专利名称：串行线扫描编码多色荧光显微术及成像流式细胞仪的制作方法
技术领域：
本申请要求于2009年3月20日提交的美国临时专利申请No. 61/162，072和于 2009年8月7日提交的美国临时专利申请No. 61/232，113的优先权，所述两个临时专利申请的公开内容通过引用并入本文中。
背景技术：
细胞仪是关于生物细胞的计数和特征化的一门技术专业。图1示出了一种被称为流式细胞仪的技术的简图。在流式细胞仪的基本形式中，细胞101悬浮在流体中并以一列纵队的方式在一个狭窄的透明管子102内输送。该输送可以通过几种包括流体力学聚焦的方法中的任一种实现。当细胞101通过测量位置104时光源103照射每一个细胞101。光源103可以为例如激光器。来自光源103的光由被测细胞101散射。一些光105在行进到达细胞101时通常沿同一方向散射。光105有时被称作“前向散射”，可以被前向传感器106 收集。一些光也可以沿着其它方向散射。该光被称为“侧向散射”，侧向散射的光107中的一些可以被一个或多个其它的传感器108收集。传感器106和传感器108的输出信号被发送到计算机109，计算机109可以存储并分析这些信号。通过分析散射光的量和分布，可以辨识每一个细胞的信息，例如细胞的大小和关于其内部结构的一些信息。流式细胞仪可以直接测量散射光，或者可以利用荧光。在荧光细胞仪中，细胞可以以一种或多种荧光团进行标记，荧光团被来自光源103的光激发从而通过荧光性产生光。图1示出的技术完全依赖散射光的测量来推断细胞结构的信息，但不产生任何特定细胞的图像。在另一种称为“图像细胞仪”的技术中，单个细胞的图像可以被相机或显微镜记录。
发明内容
一种改进的图像细胞仪系统使用线性光传感器执行高速、高分辨率的细胞仪功能。在一些实施例中，来自光源的光被集中到一个椭圆形的扫描区域，照射被输送通过扫描区域的细胞。光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到线性光传感器上。系统重复读取落在线性传感器上的光。系统可以包括位于线性光传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。在一些实施例中，来自光源的光照射被输送通过扫描区域的细胞。光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到至少两个平行的线性光传感器上。系统重复读取落在线性光传感器上的光。系统可以包括位于线性光传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。在一些实施例中，各线性光传感器采集的图像被组合以形成与通过单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。所述组合可以通过将各图像的对应于细胞上基本相同的各位置的像素值进行数字化组合来执行。所述组合可以通过时间延迟积分来执行。在一些实施例中，来自光源的光被集中到扫描区域的一个椭圆形场上。在另一个实施例中，用于执行细胞仪功能的系统包括被包括至少第一波长带和第二波长带的光照射的扫描区域；以及用于将细胞输送通过扫描区域使得细胞被照射的装置。所述系统还包括光学系统和第一组和第二组线性光传感器，每组线性光传感器包括至少一个线性光传感器。所述光学系统将从细胞发射的光选择性地导向两个线性光传感器组，使得在第三波长带的发射光主要导向第一线性光传感器组，而在第四波长带的发射光主要导向第二线性光传感器组。当细胞被输送通过扫描区域时系统重复读取落在线性传感器上的光。每一线性光传感器组可以包括至少两个线性光传感器。可以由于荧光辐射而发射出所述发射光。所述系统可以包括用于接收和重导向(redirect)从细胞发射的光的物镜；以及用于将重导向光的第一部分反射到第一线性光传感器组并透射重导向光的第二部分的镜子。系统可以包括第一镜筒透镜，第一镜筒透镜接收光的第一部分并与物镜配合在第一线性光传感器组上形成细胞的图像。在一些实施例中，系统还可以包括第二镜筒透镜， 第二镜筒透镜接收光的第二部分并与物镜配合在第二线性光传感器组上形成细胞的图像。 系统可以包括位于线性光传感器组中至少一组的附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。在一些实施例中，每一组线性光传感器包括至少两个线性光传感器，并且对于每一组线性光传感器，组中的各线性光传感器采集的图像被组合以形成与通过组中的单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。所述组合可以通过将对应于细胞上基本相同的各位置的各图像的像素值进行数字化组合来执行。所述组合可以通过时间延迟积分来执行。在另一个实施例中，用于执行细胞仪功能的系统包括被包括至少第一波长带和第二波长带的光照射的扫描区域；以及用于将细胞输送通过扫描区域使得细胞被照射的装置。所述系统还包括光学系统以及包括至少一个线性光传感器的线性光传感器组。所述光学系统将从细胞发射的光选择性地导向线性光传感器组的两个部分，使得在第三波长带的发射光主要导向线性光传感器组的第一部分而在第四波长带的发射光主要导向线性光传感器组的第二部分。所述系统在细胞被输送通过扫描区域时，重复读取落在线性光传感器组上的光。所述线性光传感器组可以包括至少两个线性光传感器。可以由于荧光辐射而发射出所述发射光。