专利名称：利用多种磁性标记示踪结合试剂的结合测定的制作方法
利用多种磁性标记示踪结合试剂的结合测定本发明涉及利用例如抗体的磁性标记结合试剂的结合測定。夹心免疫测定是用于检测分析物的众所周知的方法，其中通常，针对该分析物的第一抗体结合到反应腔室中的底物(捕获抗体)并且在那里针对同一分析物的第二抗体 (可溶的或者悬浮的)结合到可检测标记物(示踪抗体)。这种可检测的标记物包括发色标记物(例如，荧光标记物)和磁性颗粒。在这种夹心免疫測定中，当抗体之一没有结合到分析物时不能检测到该分析物。 这可以例如由分析物的降解(例如，蛋白质水解)、分析物上表位的改变(例如，(去)磷酸化)或者与防止分析物上的表位与抗体结合的其他蛋白质的复合物形成而造成。以上现象可能导致疾病标志物检测中的假阴性結果。肌钙蛋白是用于各种心脏疾病的公认标志物。然而，这ー蛋白质形成了不同的亚单位并且在收集血液样本之后很容易降解。为了解决这ー问题，已经开发了其中使用两种不同的示踪抗体的测定[Eriksson等人· (2006)Clin. Chem. 51,839-847 ；欧洲专利申请 EPP1473567][
图1]。在这ー类型的现有技术测定中，用小荧光有机分子来标记该示踪抗体。利用磁性标记物来执行这种测定产生了无法预料的问题。由干与蛋白质分析物的尺寸相比磁性颗粒的相对大尺寸所引起的位阻，导致两种磁性标记示踪抗体与分析物的结合(所谓的桥接)使得对于该分析物而言很难进ー步结合到捕获抗体[图2]。需要进ー步的调节以执行利用不同的磁性标记示踪抗体的夹心測定。在独立和从属权利要求中陈述了本发明的特定和优选方面。来自从属权利要求的特征可酌情与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征相结合，并且不仅仅在权利要求中明确陈述。本发明防止假阴性結果，在假阴性结果中将不会检测到在样本中存在的疾病标志物，并且患病的人或者具有患病风险的人将被认为是健康的。本发明的ー个方面涉及ー种用于在结合測定中利用磁性标记物C3)检测分析物(2)的盒体(1)，所述盒体包括针对所述分析物上的结合位点的至少ー种捕获结合试剂 (4)，并且包括针对所述分析物上的另外不同的结合位点的至少两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其特征在于所述盒体包括至少两个区域(61和62)，其中第一区域(61)包括所述至少ー种捕获结合试剂(4)和第一磁性标记示踪结合试剂(51)，并且其中第二区域 (62)包括至少ー种捕获结合试剂(4)和第二磁性标记示踪结合试剂(52)。在本文中所述第一区域(61)不包括非所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂， 并且其中所述第二区域(6 不包括非所述第二磁性标记示踪结合试剂(5 的磁性标记示踪结合试剂。根据在本文中描述的盒体的具体实施例，这些包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，其中所述第一区域(61)包含所述第一捕获结合试剂(41)，并且其中所述第二区域(62)包含所述第二捕获结合试剂02)。根据在本文中描述的盒体的其他具体实施例，这些包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，其中所述第一区域(61)包含所述第一捕获结合试剂Gl)和所述第一示踪结合试剂(51)，并且其中所述第二区域(6 包含所述第二捕获结合试剂G2)和所述第二示踪结合试剂(52)。根据在本文中描述的盒体的其他具体实施例，这些包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，其中所述第一区域(61)和所述第二区域 (62)两者都包括所述第一捕获结合试剂Gl)和所述第二捕获结合试剂G2)。