专利名称：一种检测血清中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测血清中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统。
背景技术：
土拉菌病(tularenmia)是由土拉弗朗西斯菌(Francisellat tularensis)引起的多种野生动物、家畜及人共患病，亦称野兔热。临床上以体温升高、淋巴结肿大、脾和其他内脏坏死为特征，土拉菌可以被用作生物战中的致病病菌，感染者会出现高烧、浑身疼痛、腺体肿大和咽食困难等症状。免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记二抗与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记二抗-抗体-固相抗原复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片方法是否能够检测人血清中的土拉抗体，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价
实用新型内容
本实用新型的目的在于提供一种检测血清样品中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统，该芯片系统包括:芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。进一步，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。进一步,所述编码微球优选为028号编码微球。进一步,所述捕获抗原优选为土拉fopA蛋白。进一步，所述待测抗体为血清样品。进一步，所述生物素标记的二抗和/或SPA优选为BiOtin-羊抗兔和/或Biotin-SPA。进一步，所述荧光信号检测物为链亲和素-藻红蛋白。进一步，所述芯片基体为96孔滤板或者微量离心管。进一步，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发并识别待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。经过大量试验和深入的研究，对土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统作了实质性的改进和创新，其具有下列优点:1、抗原包被量的改进土拉fopA蛋白抗原的包被量是成功检测的关键，本实用新型对包被微球的抗原包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原包被量很低，本实用新型的抗原包被量为0.01 50 μ g/1.25 X IO6个编码微球，即0.002 200ng/2500 5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为I μ g/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗体连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现象，出现假阳性，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ L。3、检测的灵敏度及动态范围本实用新型的血清样品土拉抗体的蛋白质悬浮芯片定量检测方法检测灵敏度为
2.28ng/mL，动态检测范围为 2.69ng/mL 44200ng/mL。4、方法的特异性本实用新型通过选用土拉fopA蛋白为包被抗原，以兔抗土拉抗体为待测抗体，以生物素化的羊抗兔为捕获抗体。本研究试验证明，在存在鼠抗登革热IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗西尼罗多克隆抗体、兔抗登革热NS3抗体等干扰抗体存在的条件下，本方法具有良好的特异性。5、样品的检测能力本实用新型评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过对人血清的检测，初步证实了该方法在检测人血清中土拉抗体的实用性。
图1为本实用新型结构示意图；图2为028号微球包被土拉fopA蛋白检测土拉抗体示意图；图3为蛋白悬浮芯片方法检测兔抗土拉抗体剂量-反应标准曲线图。
具体实施方式
如图1至图3所 示，本实用新型一种检测血清样品中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体1、加液系统2、悬浮芯片检测仪3和计算机4，其中，芯片基体I为96孔滤板或者微量离心管，其内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球(图中未示)，编码微球上包被有土拉fopA蛋白，用于捕获待检测血清样品中的待测抗体，如果样品中有土拉抗体，土拉抗体与编码微球上的fopA蛋白结合，再加入带有生物素标记的二抗和/或SPA，形成编码微球-土拉fopA蛋白-土拉抗体-二抗/SPA-生物素复合物，最后加入链亲和素-藻红蛋白，链亲和素与生物素结合，形成编码微球-土拉fopA蛋白-土拉抗体-二抗/SPA-生物素-链亲和素-藻红蛋白复合物，通过悬浮芯片检测仪对藻红蛋白荧光信号的检测来达到对血清样品中土拉抗体的检测，如果血清样品中没有土拉抗体，包被有土拉fopA蛋白的编码微球不会与后面加入的生物素标记的二抗和/或SPA、链亲和素-藻红蛋白结合，最后通过悬浮芯片检测仪器进行检测时无荧光信号或应该信号非常弱。上述芯片系统中，编码微球在微球稀释液，待测抗体在样品稀释液中，生物素标记的二抗和/或SPA在抗体稀释液中，荧光信号检测物在SA-PE稀释液中，悬浮芯片检测仪检测时编码微球复合物在检测缓冲液中，每步结合之后均用微球清洗液洗涤微球，使得没有结合的物质清除体系。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球,包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发待测分子的颜色信号，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优`于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。本实用新型一种检测血清中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统，通过下面的具体实施方式
作进一步说明，但本实用新型不以任何方式受该实施例的限定。一、材料1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液:(I)PBS 缓冲液(pH7.4):NaCl 137mmol/L ；KC1 2.7mmol/L ；Na2HPO41OmmoI/L ；KH2P042mmol/Lo 用 800mL 蒸馏水溶解 8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2P04。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至IL0分装后在15psi (1.05kg/cm2)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7.4) ,0.05% TWEEN-20。(3)微球活化缓冲液 IOOmM NaH2PO4:3g NaH2PO4, 5N NaOH 1.5mL，定容于 250mL，pH