所述系统可以包括位于线性光传感器组附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。在一些实施例中，线性光传感器组包括至少两个线性光传感器，并且组中的各线性光传感器采集的图像被组合以形成与通过组中的单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。所述组合可以通过将对应于细胞上基本相同的各位置的各图像的像素值进行数字化组合来执行。所述组合可以通过时间延迟积分来执行。在另一个实施例中，用于执行细胞仪功能的系统包括被光源照射的扫描区域； 包括至少一个线性光传感器的线性光传感器组；以及将扫描区域的一部分的图像聚焦到线性光传感器组的光学系统。所述系统当细胞被输送通过扫描区域并被光源照射时，重复读取落在线性光传感器组上的光。在本实施例中，所述系统是可配置的，以使得在第一实验中创建第一图像，所述第一图像在对应于线性光传感器组的长度的方向(dimention)上具有第一数量的像素；以及在第二实验中创建第二图像，所述第二图像在对应于线性光传感器组的长度的方向上具有第二数量的像素，第二数量的像素少于第一数量的像素。所述线性光传感器组可以包括至少两个线性光传感器。可以通过选取少于来自线性光传感器组的全部像素的像素来降低第二图像中的像素的数量。可以通过对来自线性光传感器组的部分或全部的像素进行重新分级来降低第二图像中的像素的数量。对落在线性光传感器中的特
7定一个上的光的每一次读取可以产生单个落在所述特定传感器上的光的量的数字表示。在另一个实施例中，用于产生椭圆形照射场的系统包括产生光束的激光器；接收所述光束并使光束仅沿着第一轴线会聚的柱面透镜；以及接收柱面透镜之后的光束的物镜。物镜是无限远校正光学系统的一部分，其引起光束沿着与第一轴线正交的第二轴线会聚。所述系统可以包括在柱面透镜和物镜之间的波长选择镜。在一些实施例中，物镜与柱面透镜间隔小于柱面透镜的焦距的距离。在一些实施例中，物镜与柱面透镜间隔大于柱面透镜的焦距的距离。在一些实施例中，光束在离开物镜后在第一轴线方向上是发散的。在一些实施例中，光束在离开物镜后在第一轴线方向上是会聚的。在另一个实施例中，用于执行细胞仪功能的方法包括使用光源照射扫描区域的一个椭圆形场，其中照射所述椭圆形场还包括使用光成形元件将来自光源的光集中到椭圆形场。所述方法还包括使用光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到线性光传感器，以及当细胞被输送通过扫描区域并被光源照射时重复读取落在线性传感器上的光。在一些实施例中，所述方法还包括使落在线性光传感器上的光通过位于线性光传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。在另一个实施例中，用于执行细胞仪功能的方法包括使用光源照射扫描区域； 以及使用光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到至少两个平行的线性光传感器上。该实施例的方法还包括当细胞被输送通过扫描区域并被光源照射时重复读取落在所述两个平行的光传感器上的光。在一些实施例中，所述方法还包括将各线性光传感器采集的图像进行组合以形成与单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。将各图像进行组合还包括将对应于细胞上基本相同的各位置的各图像的像素值进行数字化组合。将各图像进行组合还包括使用时间延迟积分来组合图像。在一些实施例中，光源产生包括至少第一和第二波长带的光的照射，并且所述方法还包括使用光学系统将从细胞发射的在第三波长带的光主要导向两个平行的光传感器中的一个，以及使用光学系统将从细胞发射的在第四波长带的光主要导向两个平行的线性光传感器中的另一个。在一些实施例中，所述方法还包括使用光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到至少两组平行的线性光传感器上，每一组线性光传感器包括至少两个线性光传感器。
图1示出了一种被称为流式细胞仪的技术的简图。图2示出了根据本实施例的高速、高分辨率线扫描图像细胞仪系统的简化概念图；图3A至图3C示出了图像的形成过程。图4示出了根据本发明的另一实施例的系统的正交视图。图5示出了根据本发明的另一实施例的系统的正交视图。图6示出了根据本发明的另一实施例的系统的正交视图。图7示出了根据本发明的又一实施例的系统的正交视图。图8示出了根据另一实施例的系统的正交视图。以及图9A至图9C示出了用于产生椭圆形照射场的系统的实施例。
具体实施例方式图2示出了根据实施例的高速、高分辨率线扫描图像细胞仪系统200的简化概念图。图2所示的系统是一个流式细胞仪系统，然而本领域的普通技术人员将会认识到本发明的实施例也可以应用于其它类型的细胞仪。细胞101在流体中输送并以一列纵队的方式行进通过管子102。所述系统可以用于特征化不同类型的细胞，但在通常的应用中，细胞101可以例如为大约10微米至20微米宽，并且可以以例如每秒10毫米的速度行进通过管子102。光源201提供管子102上的光场203。光源201可以是激光器、发光二极管、白炽灯光源、荧光光源或其它类型的光源。 光源201可以产生基本上单色的光、宽频谱的光或包括两个或更多个窄带波长的光。可选的光成形元件202可以包括各种透镜、棱镜、反射镜或其它可选的光学元件，以将来自光源 201的光集中到椭圆形或狭缝形的场203，细胞101被输送通过该椭圆形或狭缝形的场203。 