根据在本文中描述的盒体的仍另一具体实施例，这些包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，并且包括针对所述分析物上的另外两个不同结合位点的两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其中所述盒体包括两个区域(61和 62)，其中第一区域(61)包括所述第一和第二捕获结合试剂(41和4 和所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)，并且其中所述第二区域(62)包括所述第一和第二捕获结合试剂(41 和4 和所述第二磁性标记示踪结合试剂(52)。根据在本文中描述的盒体的其他具体实施例，结合试剂是抗体。根据在本文中描述的盒体的其他具体实施例，区域是反应腔室。根据在本文中描述的盒体的其他具体实施例，所述分析物是肌钙蛋白，例如心肌肌钙蛋白I(cTnl)。本发明的另一方面涉及ー种使用磁性标记示踪结合试剂用结合測定来检测样本中的分析物O)的方法，所述方法包括步骤-a)提供具有至少两个区域(61和62)的盒体O)，其中将针对所述分析物上的结合位点的捕获结合试剂固定在所述区域(61和6 的表面上，-b)在所述第一区域(61)中提供所述分析物与第一磁性标记示踪结合试剂的复合物，所述第一磁性标记示踪结合试剂针对所述分析物(51)上的另外的结合位点，-c)在所述第二区域(6 中提供所述分析物与第二磁性标记示踪结合试剂(52) 的复合物，所述第二磁性标记示踪结合试剂(5 针对所述分析物上的又另外的结合位点，-d)允许步骤b)和C)中的所述复合物与所述区域中的所述捕获结合试剂结合，-e)检测步骤b)和C)中的所述复合物到所述捕获结合试剂的结合，其中在所述方法中，所述第一区域(61)不包括非所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂，以及所述第二区域(6 不包括非所述第二磁性标记示踪结合试剂(52)的磁性标记示踪结合试剂。根据在本文中描述的方法的其他具体实施例，在引入包括所述分析物的液体之前在所述区域中提供示踪结合试剂。根据在本文中描述的方法的其他具体实施例，结合试剂是抗体。根据在本文中描述的方法的其他具体实施例，区域是反应腔室。根据在本文中描述的方法的进ー步具体实施例，所述分析物是肌钙蛋白，例如心肌肌钙蛋白I (cTnl)，其中示踪抗体和捕获抗体(51)结合到cTnl的稳定区域上的不同表位，并且其中示踪抗体0 和捕获抗体(5 结合到肌钙蛋白的不稳定区域上的不同表位。本发明的另一方面涉及ー种用于使用磁性致动来执行结合測定的设备，包括以上所描述的盒体。
本发明的另一方面涉及ー种试剂盒，包括结合到同一分析物上的不同结合位点的至少三种不同的结合试剂，其中所述结合试剂中的至少两种用磁性颗粒标记，并且其中所述结合试剂中的至少ー种不用磁性颗粒标记。根据在本文中描述的试剂盒的具体实施例，试剂盒包括结合到同一分析物上的四个不同结合位点的四种不同的结合试剂，其中所述四种结合试剂中的两种用磁性颗粒标ル己。根据在本文中描述的试剂盒的另一具体实施例，所述结合试剂是抗体。根据在本文中描述的试剂盒的具体实施例，所述分析物是肌钙蛋白。根据在本文中描述的试剂盒的具体实施例，所述分析物是心肌肌钙蛋白I，并且所述第一未标记抗体和所述第一磁性标记抗体结合到心肌肌钙蛋白I的稳定区域上的不同表位，以及，所述第二未标记抗体和所述第二磁性标记抗体结合到心肌肌钙蛋白I的不稳定区域上的不同表位。通过以下详细描述并结合通过举例方式图示本发明原理的附图，本发明的以上和其他特性、特征及优点将变得显而易见。仅为了举例而给出这一描述，而不限制本发明的范围。以下引用的參考图涉及附图。图1示出了现有技术免疫測定的示意性概览。一种捕获抗体(4)和两种不同的示踪抗体(51，52)与分析物O)结合。星形(L)代表荧光标记物。图2示出了当在图1所描绘的測定中用大磁性颗粒(3)替换小荧光标记物时遇到的位阻的示意性概览。