专利名称：应用非粒子化学发光试剂的免疫分析的制作方法
应用非粒子化学发光试剂的免疫分析背景
本发明涉及能够产生信号的 试剂，其在用于测定样品中分析物的方法、组合物和试剂盒中应用。临床诊断领域在近年来已得到广泛扩展，关于可被容易和准确地测定的目的材料的种类以及用于所述测定的方法也得到扩展。大多数方法牵涉与样品中一种或多种分析物的存在和/或数量有关的信号的产生。发光化合物，如荧光化合物和化学发光化合物，由于它们发射光的能力在分析领域中具有广泛应用。粒子例如胶乳粒子、脂质体等已经被应用于分析中。已将吸收性染料和赋予荧光或化学发光性质的染料掺入粒子中。在一个特定方法中，使用包含一种或多种金属螯合物如例如镧系元素螯合物的粒子以产生信号。美国专利号5，340，716和6，251，581中描述了诱导发光免疫分析，其公开内容通过引用并入本文。在一个方法中，分析使用掺入光敏剂的粒子和掺入化学发光化合物的标记粒子。标记粒子与结合配偶体偶联，所述配偶体能够与分析物结合以形成复合物，或与其它部分结合以形成与分析物的存在有关的复合物。如果分析物存在，光敏剂和化学发光化合物会紧密接近。当两个标记紧密接近时，光敏剂产生单线态氧并激活化学发光化合物。被激活的化学发光化合物随后产生光。产生的光的数量与形成的复合物的数量相关，形成的复合物的数量进而与存在的分析物数量相关。在一个特定方法中，化学发光粒子包含一种或多种金属螯合物，如例如镧系元素螯合物。在诱导发光方法的一个变体中，应用粒子支持体，其包含(a)能够在照射后产生单线态氧的光敏剂，和(b)能够被单线态氧激活的化学发光化合物。该方法使得能够产生延迟发光，这可以在照射支持体后实现。该方法应用于测定怀疑含有分析物的介质中的分析物。一种方法包含对怀疑含有分析物的介质实施以下条件，在该条件下，结合配偶体的复合物有关分析物的存在而形成；和通过使用具有化学发光和光敏剂性质的粒子组合物作为标记来测定是否形成了复合物。在光敏剂性质激活后，单线态氧产生并激活化学发光性质。这样的组合物和方法描述在美国专利5，709，994号中，其相关公开内容通过引用并入本文。概沭
本发明的一个实施方案是用于测定在怀疑包含分析物的样品中分析物的存在和/或数量的化学发光试剂。该化学发光试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体以及包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。本发明的另一个实施方案是用于测定在怀疑包含分析物的样品中分析物的存在和/或数量的方法。提供了包含样品、如上所述的化学发光试剂和能够产生单线态氧的敏化剂试剂的联合物。对该联合物实施用于将分析物与对于分析物的结合配偶体结合的条件。敏化剂得以激活并且化学发光组合物产生的发光数量得以检测，其中发光数量与样品中分析物的数量相关。附图简述
图1是用于生产依照本发明实施方案的化学发光试剂的示意图描述。
图2是描绘使用依照本发明实施方案的化学发光试剂进行TSH分析的校准曲线的图。 图3是使用依照本发明实施方案的化学发光试剂进行TSH分析的结果的表格描述，并显示了在校准器之间获得的信号的分离。图4是描绘依照本发明实施方案的化学发光试剂的稳定性研究结果的图。图5是描绘依照本发明实施方案的化学发光试剂的稳定性研究结果的图。具体实施方案详述一般论沭
本发明方法和试剂的实施方案涉及化学发光试剂，其用于测定在怀疑含有分析物的样品中分析物的存在和/或数量。试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体以及包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。依照本发明实施方案的化学发光试剂在含水介质例如含水分析介质中显示良好的溶解性。非粒子学发光试剂具有增强的稳定性以用于检测分析物的分析中；此外，该试剂对分析物的浓度变化显示良好的信号反应。当应用于分析中时，按照本发明实施方案的非粒子化学发光试剂在含水分析介质中可溶并提供包括产生的信号的准确性和灵敏度以及稳定性的最大化性能。在医疗决策范围低端(low end)的具体分析形式的性能可以通过监测跨越目的分析物怀疑浓度范围的校准器所得到信号数量的差异进行监测。期望对于校准器如例如校准器Ll和校准器L2或校准器L2和校准器L3的信号之间有大的差异或分离。