所述盒内支架1上设置若干试剂容器槽5，所述若干试剂容器槽 中的容器分别为盛装他克莫司抗体液、酶标记抗体液、样品前处理液、样品稀释液、底物液、 终止液、浓缩洗液、他克莫司标准品的试剂瓶或试剂管。这些试剂为检测中的必须试剂，因 此在试剂盒中设置放置盛装这些试剂的容器的位置，最大程度地提供便捷的即用型检测试 剂盒，只要有酶标仪，买到本实用新型试剂盒就可以检测。实验例1.试剂盒组分的制备与试剂盒组建1. 1.抗原制备称取250mg FK506，15mg 琥珀酸酐，6mg 吡啶(4-dimethylaminopyridine)溶于 6. 25ml新蒸馏的二氯甲烷。边搅拌边加入42ul三乙胺。室温继续搅拌2小时。以上混合 物用二氯甲烷稀释到20ml。分别用等量的0. 1当量盐酸、纯化水、饱和的氯化钠各洗一次。 在分液漏斗内静止分层，然后过滤收集下层液(二氯甲烷)。所得到的有机相放在无水硫酸 镁上干燥，用磁力搅拌器持续搅拌30分钟，然后用砂芯漏斗抽滤以除掉硫酸镁。用旋转蒸 发仪浓缩，直至呈轻微黄色泡沫。用少量二氯甲烷重溶并过硅胶色谱柱，二氯甲烷与甲醇按 9 1的比例混合做流动相，收集第一个流出的组分。在旋转蒸发仪上将进行干燥，得到淡 黄色Π(506半琥珠酸酯。称取35mg FK506半琥珠酸酯，5. 4mg N-羟基琥珀酰亚胺和8. 8mg N，N- 二环己基碳化二亚胺溶于5ml乙酸乙酯，在磁力搅拌器上继续搅拌24小时。6000rpm
5离心5分钟以除去中的沉淀物。在旋转蒸发仪上干燥中的上清，得到含有活性酯的反应混合物。上述材料无需进 一步纯化活性。称取Img活性酯溶于2. 5ml N，N- 二甲基甲酰胺。量取0. 14ml与0. 62ml N，N- 二 甲基甲酰胺混合并逐滴加入到IOml (含IOmg)卵清蛋白中。用磁力搅拌器于室温混合2. 5 小时，然后加入lmll. 8M Tris0用S印hadex G-25层析纯化。1. 2.包被酶标板制备用包被缓冲液(pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液)将他克莫司与卵清蛋白偶联 物稀释到1. 5ug/ml，加入到酶标板中，每孔100ul，37°C反应2小时，甩掉包被液，用洗涤液 清洗2次，每次30秒。每孔加入200ul封闭液，37°C反应2小时，甩掉封闭液，拍干，于30°C 干燥箱烘干3-5小时，用铝箔袋真空包装保存。1. 3.他克莫司抗体选择Fitzgerald公司生产的FK506单克隆抗体mouse monoclonal anti-Tacromilus antibody，IgM，，用抗体稀释液进行1 10000稀释，制备成使用浓度液。1.4.酶标二抗选择KPL公司生产的HRP标记的羊抗鼠IgM抗体HRP-labeled GoatAnti-Mouse IgM(y )，用二抗稀释液稀释8000倍到工作浓度。1.5.样品稀释液为含0. 3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液，pH8. 0。1. 6.样品前处理液为含60mM硫酸锌ZnSO4的甲醇与乙二醇混合液1. 7.显色底物液底物液分为A、B 二液，A为过氧化脲溶液，B为四甲基联苯胺(TMB)溶液1. 8.终止液终止液为2N硫酸溶液1. 9.浓缩洗液浓缩洗液为含10 %吐温20的磷酸盐缓冲液。1. 10.他克莫司标准品他克莫司标准品为含有不同浓度他克莫司的人全血溶液，他克莫司浓度分别为0、 3、6、12、20、30ng/ml。1. 11.在以上10个步骤制备的基础上，分别取酶标板(96人份)1块，他克莫司抗 体3ml/瓶酶标二抗3ml/瓶，样品稀释液12ml/瓶，样品前处理液18ml/瓶，底物液A 6ml/ 瓶，底物液B6ml/瓶，终止液12ml/瓶，浓缩洗液30ml/瓶，他克莫司标准品4ml/瓶(A-F共 6瓶)，即可组成一个他克莫司浓度检测试剂盒(竞争酶联免疫法)实验例2人全血样品中他克莫司浓度的检测1. 