分析肽混合物的方法

文档序号:6000970阅读:444来源:国知局
专利名称:分析肽混合物的方法
技术领域
本发明涉及通过质谱法表征、比较和归类肽类、肽混合物、多肽混合物和包括多肽组分的生物分子的分析方法。更特别地,本发明提供一种表征和归类包括几种不同氨基酸的复合肽混合物、多肽混合物或包括多肽组分的生物分子的分析/统计方法。
背景技术
共聚物-I为一种通过聚合氨基酸谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸而制备的复合多肽混合物。共聚物-I被称为乙酸格拉默,具有下述结构式(Glu, Ala, Lys, Tyr) x · x CH3COOH(C5H9NO4 · C3H7NO2 · C6H14N2O2 · C9H11NO3) x · x C2H4O2 {Physician Desk reference,(2000)}乙酸格拉默(GA)是克帕松(COPAXONE, ) (Teva Pharmaceutical IndustriesLtd.,以色列)的活性成分,其包括含有四种天然氨基酸L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸(具有的平均摩尔数分别为O. 141,0. 427,0. 095和O. 338)的合成多肽混合物的乙酸盐。克帕松的平均分子量为4,700至11,000道尔顿。乙酸格拉默是一种治疗多发性硬化症(MS)的批准药物。乙酸格拉默的制备方法描述在美国专利No. 3,849,550和5,800,808 和 PCT 国际公布 No. WO 00/05250 中。欧洲专利申请公布No. I 983 344 Al公开了一种胰蛋白酶消化单个多肽标准品和通过MADLDI-T0F检测其分解的方法。PCT国际公布No. WO 2008/135756公开了胰蛋白酶消化单个肽标准品,其提供了通过串联质谱分析的预期胰蛋白酶肽片段。

发明内容
与现有技术相反,本发明显示使用水解酶将复合多肽混合物标准品比如乙酸格拉默消化成多个肽片段。通过质谱法和质谱/质谱(MS/MS)分析所述肽片段。每种样品的质谱结果用作与其它样品比较的指纹。比较获得的两种样品消化物的质谱,作为相应样品的指纹。选择第一次质谱分析仪检测的每个肽片段,进行第二次质谱分析(所谓的MS/MS分析),以将前体肽离子切割成甚至更小的片段。通过软件比如Biotools分析从MS/MS分析获得的质谱,以获得每个肽片段的序列。结果显示在第一次质谱分析仪中检测的肽离子的组成和序列。最后,用统计学软件(比如ClinProTool)分析样品消化物的质谱,经由统计学检验(t-检验,AN0VA..)获得的单峰排序归类(比如二维峰分布)。还通过多元统计(主成分分析,PCA)获得不同样品的分型或特征。这一重要方法是统计学比较不同产品的质谱和基于得到的分类和定位位置区分样品。


在附图中图I :酶消化的克帕松和共聚物-I之间的比较质谱。图2a 由酶消化的克帕松和共聚物-I记录的离子-m/z 452. 44的MS/MS谱图。图2b m/z 452. 44的序列和碎片离子。图3a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的离子-m/z 509. 385的MS/MS谱图。图3b :m/z 509. 385 (I)的序列和碎片离子。 图3c m/z 509. 385(2)的序列和碎片离子。图4a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的m/z 603. 515的MS/MS谱图。图4b :m/z 603. 515的序列和碎片离子。图5a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的m/z 638. 590的MS/MS谱图。图5b m/z 638. 590的序列和碎片离子。图6a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的m/z 674. 880的MS/MS谱图。图6b m/z 674. 880的序列和碎片离子。图7a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的m/z 710. 622的MS/MS谱图。图7b m/z 710. 622的序列和碎片离子。图8a :从酶消化的克帕松和共聚物-I记录的m/z 745. 568的MS/MS谱图。图8b :m/z 745. 568的序列和碎片离子。图9 :酶消化的克帕松、共聚物-I、细胞色素C、溶菌酶和人血清白蛋白的质谱。图10 :来自基于酶消化的克帕松、共聚物-I、细胞色素C、溶菌酶和人血清白蛋白质谱的单峰排序的前两个峰的2D峰分布。图Ila :克帕松、共聚物-I、细胞色素C、溶菌酶和人血清白蛋白的PCA分析结果的3D图。图Ilb :克帕松、共聚物-I、细胞色素C、溶菌酶和人血清白蛋白的PCl对PC2的曲线图。图12 :来自基于酶消化的克帕松、共聚物-I和3-NCA质谱的单峰排序的前两个峰的2D峰分布。图13 :克帕松、共聚物-I和3-NCA的PCl对PC2的曲线图。