例如，可以使用6个校准器，其随意命名为L1-L6。信噪比可以通过测定使用不含分析物的校准器即随意命名的校准器Ll (背景)的信号数量和对于包含大于零的第一已知分析物数量的校准器即随意命名的校准器L2获得的信号数量来评估。这一评估也可包括测定使用校准器Ll的信号数量和对于包含大于零的第二已知分析物数量的校准器即随意命名的校准器L3的信号数量。这样的评估也可以包括使用校准器L4、L5、L6等的这种测定。本文所论述的实施方案在对分析物的分析中比不依据本发明实施方案的试剂提供更好的性能。期望校准器，例如对于校准器Ll和校准器L2、或校准器Ll和校准器L6的信号之间有大的差异。对于在医疗决策范围内良好的灵敏度，在校准器Ll和校准器L2之间测定的信号中的差异是至少大约50%、至少大约75%、至少大约90%、至少大约100%、至少大约 125%、至少大约150%、至少大约175%、至少大约200%、至少大约225%、至少大约250%、 至少大约275%、至少大约300%、至少大约325%、至少大约350%、至少大约375%、至少大约400 %、至少大约425 %等等。在某些实施方案中，对校准器L6检测的信号是对校准器Ll 检测的信号的至少大约10倍、至少大约20倍、至少大约30倍、至少大约40倍、至少大约50 倍、至少大约60倍、至少大约70倍、至少大约80倍、至少大约90倍、至少大约100倍。根据分析形式，信号中的差异可以是信号的增强或者信号的减弱。一般地，使用校准器的分析结果以图形式呈现，其中将信号的数量针对校准器的浓度绘图。按照本发明的实施方案，校准器Ll和校准器L2之间的线的斜率通常比用不按照本发明实施方案的分析试剂得到的结果陡。而且，从校准器Ll至校准器L6的线的斜率通常比用不按照本发明实施方案的分析试剂得到的结果陡。如上所述，本发明化学发光试剂的实施方案是非粒子的。如此地，将所述试剂与前面提到的利用粒子化学发光试剂的已知诱导发光分析中使用的那些试剂区分开。本发明化学发光试剂显示含水介质中的良好溶解性。在化学发光试剂的实施方案中，将对于分析物的结合配偶体共价或非共价地与包含烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物结合。
对于分析物的结合配偶体可以通过键与化学发光组合物共价结合。另一方面，对于分析物的结合配偶体可以通过连接基团与化学发光组合物共价结合。在某些实施方案中，连接基团是亲水的。术语“亲水的”或“亲水性”是指极性部分，并且因而优选极性分子和优选极性溶剂。亲水分子相比于疏水部分具有对其它亲水部分的亲和性。亲水性程度由连接基团中杂原子的数目来控制。在某些实施方案中，连接基团是高分子并且可以是聚合的。聚合高分子大致为大约1至大约10，000个单体单元或更长长度、或大约10至大约10，000个单体单元长度、 或大约100至大约10，000个单体单元长度、或大约500至大约10，000个单体单元长度、 或大约1,000至大约10，000个单体单元长度、或大约2，000至大约10，000个单体单元长度、或大约3，000至大约10，000个单体单元长度、或大约5，000至大约10，000个单体单元长度、或大约10至大约8，000个单体单元长度、或大约100至大约8，000个单体单元长度、或大约1，000至大约8，000个单体单元长度、或大约100至大约7，000个单体单元长度等。单体单元的数目取决于单体单元链中的原子数目、单体单元的组成等等。聚合高分子的分子量是至少大约2，000。分子量可以是大约2，000至大约 10，000，000或更高、或大约2，000至大约8，000，000、或大约2，000至大约6，000，000、 或大约2，000至大约5，000，000、或大约2，000至大约4，000，000、或大约2，000至大约3，000，000、或大约2，000至大约2，000，000、或大约2，000至大约1，000，000、或大约5，000至大约10，000，000或更高、或大约5，000至大约8，000，000、或大约5,000 至大约6，000，000、或大约5，000至大约5，000，000、或大约5，000至大约4，000，000、 或大约5，000至大约3，000，000、或大约5，000至大约2，000，000、或大约5，000至大约1，000，000、或大约10，000至大约10，000，000或更高、或大约10，000至大约 8，000，000、或大约10，000至大约6，000，000、或大约10，000至大约5，000，000或大约10，000至大约4，000，000、或大约10，000至大约3，000，000或大约10，000至大约 2，000，000、或大约 10，000 至大约 1,000，000 等。