6.2ο[0038](4)微球包被缓冲液 0.05M MES，pH 5.0:2.44g MES，5N NaOH0.15mL，定容于250mLo(5)微球保存液PBS-TBN:PBS,0.1%BSA,0.02% TWEEN,0.05%叠氮化物，pH 7.4。(6)微球封闭液 PBS-BN:PBS,1% BSA,0.05%叠氮化物，pH7.4。(7)检测缓冲液:PBS,1% BSA, ρΗ7.4。(8)抗体稀释液 PBS，ρΗ7.4。(9)微球稀释液:PBS，I % BSA, ρΗ7.4。(10)样品稀释液 PVX:PBS,0.5% PVA,0.8% PVP ；(11) SA-PE 稀释液:PBS (ρΗ7.4)，I % BSA。2.抗原与抗体本实用新型所使用的抗原为土拉fopA蛋白，可购自中国检验检疫科学研究院。本实用新型所使用检测抗体为兔抗土拉IgG，可购自中国检验检疫科学研究院，检测二抗为生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，所述的羊抗兔IgG可购自北京鼎国生物技术公司、SPA可购自Sigma公司。二、待测样品的制备1、目标分析 物样品的制备目标分析物为兔抗土拉IgG，干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括鼠抗登革热IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗登革热NS3抗体、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液中，_4°C保存。兔抗土拉IgG的储备液浓度为0.1768mg/mL。比较实验中，相同样品用于ELISA和悬浮芯片的检测。将待分析的兔抗土拉IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。2、人血清样本的处理将人血清样本用样品稀释1: 10稀释，例如人血清样本5 μ L加样品稀释液50 μ L混匀后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。实施例1、检测土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统的制备1、捕获抗原包被编码微球本实用新型米用的028号编码微球购自美国Bio-Rad公司，编码微球用于标记可以捕获土拉抗体的土拉fopA蛋白抗原，即利用土拉fopA蛋白包被微球。A、编码微球的活化取100μ L(l.25X 106个)编码微球到1.5mL离心管中，14000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入100 μ L的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入100 μ L的微球活化缓冲液，接着先加入10 μ L新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10 μ L新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室温震摇20分钟。加入150 μ L的PBS (ρΗ7.4)，震荡后，14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7.4)悬浮编码微球。B、用抗原包被编码微球[0061]取捕获抗原即土拉fopA蛋白抗原0.01 50 μ g加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500 μ g，室温震摇2小时。14000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。用500 μ L的PBS缓冲液洗一次，14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入250 μ L的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加Λ 500 μ g的微球保存液洗涤编码微球，16000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150 μ L的微球保存液悬浮编码微球，于4°C避光保存备用。C、包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；l/400mm2)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数Xio4X稀释倍数X体积(mL))计算微球数量。2、检测物标记生物素A、生物素的标记分别配制好浓度为IOmM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记物溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20°C冻存备用。B、抗体的用量以标记2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ I。 实施例2、悬浮芯片系统制备条件的优化1、微球包被抗原包被量的选择分别以I μ g、2.5 μ g、5 μ g、7.5 μ g、10 μ g、12.5 μ g、15 μ g、20 μ g、25 μ g 的量包被100 μ L编码为028号的微球。经检测效果比较，以I 25 μ g/1.25X IO6个编码微球即
0.2 100ng/2500 5000个微球/测试，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被土拉fopA蛋白抗原的028号微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于土拉抗体的检测。2、生物素化检测物的优化本实用新型分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素,例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测物检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或按照制造商的产品说明书所述的方法。本实用新型人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体羊抗兔以1: 500稀释作为检测物进行检测兔血清中的土拉抗体，检测结果显示生物素化检测物Bio-羊抗兔抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化的检测物Biotin-SPA以1: 2500稀释作为检测人血清中土拉抗体的检测物，检测结果显示生物素化检测物Biotin-SPA可获得高检测值和低背景值的检测效果。实施例3、悬浮芯片系统样品制备、检测及结果判定1、待测样品制备用样品稀释液将待测样本配制为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。2、样品的检测及结果判定检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下:[0080]I)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3)加入50 μ L适当浓度的用检测物稀释液稀释后的生物素化检测物，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、检测结果判定根据试验研究结果与相关研究报道，本实用新型定义蛋白质悬浮芯片方法检测土拉抗体的最低检出限(L0D值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为=MFI (空白对照)+3倍标准差。若检测结果高于LOD对应荧光强度值则判定为土拉抗体检测结果阳性；若检测结果低于LOD对应荧光强度值则判定为土拉抗体检测结果阴性。实施例4、悬浮芯片系统对土拉抗体特异性检测应用悬浮芯片检测方法分别对兔抗土拉IgG、鼠抗登革热IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗登革热NS3抗体、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅兔抗土拉IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说明本实用新型所建立的土拉抗体的悬浮芯片检测方法与其它测试抗体均不发生交叉反应或非特异反应。