图3示出了根据本发明的盒体(1)的示例性实施例，该盒体具有两个区域(61， 62)、一种捕获抗体以及两种磁性标记示踪抗体(51和52)。在本文中沿着轴Z在垂直方向中在相应区域(61)和(6 上朝捕获抗体(4)上下操纵该磁性标记示踪抗体(51和 52)。图4示出了根据本发明的盒体(1)的示例性实施例，该盒体具有两个反应腔室 (61，62)、一种捕获抗体以及与磁性颗粒(3)附着以检测分析物O)的两种示踪抗体 (51 和 52)。图5示出了根据本发明的盒体(1)的示例性实施例，该盒体具有两个反应腔室 (61，62)、两种捕获抗体(41和42)以及与磁性颗粒(3)附着以检测分析物O)的两种示踪抗体(51和52)。图6示出了根据本发明的盒体(1)的示例性实施例，该盒体具有两个反应腔室 (61，62)、两种捕获抗体(41和42)以及与磁性颗粒(3)附着以检测分析物O)的两种示踪抗体(51和52)。图7示出了肌钙蛋白C/肌钙蛋白I复合物的示意性结构(从Hytest目录 (Hytest，土尔库，芬兰)获得)。在不同的图中，同一附图标记涉及相同或者类似的要素。虽然图提供了结合试剂是抗体的特定实施例，但是要素バ41)バ42)、(5)同样地涉及如在本发明中进ー步详述的其他结合试剂。将关于特定实施例并參照某些图来描述本发明，但是本发明不限于该特定实施例和图而是只限于权利要求。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。所描述的图只是示意性的而不是限制性的。在图中，ー些要素的尺寸可能是夸张的并且出于说明性目的没有按比例绘制。当在本说明书和权利要求中使用术语“包括”吋，其不排除其他要素或者步骤。在提及单数，例如“一”或者“ー个”、“所述”而使用不定或者定冠词吋，除非另外明确声明，否则这包括那ー单数的复数。此外，在说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等等用于区分类似要素，并且不必然描述顺序或者时间次序。将理解的是如此使用的术语在适当的情况下是可互換的，并且在本文中描述的本发明的实施例能够以除了本文中描述或者图示之外的其他順序工作。以下术语或者定义只是被提供用于帮助理解本发明。这些定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。在本发明上下文中的“区域”涉及反应腔室的一部分或者涉及整个反应腔室，其中在分析物/示踪结合试剂复合物与捕获结合试剂的相互作用期间存在磁性标记示踪结合试齐LU在本发明上下文中的“反应腔室”涉及设备或者盒体的一部分，其中发生示踪结合试剂(典型为抗体)、分析物、以及捕获结合试剂(典型为抗体)之间的复合物形成。反应腔室的固定捕获结合试剂的部分被称为“反应表面”。该反应腔室典型地是样本应用区(入 ロ)和出口之间的通道的一部分，例如毛細管的加宽部分。通常，反应腔室具有固定捕获结合试剂的至少ー个平坦表面。除了以上复合物的形成，该反应腔室主要也用于检测这种复合物的形成并且也起“检测腔室”的作用。当使用光学装置来检测吋，该反应腔室包含至少 ー个透光部分。对于大部分的商业应用，反应腔室集成在盒体中，该盒体是可以插入到包括毛細管的设备中的単元，以递送和移除样本流体，冲洗流体和缓冲流体。该盒体典型地也包括物件，例如干燥试剂(溶解剂)和缓冲液以及过滤器以从样本中移除微粒物质。在本发明中使用的盒体包括具有分隔区域的至少ー个反应腔室或者至少两个分隔的反应腔室。当使用具有不同区的一个反应腔室吋，分隔意味着不能将示踪结合试剂(典型的是抗体)从该反应腔室的一个区操纵至该反应腔室中的另一区。当使用具有不同区的一个反应腔室吋，“分隔”意味着不能将示踪结合试剂(典型是抗体)从ー个反应腔室操纵至其他反应腔室中。