如下面所描述地，因为仅扫描狭窄的线图像，所以仅需要照射狭窄的场，这不同于传统的需要照射整个物镜视场的落射照射(印i-illumination)。光成形元件202所提供的集中可使得有效照射水平比通常的对称落射照射增加2至6个量级之多。来自光源201的一些光被传输通过其中一个细胞101或被该细胞散射，该细胞101 的至少一部分在场203内。所述光的一部分被一个或更多个透镜204重导向到线性传感器205。线性传感器205可以例如是电荷耦合器件(CCD)传感器、互补金属氧化物半导体 (CMOS)传感器或其他类型的具有以行设置的多个光敏位点(site)的传感器。透镜204和传感器205可以例如是线扫描相机的部件，所述线扫描相机例如为来自于德国阿伦斯堡的巴勒斯公司的巴斯勒斯普林特线扫描互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器相机。传感器位点有时被称为“像素”。在扫描线处的被传感器像素感测的相应的位点有时也被称为像素。 传感器205可以包括例如一行或多行像素，每一行包括512个、1024个、2048个或其他合适数量的像素。可以通过如下方式读取落在像素行上的光的强度清除像素阵列；使在预定的曝光时间内在像素位点中累积电荷；然后将累积的电荷量转换为表示光强度的数值。当细胞通过扫描区域时，重复执行上述过程。在一个示例性实施例中，所述系统每20微秒执行一次读取(“扫描一条线”)或者说是以50kHZ的扫描速度执行读取。使用每秒10毫米的细胞输送速度和50kHZ的扫描速度可产生200nm的成像像素尺寸。也可以是其它的输送速度和扫描速度，并且可以产生其它的成像像素尺寸。得到的测量阵列可被重组成细胞的近似图像。图3A至图3C描述了图像的形成过程。在图3A中，扫描线301包括像素a、b、c、 d和e。细胞101被输送通过扫描线301，如图:3B所示，其示出了在连续的采样时间T1-T7 处叠加在细胞101上的扫描线301。(尽管图:3B示出了细胞恰好以每采样时间穿过一个像素，但这并不是必须的，事实上上述仅针对细胞行进速度、采样率和像素大小的特定组合才会发生。实际上，连续的扫描线可以在成像细胞上重叠，或在连续的扫描线读取的细胞的区域之间可以存在间隙。)像素a、b、c、d和e读取的光水平会受到细胞101的结构的影响。 例如，当没有细胞通过扫描线301时，相对高的光水平被记录。当细胞101的相对透明的部分通过像素时，该像素记录的光水平有所下降。当细胞101的核在像素内时，在该像素处记录的光水平会明显下降。图3C示出了根据时间的在像素a、b、c处记录的光水平的轨迹 (范围从0到1的任意标度)。图3D示出了重构图像，其通过将数次连续线扫描期间扫描
9的数据堆叠在一起并以印刷灰度水平表示每次的数字光读数而形成。尽管图3D使用了仅少数次采样的少量像素构成，并因此示出了对细胞101的相对粗糙的描绘，然而在实际中根据本发明的实施例的系统，可以在每个细胞通过期间扫描更多或更少的线，并且每条线可以包括比图示更多或更少的像素。在一个实施例中，系统可以在每个细胞通过期间扫描大约50条的线，而且每条线可以包括大约50个像素。每个细胞的扫描的线和受影响的像素的确切数量取决于细胞的大小、扫描线频率、细胞通过扫描线的速度和所使用的特定传感器和光学元件。系统的理论分辨率主要取决于物镜的品质。系统的实际扫描分辨率还取决于扫描速度、细胞被输送通过扫描线的速度和所使用的特定传感器和光学系统。在Y方向的像素分辨率由包括所使用的特定透镜和传感器的成像系统确定。在X方向的像素分辨率等于 V · dt，其中V是样品传输速度，dt是相机的曝光时间。优选的，V是一个已知的参数，或者在特定的流式实验之前被预先确定，或者在细胞通过系统的过程中测量到。理想地，被扫描的细胞在通过扫描线期间是无旋转和无抖动的。上述在直接光成像的背景下对图2中的系统的操作进行了描述，其中来自光源 201的散射光被传感器205测量。基于相同的原理操作的系统还可用于执行荧光成像，事实上，该系统在荧光成像中特别有用。在该情形下，来自光源201的光激发所测细胞101中的荧光，得到的发射光被传感器205收集和测量。上述发射光的波长通常比来自光源201的激发光的波长长。在荧光成像中，理想的是使用各种滤光器或元件的几何排列，保护传感器205不接收来自光源201的光，使得光源光不淹没或干扰荧光发射的光的测量。通常，荧光发射的光比光源光的强度小，与直接成像相比，荧光成像需要更长的曝光时间、更强的照射或者更敏感的传感器。图3C中所示的瞬时信号变化的形状在荧光成像中与直接成像中是不同的。在直接成像中，细胞的附加结构趋向于引起传感器205的相应像素接收较少的光。在荧光成像中，附加的结构可承载额外的荧光团，与对应于具有小结构的细胞部分的像素相比，可引起更多的光到达相应的传感器像素。图4示出了根据本发明的另一个实施例的系统400的正交视图。图4所示的实施例特别适合于单色荧光成像细胞仪。在图4示出的实施例中，光源401发射光。光源401 可以是激光器、发光二极管、白炽灯光源、荧光光源或其他类型的光源。光源401可以产生基本上单色的光、宽频谱光或者包括两个或更多个窄带波长的光。在一个示例性的实施例中，光源401是发射标称波长为488nm的光的激光器。激发滤光器402可以用来进一步缩窄系统所使用的光的波长带，特别是在光源401是宽频谱光，或者另外地产生对特定的细胞仪实验来说不理想的波长的情况下。可选的光成形元件或聚光透镜403可以将发射的光集中到细胞101被输送通过的扫描区域404。