实施例5、悬浮芯片系统定量检测模型的建立1、兔抗土拉IgG标准曲线样品制备用样品稀释液将兔抗土拉IgG标准品由浓度为0.1768mg/mL以4倍倍比梯度稀释至浓度为0.6744ng/mL成系列浓度样品。2、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表滴度，Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定，图2 中兔抗土拉血清的滴度分别为:S1:0.6744ng/mL, S2:2.6977ng/mL, S3:10.791 Ong/mL,S4:43.164ng/mL, S5:172.6563ng/mL, S6:690.625ng/mL, S7:2762.5ng/mL, S8:11050ng/mL, S9:44200ng/mL, SlO: 176800ng/mL。悬浮芯片系统根据检测结果拟合兔抗土拉IgG剂量-反应标准曲线方程:FI = 0.287177+(8408.98-0.287177)/[1+(Conc/1173.81”.935296]
1.32583、悬浮芯片系统检测兔抗土拉IgG的灵敏度和动态范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本实用新型即蛋白悬浮芯片方法检测兔抗土拉IgG的灵敏度为:2.28ng/mL(Cutoff = 3.56,MFI (空白对照)=2.5，标准差=1.0606)。本实用新型定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着兔抗土拉IgG浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当兔抗土拉IgG浓度超过44200ng/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本实用新型即悬浮芯片定量检测兔抗土拉IgG的动态范围为2.69ng/mL 44200ng/mL。实施例6、人血清样品的检测1、人血清样品的准备将人血清用样品稀释液1: 10稀释(人血清样本5μ L加样品稀释液50μ L混匀)后用于蛋白悬浮芯片检测。2、人血清样品的检测I)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L待检测人血清样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化SPA，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中土拉抗体的浓度。经过多次重复试验，生物素化SPA稀释比例选用1: 2500稀释，SA-PE稀释比例选用1: 300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之和为作为判 断阴阳性的界值，即C utoff值为719.65，检测得到的MFI值如果大于719.65，即血清中的土拉浓度过高，可视为土拉抗体阳性可能被土拉菌感染，如果MFI值小于719.65,即血清中的土拉抗体浓度低正常值可判断为土拉抗体阴性，未感染土拉菌或隐性携带者。
权利要求1.一种检测血清样品中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，该芯片系统包括:芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，其中，芯片基体用于承载待测抗体及其内装有相关缓冲溶液，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球为028号编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，反应后的溶液吸入到微细管检测通道中，以使得每个编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的荧光信号，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。
2.如权利要求1所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述相关缓冲溶液包括用于所述待测抗体稀释的样品稀释液、稀释所述编码微球所用的微球稀释液、稀释所述生物素标记的二抗和/或SPA所用的抗体稀释液、每个反应之后洗涤编码微球所用的微球清洗液、SA-PE稀释液、检测缓冲液。
3.如权利要求2所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述捕获抗原优选为土拉fopA蛋白。
4.如权利要求2所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述待测抗体为血清样品。
5.如权利要求2所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述生物素标记的二抗和/或SPA优选为Biotin-羊抗兔和/或Biotin-SPA。
6.如权利要求2所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述荧光信号检测为链亲和素-藻红蛋白。
7.如权利要求1所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述芯片基体为96孔滤板或者微量尚心管。
8.如权利要求1所述蛋白悬浮芯片系统，其特征在于，所述检测激光包括用激发所述编码微球基质中的颜色、识别编码微球分类编码以确定检测项目的红色激光，用于激发待测分子的颜色信号、记录信号强弱以检测所述待测抗体的含量的绿色激光。
专利摘要本实用新型公开了一种检测血清样品中土拉抗体的蛋白悬浮芯片系统，包括芯片基体、加液系统、悬浮芯片检测仪和计算机，芯片基体内装有相关缓冲溶液和待测抗体，相关缓冲液中设置有编码微球，编码微球上包被有捕获抗原，加液系统依次向芯片基体中加入生物素标记的二抗和/或SPA、荧光信号检测物，悬浮芯片检测仪包括微细管检测通道和检测激光，编码微球依次通过微细管检测通道，检测激光激发并识别编码微球的颜色及其上待测物的颜色，计算机与悬浮芯片检测仪相连，并记录、分析悬浮芯片检测仪的测量结果。悬浮芯片技术利用微球在溶液中反应，利用激光检测技术，提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。
文档编号G01N33/546GK203133085SQ201020269929
公开日2013年8月14日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者王静, 杨宇, 杨永莉, 孙肖红, 张晓龙, 景滢滢 申请人:中国检验检疫科学研究院