聚合高分子可以是线性的或者支化的或者它们的结合。线性聚合物包含线性原子链，以及支化聚合物包含支化原子链。线性链的每个原子可以有一个或多个取代基替代氢。 在某些实施方案中，聚合物可以是包含多于一种类型的单体单元的共聚物。聚合物中不同单体单元的关联可为交替的、随机的、周期性的等，以及也可以是其中重复单体单元的嵌段形成聚合物链的嵌段共聚物排列。在某些实施方案中，聚合高分子的单体单元中的一个或多个包含碳原子、和一个或多个杂原子，如例如氧、硫、氮、磷等。单体单元可以包含大约2至大约50个原子或更多、或5至大约50个原子、或大约10至大约50个原子、或大约20至大约50个原子、或大约30至大约50个原子、或大约2至大约40个原子或更多、或5至大约40个原子、或大约10至大约40个原子、或大约20至大约40个原子、或大约30至大约40个原子、或大约2至大约30个原子或更多、或5至大约30个原子、或大约10至大约30个原子、或大约20至大约30个原子，不计数氢；并且可以包含2至大约30个原子、或大约5至大约 30个原子或更多、或10至大约30个原子、或大约15至大约30个原子、或大约20至大约30个原子、或大约2至大约25个原子或更多、或5至大约25个原子、或大约10至大约25个原子、或大约15至大约25个原子、或大约20至大约25个原子、或大约2至大约20个原子或更多、或5至大约20个原子、或大约10至大约20个原子、或大约15至大约20个原子、或大约2至大约15个原子、或大约5至大约15个原子、或大约10至大约 15个原子的链，每一原子独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷构成的集合。聚合高分子的单体单元中杂原子的数目可以是从大约0至大约20、或大约0至大约15、或大约0至大约10、或大约0至大约5、或大约1至大约20、或大约1至大约 15、或大约1至大约10、或大约1至大约5、或大约2至大约20、或大约2至大约15、 或大约2至大约10、或大约2至大约5、或大约5至大约20、或大约5至大约15、或大约5至大约10等的范围。在某些实施方案中，杂原子数目足以使连接基团亲水并增强按照本发明实施方案的化学发光试剂的溶解性。就这点而言，聚合高分子的单体单元中的杂原子数目可以是从大约1至大约20、或大约1至大约15、或大约1至大约10、或大约1 至大约5、或大约2至大约20、或大约2至大约15、或大约2至大约10、或大约2至大约5、或大约5至大约20、或大约5至大约15、或大约5至大约10等的范围。当杂原子存在时，氧一般作为氧代或氧基存在，与碳、硫、氮或磷结合；氮一般作为偶氮、氰基、异氰基、硝基，亚硝基，酰氨基或氨基存在，一般与碳、氧、硫或磷结合；硫类似于氧；而磷通常作为膦酸酯和磷酸一酯或二酯与碳、硫、氧或氮结合。在连接基团和待偶联分子之间形成共价键中的一般官能度是烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮、硫醚以及羧酸酯、硫酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。多半，当连接基团具有连接官能度(用于与部分反应的官能度)如例如，包括氮和硫类似物的非氧代羰基基团、磷酸酯基团、氨基基团、烷化剂例如商代或甲苯磺酰烷基、氧基(羟基或硫类似物，巯基)、氧代羰基(例如醛或酮)、或活性烯烃例如乙烯砜、或α -，β-不饱和酯时，这些官能度与胺基、羧基基团、活性烯烃、烷基剂例如溴乙酰基结合。在胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸衍生物连接的情况下，分别形成酰胺、脒和磷酰胺。在硫醇和活性烯烃连接的情况下形成硫醚。在硫醇和烷化剂连接的情况下形成硫醚。在醛和胺在还原条件下连接的情况下形成烷基胺。在酮或醛和羟胺(包括羟基中的氢被取代基替代的其衍生物)连接的情况下形成肟官能度(=N-O-)。