优选的，细胞101已使用在被光源401发射的光激发时发射出荧光的一种或多种荧光团进行了标记。已知有各种不同的荧光团，包括来自美国加利福尼亚州的卡尔巴斯德生命科技协会的ALEX FLOUR 系列的荧光团。光成形元件或聚光透镜403提供的集中提高了细胞101的有效照射，并产生了较强的荧光信号。所述较强的信号导致系统使用的传感器在曝光时间上的较少的限制。椭圆形或狭缝形照射场特别适合于具有自然非对称照射模式的光源，例如半导体激光器或发光二极管。从细胞101散射的光被物镜405收集和重导向，并从分色镜406反射，通过镜筒透镜408到达线扫描相机409，在线扫描相机409处扫描区域404的连续线图像被收集以用于处理单元410的分析。可以在所述系统中放置发射滤光器407用于缩窄传输到相机409 的光的波长带。分色镜406也可以提供滤光。该滤光可以降低来自光源401的可能被细胞 101散射的直射光的影响。物镜405和镜筒透镜408优选地形成无限远校正光学系统，使得在物镜405和镜筒透镜408之间形成“无限空间”。在这样一个系统中(现有技术已知)， 系统的性能对物镜和镜筒透镜之间的距离相对不敏感，从而允许为诸如分色镜406和发射滤光器407的其它元件的插入留下空间。图5示出了根据本发明的另一个实施例的系统500的正交视图。图5所示的系统被配置成用于执行同时双色荧光成像细胞仪。在图5所示的系统中，向待成像的细胞101 提供包括两个波长带的激发光。这在图5中表示为产生两种不同波长的光的两个光源501， 它们分别用实线和虚线表示。所述光可以被一个或更多个滤光器502进一步约束。其它布置方式也是可以的。例如，可以使用单个宽频谱光源，优选地，通过滤光器502选择特定波长带。或者，可以使用单光源来激发两种不同荧光波长的光。在一个优选的实施例中，光源 501包括两个激光器，一个产生标称波长为532nm的第一窄带光而另一个产生标称波长为 633nm的第二窄带光。所述光可以通过光成形元件或聚光透镜503集中到扫描区域504。元件503可以包括各种单独的或组合在一起的透镜、棱镜、反射镜或者其它的光学元件，并优选地将光源501产生的光集中到扫描区域504的椭圆形场。优选的，细胞101被一种或多种荧光团进行标记，使得当来自光源501的激发光到达细胞101时，通过荧光产生至少两种不同颜色特性的光。例如，一种荧光团可以强烈地对532nm的激发光起反应，产生发射峰值在大约550nm的发射光，第二种荧光团强烈地对 633nm的激发光起反应，产生发射峰值在大约650nm的发射光。在图5中，以与表示双色激发光相似的方式用实线和虚线分别近似地表示不同的发射，但是要理解的是由特定线类型表示的光在发射之后通常不具有与相同线类型所表示的激发光相同的频谱特性。然后来自扫描区域504的光被物镜505收集，并导向分色镜506。分色镜506提供一定的滤光，使得主要来自某个波长带的光被分色镜506反射，而其余的光则通过分色镜 506。从分色镜506反射的光可以通过另一个发射滤光器507从而进一步限制光的频谱特性，然后光通过镜筒透镜508到达相机509。因此，相机509优选地接收细胞101中第一荧光团标记物发射的光，所述光具有来自光源510或者第二荧光团标记物发射的光的较少的污染。即，到达相机509的光优选地落入从第一荧光团的荧光发射中选择的第三波长带。通过分色镜506的光然后被另一个分色镜510反射，可以通过另一个分色发射滤光器511，通过第二镜筒透镜512到达相机513。因此，相机509优选地接收细胞101中第二荧光团标记物发射的光，所述光具有来自光源510或者第一荧光团标记物发射的光的较少的污染。即，到达相机513的光优选地落入从第二荧光团的荧光发射中选择的第四波长
市ο相机509和513可以扫描细胞101的不同发射频谱的同时图像。相机509和513 的输出结果被传送到处理单元514用于存储、分析、显示或其它目的。处理单元514可以例如是计算机系统或其它的能够处理图像数据的基于处理器的系统。处理单元514可以是外部独立设备，或者集成到测试仪器中。所述系统可以进行多种变化。例如，可以去除分色镜510，滤光器511、镜筒透镜 512和相机513可以定位成直接接收通过分色镜506的光。系统中的一些滤光器取决于所使用的特定光源和荧光物质是可选的。可以增加另外组的光源、滤光器、镜子、透镜或相机以使得同时完成3个、4个或甚至更多个频谱带的成像。本领域的普通技术人员会意识到到目前为止已描述的分色镜和滤光器不具有理想的波长鉴别或理想的效率。在一定波长带的、意在通过特定的滤光器的一些光可能会被吸收或反射。在一定波长带的、意在被特定的滤光器阻止的一些光可能会通过或会被反射。 然而，滤光器和镜子可以执行得足够好以优选地使指定的波长通过或阻止指定的波长，使得所述系统可以有效鉴别不同的发射光颜色。在其它的变化中，可以使用除了分色镜之外的元件用于分色，包括棱镜、光栅或其它光学元件。图6示出了根据本发明的另一个实施例的系统600的正交视图。系统600与系统 500相似，除了在相机509和513前面分别设置了狭缝孔601和602之外。狭缝孔601和602 具有倾向于阻止或排除从所述系统的焦平面之外其它位置收集的光到达各相机的效果。所述效果在图6中通过从细胞101之上的未对准焦点的位置发出的细虚线射线束603表示。 因而得到从透镜508出来的射线束604与来自于系统的焦平面的光相比更靠近透镜508而聚焦。