具体实施例方式本发明提供一种评价两种高度复合大分子之间的化学相似性的方法。无需样品预处理,复合肽混合物的质谱为样品中所有分子的平均结果,包括不能分辨的信号。为了获得可复制的、清楚限定的谱图,以比较两种复合混合物的组成,通过化学反应或酶促反应将样品消化成较小的片段。然后,使用具有偶联质谱功能的质谱仪表征消化的样品。使用多元统计将得到的质谱进行归类。例如,进行主成分分析(PCA),一种简单的非参数多元统计方法,以分组复杂数据集。关联多元统计的质谱提供了复合多肽分子的比较信息。
为了帮助理解本发明,包括下述实施例,其描述了一系列试验的结果。与本发明有关的下述实施例当然不应当被看作特别地限制本发明。目前已知的或随后研究的、在在本领域技术人员权限之内的本发明的这些变化都落入如下要求的本发明的范围内。实施例I :保护的共聚物-I的制备将L-丙氨酸的N-羧基酸酐(4. Og, 34. 78mmol)、Y -苄基L-谷氨酸的N-羧基酸酐(3. Og, 11. 39mmol)、N-三氟乙酰基赖氨酸的N-羧基酸酐(7. 47g, 27. 97mmol)和L-酪氨酸的N-羧基酸酐(I. 6g,7. 73mmol)被放置在具有磁力搅拌器的单颈烧瓶中。通过加入干二噁烷(289mL)以溶解该混合物。加入蒸馏的二乙胺(60yL)。在室温下,机械搅拌得到的混合物24小时。将丙酮(116mL)加入到该混合物中,并将该溶液慢慢地倾倒到丙酮(173mL)和水(578mL)的混合物中。将该悬浮液搅拌并过滤。在NMT45°C下,真空干燥该固体,得到12. 02g受保护的共聚物-I (产率94. 7% )。
实施例2聚[L-Ala,5_苄基-L-Glu,N6-TFA-L_Lys,L-Tyr]脱保护苄基,得到聚[L_Ala,L-Glu,N6-TFA-L-Lys, L-Tyr]将12. 02g来自实施例I的受保护共聚物-I悬浮在72mL的33 % HBr/HOAc中。在室温下,将该混合物搅拌17小时,溶液变澄清。将该混合物用正庚烷(190mL)萃取并洗涤。将该混合物的下层转移到水(240mL)和正庚烷(120mL)的混合物中。将沉淀物过滤并干燥,得到呈白色固体的三氟乙酰基格拉默。实施例3聚[L-Ala,L-Glu,N6-TFA-L_Lys,L-Tyr]脱保护三氟乙酰基,得到聚[L_Ala,L-Glu, L-Lys, L-Tyr]在室温下,使9. 5g来自实施例2的三氟乙酰基-格拉默与水(120. 2ml)和40%的氢氧化四丁铵水溶液(52. 2mL,3eq)反应24小时。用乙酸(20mL)调节该混合物的pH至3-4,得到乙酸格拉默溶液,并通过使用3千道尔顿膜进行超滤,以除去低分子量杂质。在连续水超滤2个周期之后,将得到的产物浓缩,并冻干,得到呈纯白色固体的乙酸格拉默(共聚物-I) (4. 7g,产率 60% )。实施例4肽标准品消化和质谱分析在57 °C下,用80mM的NH4HC03将克帕松稀释至O. 04mg/100 μ 1,并用胰蛋白酶(I μ g/100 μ I)消化 30 分钟。MALDI/T0F/T0F(Autoflex III,Bruker Daltonics Corp. ) 用MALDI基质a -CHC溶液对I μ I消化的克帕松的干共结晶混合物进行分析。使用质谱仪以反射正模式(RP)和线性正模式(LP)检测肽。基于RP模式的高分辨率分析结果,选择前体离子进行T0F/T0F质谱分析。这是一种提供肽片段作为与其它样品比较的指纹的肽标准。实施例5分析其它肽的应用还根据上述实施例4的方法检测和分析由上述实施例合成的共聚物-I、3-NCA(N-羧基酸酐)和4-NCA和三种蛋白质标准品(细胞色素C、溶菌酶和人血清白蛋白)。3-NCA是由当量比3. 5 : 1.45 : I. O的赖氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和酪氨酸(Tyr)组成的。与克帕松和共聚物-I相比,3-NCA不含氨基酸丙氨酸。4-NCA由当量比4. O 3.5 1.45 1.0的苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸组成。在4-NCA中,克帕松中的亲水性的丙氨酸(Ala)由疏水性的苯丙氨酸代替,苯丙氨酸占其组成的最高比例(40%)。因而,4-NCA几乎不溶于水中。