12.样品前处理从冰箱拿出IMx普乐可复II校准品(瓶上分别标示为A、B、C、D、E、F)和待测 样品，在振荡器上充分振荡混勻以上液体，立即精确吸取150μ 1每个样品到相应的离心管中，将150μ 1的样品前处理液分别加到每个离心管后立即盖好管帽，用旋涡混合仪高速旋 转，确保每个样品充分混勻。将离心管放入离心机，离心时间和速度一定要保证(13000转， 6分钟)。1. 13.样品检测在酶标板待测孔每孔加入样品稀释液60ul，加入处理过的样品以及校准品20ul， 加入他克莫司抗体20ul，充分混勻，用封板膜封板，37°C温箱反应30min。甩去液体，每孔加 入洗液300ul，放置30秒，拍干。重复5次。每孔加入酶标二抗100ul，37°C反应30分钟。 甩去液体，每孔加入洗液300ul，放置30秒，拍干。重复5次。每孔加入底物液A、B各50ul 混勻，37°C避光反应10分钟，每孔加入终止液lOOul，用酶标仪双波长读值(A45cia53q)。1. 14.结果分析以校准品浓度标示值为X轴，以检测吸光度值为Y，进行四参数拟合，得到拟合曲 线图2，将待测样品吸光度带入，即可求得样品浓度，四参数拟合所得相关系数R2需大于 0. 99。所得曲线见图2以样品检测结果表2 表1标准曲线参数
表2校准品测试数据 10%。间差。
从结果看，本试剂盒检测结果非常准确，所测样品结果与已知浓度值偏差均小于 实验例3试剂盒精密性
分别以试剂盒重复检测标示值为5和20的质控品，计算其检测结果的批内差，批 表3.第一个批号[0059] 表4.第二个批号 用标识值为20的质控品计算批间差。批间差=20. 51/((20. 51+20. 71)/2)= 0. 97% .结果显示，试剂盒批内差、批间差均小于15%。
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权利要求检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板，其特征在于所述酶标板的反应孔内包被有他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物。
2.检测人全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，包括盒内支架，其特征在于所述盒内支 架上设置有酶标板放置槽，所述酶标板放置槽中放置有权利要求1所述的检测人全血中他 克莫司药物浓度的酶标板。
3.根据权利要求2所述的检测人全血中他克莫司药物浓度的试剂盒，其特征在于所 述盒内支架上设置若干试剂容器槽，所述试剂容器槽中放置的容器分别为盛装他克莫司抗 体液、酶标记抗体液、样品前处理液、样品稀释液、底物液终止液、浓缩洗液和/或他克莫司 标准品的是试剂瓶或试剂管。
专利摘要本实用新型“检测人全血中他克莫司药物浓度的酶标板及试剂盒”，属于医学检测领域。所述酶标板的反应孔内包被有他克莫司半抗原与载体蛋白分子的偶联物。检测时，在反应孔内加入待测血样品与抗他克莫司抗体的混合液，最后加入二抗及显色底物，酶标仪检测吸光值，通过标准曲线测得他克莫司浓度，吸光值与他克莫司浓度呈反比。即采用竞争性免疫反应原理定量检测全血中的他克莫司含量。本实用新型还提供了包括上述酶标板和检测反应所需的必须试剂的试剂盒，最大限度地提高了检测的便捷性。
文档编号G01N33/543GK201681077SQ20102019739
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者李全, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司