当射线束604中的光到达狭缝孔601时，射束604已开始发散，使得射线束604的中心的一小部分可以通过狭缝孔601到达相机509。因此，所述系统优选地接收来自系统的焦平面的细胞101的光，并至少排除接收的来自其它更远位置一些光。当在上述方式中使用小的圆形孔来限制单个传感器接收的光时，这种技术被称为共焦成像。在图6所示的系统中，孔601和602为狭缝，因此排除仅在一个轴线方向上的光。 出于本公开的目的，上述技术被称为“半共焦”成像。与没有使用半共焦成像的系统记录的图像相比，这种技术提高了上述系统所记录的图像的对比度。实施本发明的细胞仪系统的另一个优点是所述系统可被修改成或配置成一个点检测器类型的系统，其中，只有位于线性检测器的中间的少量像素起作用，或者像素行中的部分或所有像素被重新分级(binning)成一个像素或几个像素。这导致在对应于线性光传感器的长度的方向上(图6中的Y方向)分辨率下降的图像。例如如果所有的传感器像素被重新分级，光传感器的每次曝光甚至可以导致落在传感器上的光的量的单个数字表示。 可选地，照射场可被成形为一个较小的圆或椭圆，以提高系统在该方式下操作的速度。这种系统的优点是可以生成细胞的非常高速的单个横截面图像。当电子通信带宽有限但可获得充足照度时，这种系统会特别有用。可以上述方式配置的系统既可应用于线扫描成像细胞仪又可以用于非成像流式细胞仪。图7示出了根据本发明的又一个实施例的系统700的正交视图。在图7所示的系统中，可以通过仅使用一个线性光传感器或线扫描相机实现同时双色荧光成像细胞仪。系统700的照射系统可以是例如上述参照图5中所示系统500而描述的照射系统中的任一个。即，一个或多个光源激发两种不同的荧光频谱，例如来自于细胞101中的两种不同荧光团的荧光频谱。细胞101中的荧光所发射的光中的一部分被物镜505收集并重导向到分色镜701。图7中的实线和虚线表示包括两种不同荧光频谱的光到达分色镜701。镜子702 选择性地对这些光进行滤光，以使得一种波长带优选地被镜子701反射，而其它的波长优选地通过分色镜701并继续朝向镜子702。视需要可以在光学系统中放置附加的镜子和滤光器，以导向和约束光。例如，镜子703将来自镜子702的光重导向至镜筒透镜705，同时镜子703还可以提供附加的滤光。相似的，镜子704将来自镜子701的光重导向至镜筒透镜705，同时镜子704还可提供滤光。可以在光路上放置一个或多个附加滤光器，例如发射滤光器707和708。镜筒透镜705将所述光重聚焦到线性光传感器706上，该线性光传感器可以是线扫描相机的一部分，并且可以被处理单元514读取。镜子的布置方式提供到达传感器706的两个波长带的光之间的几何偏移，使得传感器706的一部分接收一个波长带的光，所述光选自以其中一个荧光频谱发射的光，而传感器706的另一部分接收另一个波长带的光，所述光选自另一个荧光频谱发射的光。例如， 如果传感器706包括以行布置的512个像素，那么在前的大约256个像素可以接收一个波长带的光，而剩余的大约256个像素可以接收另一个波长带的光。如上所述，处理单元514 接收来自传感器706的重复线扫描，并且可以重构细胞101的两个图像，一个图像对应于一个波长带。这样的系统仅需要一个线性光传感器或线扫描相机，与具有两个线性光传感器或线扫描相机的系统相比，该系统可以以降低的成本来构造。也可以使用其它类型的光学系统将两个波长带的光导向到线性光传感器的不同部分。例如，这样的光学系统可以包括光栅。在诸如系统700的系统中也可以包括狭缝孔，以使系统执行半共焦成像。图8示出了根据又一个实施例的系统800的正交视图。系统800以图4中所示的系统400的变型示出，但本领域的普通技术人员会认识到系统800的附加特征可以应用于其它系统，包括实现多色成像、荧光成像或其它技术的系统。系统800应用了一个示例性的相机801，相机801包括三个相互平行成行的、紧密间隔开的传感器802、803、804(传感器行示出在图8的端部)。根据系统的光学元件的操作，传感器行中的每一个传感器对细胞101上的不同“带条”成像。当细胞101通过扫描区域404时，相机801有三次不同的机会来对细胞101的任何特定部分成像。即，细胞101的特定部分首先将成像到传感器行802上。细胞101的相同部分将在稍后的时间成像到传感器行803上，并在更后一段时间成像到传感器行804上。在图8中，只示出了连接细胞101 和传感器行802、803、804的中心射线束，以避免不必要的细节使系统的操作模糊。在一种技术中，可以采集细胞101的三个不同的图像，每一个图像分别由传感器行802、803、804中的一个产生。不同的图像相对于彼此在时间上是偏移的，或者可以认为在空间的X方向上是偏移的。这些多个图像可用来创建具有改进的信噪比特性的合成图像。例如，如果将所述三个图像数字化地偏移至对齐，并将来自对应于细胞101上的基本相同位置的三个图像的像素值叠加，这样产生的合成图像与任何单个图像相比具有提高大约 VJ倍的噪信比。尽管相机被示出有三条扫描线，但相机可以有2条、4条或任一个可用数字 η条扫描线。通过这种数字叠加或平均技术从具有η条扫描线的相机产生的合成图像与单个图像相比具有提高大约^倍的信噪比。在扫描图像线可用的情况下可以“快速(on the fly)”地完成图像组合，使得单个线性传感器构建不成特定细胞的完整的图像。可以附加地或替换地配置具有多行像素的相机801，以执行时间延迟积分(TDI)。 在时间延迟积分中，由对细胞101的曝光引起的在各个像素中的电荷在转换成数字值之前在像素行内进行累积。