专利名称：人皮肤外植体培养系统及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人皮肤外植体培养系统以及使用所述系统测试组合物对皮肤代谢活性的作用。
背景技术：
体外模型系统一直是基础研究和应用研究的重要构成部分。由于最新的欧盟法规禁止使用动物测试化妆品成分，因此为皮肤建立此类模型系统越发重要。人皮肤外植体已在培养条件下研究50多年，主要研究领域为表皮生物学和上皮癌研究。然而，这些模型系统主要针对表皮活性，无法重现真皮层和脂肪层的代谢活性以及组织结构。论文"Repair of UVA-Induced Elastic Fiber and Collagen Damage by 0. 05% Retinaldehyde Cream in an ex vivo Human Skin Model，，(在体夕卜人皮肤模型中使用0. 05%视黄醛霜剂修复UVA诱导的弹性纤维和胶原损伤)(由S. Boisnic等人提交于1998年10月7日在第七届欧洲皮肤性病学会年会(Nice，France)召开的卫星研讨会的、题名为"New Concepts for Topical Use of Natural Retinoids, Retinaldehyde in Perspective^ (天然类视色素、视黄醛局部用药前景的新概念)的论文集(编辑J. "H. Saurat, Geneva, Switzerland ；A. Vahlquist，Uppsala，Sweden))讨论了视黄酸对皮肤夕卜植体培养物中的胶原的作用。最近发表的论文"Effectof Green Coffea Arabica L. Seed Oil on Extracellular Matrix Components and Water-channel Expression in in vitro and ex vivo Human Skin Models，，(Journal of Cosmetic Dermatology, 2009 Mar ；8 (1) :56_62, Velazquez Pereda Mdel C et al.)(绿咖啡豆种子油对体内和体外人皮肤模型中细胞外基质组分和水通道蛋白表达的作用(《美容皮肤病学杂志》，2009年3月；第8卷第1期，第 56-62页，Velazquez Pereda Mdel C等人))的作者没能说明在外植体培养物中起到的作用。因此，他们用人皮肤组织切片与其受试试剂共同温育，再进行免疫染色，以证实在合成胶原、弹性蛋白和其他细胞外基质组分时的刺激作用。不管这些论文的教导内容如何，一直需要这样的人皮肤外植体模型系统其最能代表所有皮肤区室的生理复杂性、代谢活性和结构完整性。还需要增加所培养的活检组织的表面积，以便能够研究试剂和组合物的局部施用。直径4mm的标准活检组织大小不支持此类研究。“A Human Full-Skin Culture System for Interventional Studies，，(Eplast. 2009 ;9 :e5. Published online 2009 January 9，by Lars Steinstraesser et al.)(用于干预性研究的人全层皮肤培养系统(Eplast. 2009 ；第9卷第e5页，由Lars Steinstraesser等人于2009年1月9日网上发表))描述了较大皮肤活检组织的培养并证实皮肤外植体的组织学特性保留了 4周。然而， 在该外植体系统的转基因表达模式研究中，却发现并不与体内观察到的代谢活性类似。一直需要这样的人皮肤外植体模型系统其最能代表所有皮肤区室的生理复杂性、代谢活性和结构完整性，并且具有足够的表面积以便能够用受试试剂和组合物进行局部处理。
发明内容
本发明涉及人皮肤外植体培养系统，所述培养系统包含置于特定培养基中的直径高达约25mm的人皮肤活检组织，所述培养基包含约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基、约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物、约0. 5重量％至约5 重量％的胎牛血清、1至20 μ g/ml的胰岛素、1至20ng/ml的氢化可的松、1至20ng/ml的表皮生长因子以及IX抗生素-抗真菌溶液。