在羧酸或磷酸和醇连接的情况下形成酯。在某些实施方案中，连接基团不是高分子，并具有小于大约2000、或者小于大约 1500、或者小于大约1000、或者小于大约500等的分子量。这类连接基团可以包含大约2到大约200个原子、或者4到大约150个原子、或者大约5到大约100个原子，不计数氢原子； 并且可以包含2到大约100个原子、或者3到大约90个原子、或者大约4到大约80个原子、 或者大约5到大约70个原子等的链，每一原子独立选自一般由碳、氧、硫、氮和磷组成的集合。这类连接基团中杂原子的数目取决于连接基团的大小，并且一般是大约0到大约50、1 到大约45或者大约2到大约40的范围。杂原子可以是上文关于高分子连接基团的论述中指出的形式。在某些实施方案中，杂原子的数目足以使连接基团亲水，并增强根据本发明实施方案得到的组合物的溶解性。在这点上，连接基团中杂原子的数目取决于连接基团的大小，并且可以是大约5到大约50、或大约10到大约50、或大约15到大约50、或大约5到大约40、或大约10到大约40、或大约15到大约40、或大约5到大约30、或大约10到大约30、 或大约15到大约30、或大约5到大约25、或大约10到大约25等的范围。
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作为连接基团的聚合高分子可以是天然发生的材料或者合成构建体。在某些实施方案中，聚合高分子连接基团是多肽。举例说明但非限制地，多肽的例子包括蛋白质，例如白蛋白、Y-球蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白、合成多肽等。举例说明但非限制地，其它聚合高分子的例子包括树枝状大分子、聚合羧酸酯(例如聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚半乳糖醛酸、 聚甲基丙烯酸等)、聚合胺(例如聚乙烯胺、聚赖氨酸、聚谷氨酰胺、聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺等)、聚合醚(聚乙二醇或聚环氧乙烷等)、聚合硫醚(例如聚乙烯硫醚等)、聚合巯基(例如聚半胱氨酸)等等。对于分析物的结合配偶体可以以多种不同的方式与化学发光组合物结合，其中的某些方式在下面以举例说明但非限制的方式进行论述。在某些实施方式中，连接基团是蛋白质，并且化学发光组合物的成分即烯烃化合物和金属螯合物各自结合于该蛋白质，对于分析物的结合配偶体也与该蛋白质结合。这一实施方案阐述如下
权利要求
1.化学发光试剂，其用于测定怀疑含有分析物的样品中所述分析物的存在和/或数量，所述试剂是非粒子的、并且包含对于所述分析物的结合配偶体和化学发光组合物，所述化学发光组合物包含烯烃化合物和金属螯合物。
2.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过键或连接基团与所述化学发光组合物共价结合。
3.根据权利要求2的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过连接基团与所述化学发光组合物共价结合，并且其中所述连接基团包含亲水性高分子。
4.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体共价结合的所述连接基团的同一分子连接。
5.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体共价结合的所述连接基团的分开分子连接，并且其中所述连接基团可以是相同的或不同的。
6.根据权利要求3的化学发光试剂，其中所述亲水性高分子选自多肽、树枝状大分子、 聚羧酸酯、聚胺、聚巯基和聚乙二醇。
7.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过键或连接基团与所述化学发光组合物连接。
8.根据权利要求7的化学发光试剂，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过连接基团与所述化学发光组合物连接，其中所述连接基团是蛋白质。
9.根据权利要求8的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体非共价结合的所述连接基团的同一分子连接。