传感器对细胞101的曝光是基本上同步的，以使得细胞101上的特定位置在一次曝光期间被曝光到传感器行802，在下一次曝光期间曝光到传感器行803，以及在又一次曝光期间曝光到传感器行804。在第一次曝光期间在传感器行802中累积的电荷被转移至传感器行803并与第二次曝光叠加，然后所得到的电荷被转移至传感器行804 并与第三次曝光叠加。然后累积的电荷被转换成数字值。与单个图像相比，时间延迟积分也引起信噪比的大约^倍的提高。无论使用数字图像组合还是使用时间延迟积分，同时扫描平行的图像线条的优点之一是所述技术较好地利用了可用照射。诸如元件403的光成形元件通常不会将光聚焦到扫描线的单像素宽的带条上。照射场具有一定的可测量宽度，在单线(single-line)相机系统中会浪费部分照射。这样的系统的另一个优点是不损害分辨率，因为它可以用于简单地对像素进行重新分级以提高信噪比特性的系统中。本领域的普通技术人员会认识到诸如图5中所示系统500的系统也可以适用于使得每个相机509、513包括两个或更多个线性光传感器组成的组。每个相机509、513可以如上面参照相机801的描述一样来执行成像，使得可以通过数字图像组合或时间延迟积分来执行多色成像。类似地，诸如图7所示系统700的系统可适用于使得以至少两个线性传感器组成的线性传感器组替代传感器706。所述系统然后将经过波长选择的光分别导向线性光传感器组的两个部分。图2、4、5、6和7所示的系统可被认为包括具有单个线性光传感器的线性传感器组。另外，无论是通过数字组合还是通过时间延迟积分，可以使用重新分级或其它降低分辨率技术对来自至少两个平行的线性光传感器的组合图像进行组合。即使是在降低的分辨率的情况下，重新分级可以产生具有进一步改进的信噪比特性的图像。图9A至图9C示出了用于提供便于实现线扫描细胞仪的椭圆形照射场的另外的技术。线扫描细胞仪技术可以不需要在所有的实施例中都使用椭圆形照射场。可以使用传统的圆形的落射照射，只要照射功率足够高。对于使用散射的、非荧光光来成像，足够功率的照射源并不难实现。然而，为了实际感测由荧光发射的光，将激发光集中到椭圆形场可以更加节能，例如将所需的激发用激光器的功率从以数十或数百瓦的计量水平降到以数十或数百毫瓦的计量水平。图9A示出了包括一种用于提供椭圆形照射场的技术的实施例的系统900的视图。 系统900使用了类似于图4中所示系统400中的一些元件和装置，但本领域的技术人员会认识到图9A所示出照射技术也可以与其它感测装置一起使用。在系统900中，激光901从与执行感测方向相同的方向提供照射，使得样本上方的空间不受阻挡。这种布置方式可以因此容纳比先前所述述布置方式更大的样品，前述布置方式限制了样品不能厚于样品台与聚光透镜之间的距离。图9A所示的系统的另一个优点是物镜405参与了照射场的形成。物镜405通常可以为高品质的透镜，以便于可以严格地限定物镜所产生的照射场。在图9A所示的示例性系统中，激光器901产生导向细胞101的光束902。光束902 通过柱面透镜903。为了本公开的目的，柱面透镜是具有仅沿着一个方向的曲率的任何柱面透镜。柱面透镜可以具有但是不是必须具有被圆柱体限定的弯曲表面。在图9A的示图中，柱面透镜903被定位成使它的柱轴线与X方向平行，并且透镜903看起来对光束902没有任何影响。光束902继续通过分色镜406到达物镜405，物镜405将光束聚焦到细胞101 上。从细胞101出来的光通过物镜405，优选地从镜子406反射，可能会遇到一个或多个滤光器407，通过透镜408并到达相机409。图9B示出了图9A的沿X轴线观看的照射部分的实施例。S卩，图9B示出了图9A 的示图旋转90度后的示图。在该视图中，管子102的投影是个圆，而柱面透镜903示出为具有曲线轮廓。在图9B所示的示例性的实施例中，选择柱面透镜903的材料和尺寸，使得透镜903具有相对长的焦距，大于柱面透镜和物镜之间的距离。光束902在通过柱面透镜 903之后，如视图中所示相对地逐渐会聚。物镜405然后会聚并沿着Y方向重新扩大光束， 使得照射场变宽。如图9A所示，物镜405同时沿着X方向聚焦光束。得到的照射场可以在它遇到细胞101时具有严格限定的椭圆形状。图9C示出了图9A的从X轴线观看的照射部分的另一个实施例。在本实施例中， 选择柱面透镜903的材料和尺寸，使得透镜903具有相对短的焦距，短于柱面透镜和物镜之间的距离。光束902在通过柱面透镜903之后，在到达物镜405之前先会聚然后重新发散。 物镜405重导向光束902使得光束902再次会聚，但会聚要足够缓慢以使得当光束902到达细胞101时还有足够的宽度来涵盖被相机409扫描的线条的至少一部分。再一次，物镜 405同时沿着X轴方向聚焦光束。所得到的照射场可以在当它遇到细胞101时具有严格限定的椭圆形状。尽管本发明的实施例已示出为扫描在线性管子中约束的细胞，本领域的技术人员将认识到本发明的实施例也可以用于使用任一种宽范围细胞传输技术的系统，包括电泳法、压力驱动流、光镊法、电动平移台和其它技术。细胞可作为在油乳剂、电润湿驱动液滴中的有效载荷进行输送或者可以通过磁珠标记辅助的磁场传输进行输送。上述意图在于，所附权利要求不受所使用的细胞传输方法限制。在所附权利要求中，名词性术语意在表示一个或多个。在描述步骤或元件时，术语 “包括”以及类似用语意在表示另外的步骤或元件的添加是可选的，并不排除在外。为了清楚和理解的目的，已详细地描述了本发明。然而，本领域的普通技术人员将认识到可以在所附权利要求的保护范围之内进行一些变化和修改。
1权利要求