实施例6数据处理和统计分析首先,通过Flexanalysis和BioTools质谱法软件比较来自克帕松和共聚物_1样品的第一次质谱和第二次质谱的信号(图1-9)。接着,使用ClinProTools软件基于统计试验的单峰排序进行归类(图10和12)。最后,使用主成分分析(PCA)方法进行来自参考标准品和样品的质谱法的结果的统计分析(图11和13)。分析软件如下(a) Flexanalysis FlexAnalysis 是来自 Bruker Daltonics Inc.的软件,用于 MALDI-TOF 图像分析和处理。(b)BioTools BioTooIs 是来自Bruker Daltonics Inc.的软件,支持基于质谱法的蛋白组学。其设计用于由Bruker Daltonics ESI和MALDI仪器得到的蛋白质消化物或肽的质谱的解释。其也可以充当数据库研究界面。(c)ClinProToolsClinProTools是来自Bruker Daltonics Inc.的统计分析软件,主要处理来自MALDI/T0F仪器的蛋白质或肽的质谱。ClinProTools合并多种数学算法,产生用于统计学和归类的模式识别模型。
权利要求
1.一种通过使用质谱法和统计法表征、比较和归类肽类或多肽混合物或包含多肽组分的生物分子样品的方法。
2.根据权利要求I所述的方法,其中所述方法包括 (a)用合适的酶或化合物将样品消化或分解成肽片段; (b)通过质谱法分析肽片段,得到质谱;和 (C)通过统计法分析质谱,以归类和区别不同的样品。
3.根据权利要求2所述的方法,其中合适的酶溶于溶液中或被固定在载体上。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述载体选自微米或纳米尺寸的颗粒、柱内涂层和盒内包装。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述载体为磁性或非磁性颗粒。
6.根据权利要求2所述的方法,其中所述合适的酶为胰蛋白酶或能够消化样品的任何其它酶。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述酶溶于溶液中或被固定在颗粒上、或被固定在柱的内表面、或被固定在盒内包装上。
8.根据权利要求2所述的方法,其中用于分解样品的化合物是有机酸或无机酸或有机碱或无机碱。
9.根据权利要求2所述的方法,其中所述样品是多肽混合物。
10.根据权利要求2所述的方法,其中所述样品是共聚物混合物。
11.根据权利要求2所述的方法,其中所述样品是克帕松。
12.根据权利要求2所述的方法,其中所述质谱仪能够进行质谱和质谱/质谱分析。
13.—种通过质谱法分析样品的方法,其包括 (a)提供肽标准品和肽样品; (b)用合适的酶或化合物消化样品和肽标准品; (c)使消化的肽样品和肽标准品进行质谱分析,产生两个质谱;和 (d)通过统计方法比较和分析所述两个质谱。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述统计方法是主成分分析(PCA)。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述样品是多肽混合物。
16.根据权利要求13所述的方法,其中所述样品是共聚物。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述共聚物的组分包含不超过10个氨基酸。
18.根据权利要求16所述的方法,其中所述样品是乙酸格拉默。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述乙酸格拉默是通过包括下述步骤的方法制备的 (a)聚合酪氨酸、丙氨酸、Y-苄基谷氨酸的N-羧基酸酐和N-三氟乙酰基赖氨酸,形成保护的多肽的混合物; (b)用氢溴酸的乙酸溶液使受保护的多肽脱保护,形成三氟乙酰基多肽的混合物;和(C)使三氟乙酰基多肽的混合物与氢氧化四丁铵反应,形成多肽的含水混合物,其各自基本上由丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成。
全文摘要
本发明提供一种通过使用质谱法和用于分析质谱结果的统计法表征和归类肽或多肽混合物或包含多肽组分的生物分子的样品的方法。本发明还公开了一种利用氢氧化四丁铵合成乙酸格拉默的方法。
文档编号G01N33/50GK102802640SQ201080025173
公开日2012年11月28日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月8日
发明者哈迪·陈, 谢建台, 卓怡孜, 林其贤 申请人:台湾神隆股份有限公司
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