本发明还提供了一种用于确定组合物在局部施用到皮肤时的作用的方法，所述方法包括将直径高达约25mm的皮肤活检组织培养在特定培养基中，所述培养基包含约40 体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基、约40体积％至约60体积％的？-12 营养混合物、约0. 5重量％至约5重量％的胎牛血清、1至20 μ g/ml的胰岛素、1至20ng/ml 的氢化可的松、1至20ng/ml的表皮生长因子以及IX抗生素_抗真菌溶液，从而建立皮肤外植体培养系统；将组合物局部施用到皮肤活检组织；以及分析皮肤活检组织对组合物的生物学响应。在另一个实施例中，将组合物或受试试剂施用到上述培养基中，以便将组合物对不同皮肤区室的生物学作用与局部递送的作用区分开。
具体实施例方式本发明的培养系统用于延长皮肤外植体的存活期并且用于确保全层皮肤外植体都有代谢活性，进而能够对局部施用的组合物的作用进行研究。通常，皮肤外植体采用的形式为尺寸为直径2_4mm的皮肤活检组织，因为在标准培养条件下更大的外植体在组织中心会发生坏死。然而，具有此类小尺寸的皮肤外植体不适合局部施用。现已鉴定了用以支持更大的人皮肤外植体的完整性的最佳培养基，从而使局部施用的皮肤学活性的评估得以实现。培养系统包含培养基，该培养基包含具有高蔗糖含量的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(“DMEM”)。达尔伯克氏改良伊格尔培养基可以达尔伯克氏改良伊格尔培养基(D-MEM) (IX)，液体(高糖)/ 目录号11965 (Dulbecco' s Modified Eagle Medium(D-MEM) (IX), liquid (high glucose)/cat# : 11965)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。DMEM的含量可在培养基的约40至约60体积％的范围内，例如约50体积％。培养基还包含F-12营养混合物(“F-12”)。F_12营养混合物可以F_12营养混合物(Ham) (IX)，液体 12/ 目录号:11765(F_12 Nutrient Mixture (Ham) (IX)，liquidl2/ cat# : 11765)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。F-12营养混合物的含量可在培养基的约40至约60体积％的范围内，例如约50体
5积％。培养基还包含牛血清，例如胎牛血清。牛血清可以胎牛血清，合格，热灭活/目录 10082-139(Fetal Bovine Serum，Certified，Heat-Inactivated/ciitft 10082—139)得
自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。牛血清的含量可在培养基的约0. 5至约5重量％的范围内，例如约2重量％。培养基补充有胰岛素、氢化可的松、表皮生长因子(“EGF”)和抗生素-抗真菌溶液(“ABAM”)。胰岛素的含量可在1至20μ g/ml的范围内，例如10μ g/ml。胰岛素可以人胰岛素溶液 / 目录号19278 (insulin solution human/cat# 19278)得自例如 Sigma (St. Louis, MO, USA)。氢化可的松的含量可在1至20ng/ml的范围内，例如lOng/ml。氢化可的松可以氢 ^nT Ι Y _畐身寸 / 巨 :H0135 (hydrocortisone powder, γ—irradiated/cEitft : H0135)得自例如 Sigma (St. Louis, M0, USA)。表皮生长因子的含量可在1至20ng/ml的范围内，例如lOng/ml。表皮生长因子可以重组人表皮生长因子(EGF)/目录号PHG0311 (Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) /cat# :PHG0311)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。抗生素_抗真菌溶液的含量为IX。抗生素-抗真菌溶液可以抗生素-抗真菌溶液(100X)，液体 / 目录号 15240-062 (Antibiotic-Antimycotic (100X)，liquid/Cat. No. 15240-062)得自例如 Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA)。