1.一个用于执行细胞仪功能的系统，所述系统包括 光源；光成形元件，所述光成形元件用于将来自所述光源的光集中到扫描区域的椭圆形场上；线性光传感器；以及光学系统，所述光学系统用于将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到线性光传感器上；其中，当细胞被输送通过所述扫描区域并被所述光源照射时，所述系统重复读取落在所述线性传感器上的光。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括位于所述线性传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。
3.一种用于执行细胞仪功能的系统，所述系统包括 照射扫描区域的光源；至少两个平行的线性光传感器；以及光学系统，所述光学系统用于将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到所述至少两个平行的线性光传感器上；其中，当细胞被输送通过扫描区域并被所述光源照射时，所述系统重复读取落在所述线性传感器上的光。
4.根据权利要求3所述的系统，还包括位于所述线性传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。
5.根据权利要求3所述的系统，其中，所述线性光传感器采集的各图像被组合以形成与单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，通过将对应于所述细胞上基本相同位置的各图像的像素值进行数字化组合来组合所述各图像。
7.根据权利要求5所述的系统，其中，通过时间延迟积分来组合所述各图像。
8.根据权利要求3所述的系统，还包括光成形元件，所述光成形元件用于将来自所述光源的光集中到所述扫描区域的椭圆形场上。
9.一种用于执行细胞仪功能的系统，所述系统包括扫描区域，所述扫描区域被包括至少第一和第二波长带的光照射； 用于将细胞输送通过所述扫描区域使得所述细胞被照射的装置； 第一和第二线性光传感器组，每组线性光传感器包括至少一个线性光传感器；以及光学系统，所述光学系统选择性地将从所述细胞发射的光导向所述两个线性光传感器组，使得在第三波长带的发射光主要导向所述第一线性光传感器组而在第四波长带的发射光主要导向所述第二线性光传感器组；其中，当所述细胞被输送通过所述扫描区域时所述系统重复读取落在所述线性传感器上的光。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，每一个线性光传感器组包括至少两个线性光传感器。
11.根据权利要求9所述的系统，其中，所述发射光由于荧光辐射而发射出。
12.根据权利要求9所述的系统，其中，所述光学系统还包括物镜，所述物镜用于接收和重导向从所述细胞发射的光；镜子，所述镜子用于将重导向的光的第一部分反射到所述第一线性光传感器组并透射重导向的光的第二部分。
13.根据权利要求12所述的系统，还包括第一镜筒透镜，所述第一镜筒透镜用于接收所述光的第一部分并与所述物镜配合在所述第一线性光传感器组上形成所述细胞的图像。
14.根据权利要求13所述的系统，还包括第二镜筒透镜，所述第二镜筒透镜用于接收所述光的第二部分并与所述物镜配合在所述第二组线性传感器上形成所述细胞的图像。
15.根据权利要求9所述的系统，还包括位于所述线性光传感器组中的至少一组的附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。
16.根据权利要求9所述的系统，其中，每一组线性光传感器包括至少两个线性光传感器，对于每一组线性光传感器，所述组中的各线性光传感器采集的图像被组合以形成与所述组中的单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。
17.根据权利要求16所述的系统，其中，通过将对应于所述细胞上基本相同位置的各图像的像素值进行数字化组合来组合所述各图像。
18.根据权利要求16所述的系统，其中，通过时间延迟积分来组合所述各图像。
19.一种用于执行细胞仪功能的系统，所述系统包括扫描区域，所述扫描区域被包括至少第一和第二波长带的光照射；用于将细胞输送通过所述扫描区域使得所述细胞被照射的装置；线性光传感器组，所述线性光传感器组包括至少一个线性光传感器；以及光学系统，所述光学系统选择性地将从所述细胞发射的光导向所述线性光传感器组的两个部分，使得在第三波长带的发射光主要导向所述线性光传感器组的第一部分而在第四波长带的发射光主要导向所述线性光传感器组的第二部分；其中，当细胞被输送通过所述扫描区域时所述系统重复读取落在所述线性传感器组上的光。
20.根据权利要求19所述的系统，其中，所述线性光传感器组包括至少两个线性光传感器。
21.根据权利要求19所述的系统，其中，所述发射光由于荧光辐射而发射出。
22.根据权利要求19所述的系统，还包括位于所述线性光传感器组附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。
23.根据权利要求19所述的系统，其中，所述线性光传感器组包括至少两个线性光传感器，其中所述组中的各线性光传感器采集的图像被组合以形成与所述组中的单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。