然而，反应腔室可以用于进行复用測定，其中将针对不同分析物的不同示踪结合试剂放置在不同的反应表面处，并具有附帯条件当使用一个反应腔室吋，如本发明所描述的针对同一分析物上的不同结合位点的不同示踪结合试剂(51,5 不在同一区域内，或者在使用不同反应腔室的情况下，该不同示踪结合试剂(51，52)不在同一反应腔室内。“夹心測定”涉及众所周知的结合测定类型，其中经由针对分析物的第一表位的抗体将分析物固定至表面，并且利用针对这一分析物的第二表位的抗体来检测该分析物，其中这ー第二抗体携载可检测的标记物。“结合试剂”涉及与分析物的一部分特异性结合的基团。典型的例子是与蛋白质的表位结合的抗体或者其片段(Fab，Fab (2), scFv)。这种抗体典型地是单克隆抗体，虽然被制备为针对表位的多克隆抗体也是同样适合的。结合试剂的其他例子是适配子、纳米抗体、 亲和体抗运载蛋白(affibodies anticalins)；用于结合到碳水化合物分析物的碳水化合物结合蛋白质，例如凝集素；用于结合到碳水化合物结合蛋白质分析物的碳水化合物；用于结合到DNA-或者RNA-结合蛋白质的寡核苷酸或者多核苷酸；结合到蛋白质分析物的有机分子(例如酶底物或者酶抑制剂，配体或者受体的拮抗剂)；结合到其他肽或者蛋白质的肽、蛋白质或者其一部分(例如多蛋白质复合物的一部分，或者蛋白质配体受体复合物)。在本发明上下文中的“分析物”涉及可以经由将结合试剂结合到该分析物上的结合位点而被检测到的化合物。该分析物典型地是蛋白质，其中该结合位点是所述蛋白质的结合到抗体的表位。该蛋白质分析物可以是单个多肽但是也可以是不同多肽的复合物。因此，在本文中所描述的測定包括针对多亚单位蛋白质复合物的检验，其中例如抗体的结合试剂结合到在这种复合物的不同亚单位上存在的结合位点(在抗体/蛋白质结合的情况下是表位)上。其他分析物包括碳水化合物、复合有机分子例如酶抑制剂、受体结合试剂、激素、药物化合物。“磁性标记物”涉及包括任意形状(典型的为球形)的磁性或者可磁化材料的颗粒，其可以由磁场操纵。在免疫測定中典型使用的磁性颗粒尺寸所具有的直径在大约50到2000nm之间， 具体在大约250到750nm之间，并且更具体地为大约500nm，其可能在利用两种或者更多种示踪结合试剂的结合测定中导致无法预料的问题，该示踪结合试剂例如是被磁性颗粒标记的抗体。在夹心測定中，示踪抗体首先与分析物结合，然后将该分析物和示踪抗体之间的复合物与被固定的捕获抗体接触。在基于磁性颗粒的測定中也遵循这一程序。在本文中示踪抗体由磁性搅拌操纵以允许示踪抗体与分析物的结合。此后，操纵分析物和示踪抗体之间的复合物朝向检测上的捕获抗体。然后，通过应用磁场而将不具有分析物的示踪抗体与捕获抗体移除。分析物的检测发生在其中固定捕获抗体的表面处。结合颗粒的数量与在样本中存在的分析物分子的量有关。使用两种不同示踪结合试剂，例如每种都由磁性颗粒标记的抗体，得到分析物分子被定位在两种磁性颗粒之间的复合物。这种磁性颗粒的尺寸可能阻止分析物与捕获结合试剂的结合。在这种结合没有发生的情况下，分析物-示踪结合试剂复合物也将在测定结束时被拉动远离捕获结合试剂，并且分析物即使存在于样本中也将不能被检测到。本发明的方法和盒体通过以下解决了这一问题，其在同一设备中并行执行不同的结合測定，例如夹心測定，其中在每个測定中只使用一种类型的磁性标记示踪结合试剂 (典型是抗体)。典型的实施例涉及盒体和方法，其中使用四种不同的抗体用于分析物的检測，每种抗体针对不同的表位，其中两种抗体用作被固定在两个反应腔室的每ー个中的捕获抗体，并且两种抗体用作磁性标记示踪抗体，其中每个反应腔室包括两种捕获抗体之一。 这ー观念可以被推广，只要-使用至少ー种捕获结合试剂，以及，-在盒体中存在具有捕获结合试剂的至少分隔的区域，以及(作为两个分隔的反应腔室或者作为具有分隔区域的一个反应腔室)，-使用至少两种磁性标记示踪结合试剂，其中在每个区域中只使用ー种类型的磁性标记结合试剂，从而例如分析物分子可以永远不会如图2所描述的经由两个不同的表位结合到具有磁性标记物的抗体。