将高达约25mm直径(例如约2至约25mm、或约4至约25mm，或在某些实施例中， 约12mm直径)的人皮肤外植体置于培养基中。培养基液面应与外植体高度相当。在一个实施例中，将外植体在约32°C至约37°C下温育，例如在约32°C下温育。意外地发现，将培养温度从37°C (标准温度)降低至约32°C，可使外植体存活更久并且提高了其完整性和代谢活性。还意外地发现，在培养的首个24小时内将培养温度从37°C (标准温度)降低至约32°C，然后再将外植体培养于37°C，也可使外植体存活更久并且提高了其完整性和代谢活性。在另一个实施例中，胎牛血清的含量从5%降低至2%。这也可使所培养的外植体存活更久，并且提高了其组织完整性和代谢活性。在另一个实施例中，将外植体在含有5体积％的CO2的标准湿润气氛中温育。每天更换培养基。也就是说，去除并更换培养基和营养物质。 本发明所使用的培养基可确保组织存活性。如本文所用，“可确保组织存活性”是指可保证组织在培养过程中存活并防止可导致细胞和组织死亡的组织损伤，例如防止组织坏死。可通过对组织学染色的组织切片进行组织学分析并说明组织结构完好且正常，来证实组织存活性。也可通过分析已知对细胞存活性至关重要的基因的基因表达，来测定组织存活性。这些基因包括但不限于定义为“管家基因”的一组基因。管家基因通常为组成性基因， 它们在许多或所有已知条件下都以相对恒定的水平转录。通常需要管家基因的产物来维持细胞。一般认为无毒试剂的局部处理不会影响管家基因的表达。管家基因的例子包括但不限于肌动蛋白、GAPDH、18S RNA和泛素。也可采用本领域技术人员已知的任何方法测定组织存活性。本发明的培养系统使得研究组合物在局部施用到皮肤时的作用得以实现。可测定皮肤外植体在分子、细胞和/或生理水平上对受试组合物的响应。可通过组织学、分子分析、生物标记物分析等方法分析皮肤外植体。具体地讲，本发明使在皮肤外植体所有区室内的代谢活性水平更高，更类似于体内皮肤的代谢活性。可使用根据本发明培养的外植体测定皮肤三个区室的代谢活性。如本文所用，“代谢活性”是指活性基因表达、或基因产物合成、或蛋白质(例如酶)活性以及终产物的生成，这种活性为这些组织区室所专有，但不是决定组织存活性的唯一因素。在一个实施例中，通过组织特异性基因的基因表达来分析根据本发明培养的外植体的代谢活性。对于皮肤的表皮区室，此类基因包括但不限于角质细胞表达的基因，例如特定角蛋白(如角蛋白5、14、1和10)、PAR-2、或KGFR，以及黑素细胞特异性基因，例如酪氨酸酶、 TRP-I和TRP-2及其他黑素生成基因。对于皮肤的真皮区室，此类基因包括但不限于弹性蛋白、弹性蛋白辅助蛋白(例如微纤维蛋白-1和扣针蛋白-5)和胶原(例如胶原1 α 1和胶原4)。对于皮肤的脂肪层，此类基因包括但不限于生脂基因(例如PPAR-Y、瘦素、 GLUT4、FABP4、AdPLAjn Pref-I)和脂解基因(例如PPAR-α、酰基CoA脱氢酶、磷酸二酯酶、 CPT肉毒碱棕榈酰基转移酶和GPR81)。在本发明的另一个实施例中，通过对根据本发明培养的外植体的组织切片进行组织学或免疫组织化学染色，来分析皮肤的真皮层的代谢活性。此类染色的例子包括但不限于展现高弹性蛋白纤维网络的Lima弹性蛋白染色、或展现新胶原合成情况的前胶原免疫组织化学染色。在另一个实施例中，通过分析分泌到根据本发明外植体的培养基中的参与脂质代谢的分子，来测定这些外植体的脂肪层的代谢活性。此类分子的例子包括但不限于分泌蛋白(例如瘦素)和脂质分子分泌物(例如甘油和非酯化脂肪酸)。除非另有规定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域普通技术人员公知的相同含义。除非另外指明，否则无论何时使用的任何百分比均为重量 / 重量(w/w) ο以下说明了本发明的实例。不应将本发明理解为受到其细节的限制。实例 1在得到知情同意后，从接受整形手术的健康个体获得人腹部皮肤。依照US HIPAA法规的规定，未公开患者身份以保护保密权。首先用补充有青霉素/链霉素(200 单位/ml青霉素、200yg/ml链霉素)、两性霉素B(5yg/ml)和庆大霉素(20 μ g/ml)的 DMEM在室温下对钻取活检组织(直径为4和12mm)消毒30分钟，所有这些试剂均得自 Invitrogen(Carlsbad CA)。将外植体置于表1中列出的不同培养基中，其中补充有抗生素和表2中所列的生长因子混合物，再放置在37°C加湿室中，使之处于5% CO2气氛下。每天更换培养基。培养基A-G为对比物。培养基1根据本发明配制。