24.根据权利要求23所述的系统，其中，通过将对应于所述细胞上基本相同位置的各图像的像素值进行数字化组合来组合所述各图像。
25.根据权利要求23所述的系统，其中，通过时间延迟积分来组合所述各图像。
26.一种用于执行细胞仪功能的系统，所述系统包括扫描区域，所述扫描区域被光源照射；线性光传感器组，所述线性光传感器组包括至少一个线性光传感器；以及光学系统，所述光学系统用于将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到所述线性光传感器组；其中，当细胞被输送通过所述扫描区域并被所述光源照射时，所述系统重复读取落在所述线性光传感器组上的光；其中，所述系统能够配置成使得在第一实验期间创建第一图像，所述第一图像在对应于所述线性光传感器组的长度的方向上具有第一数量的像素；在第二实验期间创建第二图像，所述第二图像在对应于所述线性光传感器组的长度的方向上具有第二数量的像素，所述第二数量的像素少于所述第一数量的像素。
27.根据权利要求沈所述的系统，其中，所述线性光传感器组包括至少两个线性光传感器。
28.根据权利要求沈所述的系统，其中，通过选取少于来自所述线性光传感器组中全部像素的像素来降低所述第二图像的像素数量。
29.根据权利要求沈所述的系统，其中，通过对来自所述线性光传感器组中的部分或全部像素进行重新分级来降低所述第二图像的像素数量。
30.根据权利要求沈所述的系统，其中，对落在特定线性光传感器上的光的每一次读取产生单个落在所述特定传感器上的光的量的数值表示。
31.一种用于产生椭圆形照射场的系统，所述系统包括激光器，所述激光器产生光束；柱面透镜，所述柱面透镜用于接收所述光束并使所述光束仅沿着第一轴线会聚；物镜，所述物镜是无限远校正光学系统的一部分，所述物镜用于接收在所述柱面透镜之后的所述光束，并使所述光束沿着与所述第一轴线正交的第二轴线会聚。
32.根据权利要求31所述的系统，还包括位于所述柱面透镜和所述物镜之间的波长选择镜。
33.根据权利要求31所述的系统，其中，所述物镜与所述柱面透镜间隔开一定的距离， 所述距离小于所述柱面透镜的焦距。
34.根据权利要求31所述的系统，其中，所述物镜与所述柱面透镜间隔开一定的距离， 所述距离大于所述柱面透镜的焦距。
35.根据权利要求31所述的系统，其中，所述光束在离开所述物镜时在所述第一轴线方向上是发散的。
36.根据权利要求31所述的系统，其中，所述光束在离开所述物镜时在所述第一轴线方向上是会聚的。
37.一种用于执行细胞仪功能的方法，所述方法包括使用光源照射扫描区域的椭圆形场，其中，照射所述椭圆形场还包括使用光成形元件将来自所述光源的光集中到所述椭圆形场上；使用光学系统将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到线性光传感器上；以及当细胞被输送通过所述扫描区域并被所述光源照射时，重复读取落在所述线性传感器上的光。
38.根据权利要求37所述的方法，还包括使落在所述线性光传感器上的光通过位于所述线性光传感器附近的狭缝孔，以使所述系统执行半共焦成像。
39.一种用于执行细胞仪功能的方法，所述方法包括使用光源照射扫描区域；使用光学系统将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到至少两个平行的线性光传感器上；以及当细胞被输送通过所述扫描区域并被所述光源照射时，重复读取落在所述两个平行线性光传感器上的光。
40.根据权利要求39所述的系统，还包括将各线性光传感器采集到的图像进行组合以形成与单个线性光传感器采集的图像相比具有改进的信噪比特性的图像。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，对各图像进行组合还包括将对应于所述细胞上基本相同位置的各图像的像素值进行数字化组合。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，对各图像进行组合还包括使用时间延迟积分来组合所述各图像。
43.根据权利要求39所述的方法，其中，所述光源产生包括至少在第一和第二波长带的光的照射，所述方法还包括使用所述光学系统将从所述细胞发射的在第三波长带的光主要导向所述两个平行的光传感器的其中一个，以及使用所述光学系统将从所述细胞发射的在第四波长带的光主要导向所述两个平行的光传感器中的另一个。
44.根据权利要求39所述的方法，还包括使用所述光学系统将所述扫描区域的一部分的图像聚焦到至少两组平行的线性光传感器上，每一组包括至少两个线性光传感器。
全文摘要
一种用于使用线扫描传感器执行高速、高分辨率成像细胞仪功能的系统。待特征化的细胞被输送通过扫描区域。光学系统将扫描区域的一部分的图像聚焦到至少一个线性光传感器，当细胞被输送通过扫描区域时，重复读取落在传感器上的光。所述系统可以直接对细胞成像，或者可以激发细胞中的荧光，使由于荧光辐射而从细胞发射出的光成像。所述系统可以在扫描区域提供一个窄带的照射。所述系统可以包括能够实现同时多色荧光成像细胞仪的各种滤光器和成像光学元件。可以提供多个线性传感器，可以将各传感器采集的图像进行组合，以构造具有改进的信噪比特性的图像。
文档编号G01N21/00GK102439416SQ201080021662
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月18日 优先权日2009年3月20日
发明者保罗·帕特, 衡欣 申请人:伯乐实验室有限公司