10.根据权利要求8的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物和所述金属螯合物与所述对于分析物的结合配偶体非共价结合的所述连接基团的分开分子连接，并且其中所述连接基团可以是相同的或不同的。
11.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述亲水性高分子是蛋白质。
12.根据权利要求7的化学发光试剂，其中所述特异性结合对选自(i)小分子和对于所述小分子的结合配偶体，以及(ii)大分子和对于所述大分子的结合配偶体。
13.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII 族金属。
14.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属选自铕、铽、镝、钐、锇和钌。
15.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂 NHA、BHHT、BHHCT、DPP、TTA、NPPTA、NTA、TOPO、TPPO、BFTA、2, 2- 二甲基-4-全氟丁酰-3- 丁酮(fod)、2，2’ -联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。
16.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述烯烃化合物选自二甲基噻吩、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9，10 二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物。
17.根据权利要求1的化学发光试剂，其中所述金属是铕，所述螯合剂是BHHCT，并且所述烯烃化合物是二甲基噻吩的羧基衍生物。
18.用于测定怀疑含有分析物的样品中所述分析物的存在和/或数量的方法，所述方法包括(a)在介质中以联合物方式提供⑴样品，( )化学发光试剂，所述试剂是非粒子的、并且包含与化学发光组合物连接的对于分析物的结合配偶体，所述化学发光组合物包含金属螯合物和烯烃化合物，和(iii)能够产生单线态氧的敏化剂试剂，(b)对所述联合物实施用于使所述分析物与对于所述分析物的特异性结合对成员结合的条件，以及(c)激活所述敏化剂并检测由所述化学发光组合物产生的发光的数量，所述发光的数量与所述样品中所述分析物的数量有关。
19.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体通过连接基团与所述化学发光组合物共价结合，并且其中所述连接基团包含亲水性高分子。
20.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体通过特异性结合对与所述化学发光组合物非共价结合，其中所述特异性结合对的一个成员与所述对于分析物的结合配偶体连接，并且所述特异性结合对的另一个成员通过连接基团与所述化学发光组合物连接，其中所述连接基团包含亲水性高分子。
21.根据权利要求18的方法，其中所述对于分析物的结合配偶体与所述敏化剂试剂相关联并且所述敏化剂试剂包含粒子。
全文摘要
本发明公开了用于进行分析的方法和试剂。本发明方法和试剂的实施方案涉及用于测定怀疑含有分析物的样品中分析物的存在和/或数量的化学发光试剂。该试剂是非粒子的，并且包含对于分析物的结合配偶体和含有烯烃化合物和金属螯合物的化学发光组合物。在分析的实施方案中，提供了包含怀疑含有分析物的样品、如上所述的化学发光试剂以及能够产生单线态氧的敏化剂试剂的联合物。对该联合物实施用于使分析物与对于分析物的结合配偶体结合的条件。敏化剂被激活并且化学发光组合物产生的荧光的数量被检测，其中所述发光的数量与样品中分析物的数量有关。
文档编号G01N33/50GK102348980SQ201080010999
公开日2012年2月8日 申请日期2010年2月25日 优先权日2009年3月12日
发明者谢尔普 C., 辛赫 P., 延岑 R., 耿利萍, 郑一枫 申请人:西门子医疗保健诊断公司