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表1-所Illi式的培养某(除非另外指明，否_所有材料均_自Invitrogen)
权利要求
1.一种人皮肤外植体培养系统，所述培养系统包含置于培养基中的直径高达约25mm 的人皮肤活检组织，所述培养基包含约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基； 约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物； 约0. 5重量％至约5重量％的胎牛血清；1至20 μ g/ml的胰岛素；1至20ng/ml的氢化可的松；1至20ng/ml的表皮生长因子； 以及IX抗生素-抗真菌溶液。
2.根据权利要求1所述的培养系统，包含约50体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基，约50体积％的F-12营养混合物以及约2重量％的胎牛血清。
3.根据权利要求1所述的培养系统，包含约lOng/ml的表皮生长因子。
4.根据权利要求1所述的培养系统，在约32°C至约37°C下温育。
5.根据权利要求1所述的培养系统，在约32°C下温育。
6.根据权利要求1所述的培养系统，在约32°C下温育24小时后再在约37°C下温育。
7.一种测定组合物在局部施用到皮肤时的作用的方法，包括 将直径高达约25mm的皮肤活检组织培养于培养基中，所述培养基包含 约40体积％至约60体积％的达尔伯克氏改良伊格尔培养基；约40体积％至约60体积％的F-12营养混合物； 约0. 5重量％至约5重量％的胎牛血清；IM 20 μ g/ml的胰岛素；1至20ng/ml的氢化可的松1至20ng/ml的表皮生长因子； 以及IX抗生素-抗真菌溶液， 从而构建皮肤外植体培养系统； 将所述组合物局部施用到所述皮肤活检组织上；以及分析所述皮肤活检组织对所述组合物的生物学响应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统包含约lOng/ml的表皮生长因子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32°C下温育。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32°C至约37°C下温育。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述培养系统在约32°C下温育24小时后再在约 37 °C下温育。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为真皮分析，所述真皮分析包括通过选自以下的方法监测弹性蛋白纤维生成LUNA染色；对弹性蛋白或弹性蛋白辅助蛋白的基因进行的QPCR或转录分析；对弹性蛋白或弹性蛋白辅助蛋白的基因进行的蛋白检测；组织学染色；以及免疫组织化学染色。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为真皮分析，所述真皮分析包括通过选自以下的方法监测胶原合成不同胶原基因的转录；不同胶原蛋白的蛋白检测；组织学染色；以及免疫组织化学染色。
14.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括用脂肪细胞分化试剂处理后对甘油三酯含量进行生化分析以监测脂肪生成。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括在使用促脂肪生成试剂后测定游离甘油的释放以证实脂肪分解。
16.根据权利要求7所述的方法，其中所述分析步骤为皮肤脂肪层的分析，所述分析包括通过选自以下的方法监测瘦素代谢所述瘦素基因的转录；分泌瘦素的蛋白检测；以及免疫组织化学染色。
全文摘要
本发明涉及人皮肤外植体培养系统及其用途。
文档编号G01N33/50GK102482642SQ201080038259
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月18日 优先权日2009年8月21日
发明者A·帕帕斯, C·B·林, M·塞伯格, N·陈, Y·胡 申请人:强生消费者公司