因此最广义而言，本发明的第一方面涉及ー种用于在结合測定中利用磁性标记物 (3)检测分析物( 的盒体(1)，所述盒体包括针对所述分析物的结合位点的至少ー种捕获结合试剂(4)，并且包括针对所述分析物的另外不同的结合位点的至少两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其特征在于所述盒体包括至少两个反应腔室(61和62)，其中第一反应腔室(61)包括所述至少ー种捕获结合试剂(4)和第一磁性标记示踪物(51)，并且其中第 ニ反应腔室(62)包括所述至少ー种捕获结合试剂(4)和第二磁性标记示踪结合试剂(52)。 该第一区域(61)不包括非该第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂， 并且该第二区域(6 不包括非该第二磁性标记示踪结合试剂(5 的磁性标记示踪结合试剂。当创建专门的区域从而避免了导致如图2所描绘的不期望的桥接复合物的分析物分子与两种示踪结合试剂(51)和(5 的相互作用吋，在本发明中描述的盒体和方法可以在ー个并且相同的反应腔室中执行。这在图3的例子中图示，其中应用磁性标记示踪结合试剂并且将其在盒体的分隔区域上干燥。只要液体进入该盒体并且磁性颗粒重新悬浮， 那么应用磁场从而保持该磁性颗粒固定或者操纵该磁性颗粒在基本垂直方向上(由图3中的箭头ζ指示)朝向以及远离盒体中相对侧上的捕获结合试剂。磁性颗粒的垂直操纵避免了磁性标记示踪结合试剂(51)和(52)彼此接触，并且避免了结合到磁性标记示踪结合试剂(51)的分析物能够另外地结合到磁性标记示踪结合试剂(52)，反之亦然。在具体实施例中，所述区域(61)和阳2)是单独的反应腔室。在另一具体实施例中，所述结合试剂是抗体。将用实施例来说明这种盒体的进ー步细节，其中该盒体包括两个反应腔室(61和 62)，其具有针对分析物的两个不同表位的两种捕获抗体(41和42)，以及两种示踪抗体(51 和52)，所述两种示踪抗体具有针对所述分析物上的两个另外的表位的磁性标记物。使用现有技术中已知的用于将蛋白质固定至诸如塑料、玻璃、陶瓷和金属的表面的技木，来将捕获抗体固定至反应腔室的表面。在具体实施例中，可使用例如硫醇敏感连接剂来逆转反应表面和捕获抗体之间的结合。该盒体还包括针对所述分析物的另外两个不同表位的两种磁性标记示踪抗体(51 和52)。现有技术中将蛋白质与磁性颗粒结合的方法是众所周知的。通常，ー个磁性颗粒将在其表面携载不同的抗体分子，但是可以调整反应条件以控制结合到单ー颗粒的抗体的数量，以最终获得每颗粒ー个抗体的比率。在现有技术中已经描述了不同类型的磁性颗粒，其形状和材料不同。针对本发明所描述的方法，典型地使用具有在大约50到2000nm之间，具体在大约250到750nm之间，以及更具体地为大约500nm的直径的磁性颗粒。在第一实例中该磁性颗粒用于在磁场中操纵被附着的示踪抗体。任选地，颗粒的磁特性也可以用于检测该颗粒。可选地，磁性颗粒的检测基于光学特性，例如颗粒本身的尺寸(例如，在FHR(受抑全内反射)中测量的)或者通过在磁性颗粒中添加发色基团(例如，包括磁性材料的荧光聚苯乙烯颗粒)。该盒体包括用于分析物(2)的检测的两个反应腔室(61和62)。然而，该盒体可以包含用于其他分析物的检测的另外的反应腔室。该第一反应腔室(61)包括针对分析物的不同表位的所述两种捕获抗体(41和42)，和结合到抗体上的另外(第三)表位的第一磁性标记示踪抗体(51)。该第二反应腔室(6 包括以上提及的两种捕获抗体(41和42)，和结合到抗体上的又另外(第四)表位的第二磁性标记示踪抗体(52)。在具体实施例中，在使用盒体之前将该示踪抗体应用于反应腔室中。例如，将该示踪抗体应用于反应腔室的远离捕获抗体的部分的缓冲区(buffer)中并且将其干燥。当将样本液体引入反应缓冲区中吋，该示踪抗体溶解并且被再分散。在可选实施例中，在样本进入反应腔室之前，该示踪抗体与样本接触。这典型地在于样本入口和反应腔室之间的通道中供应示踪抗体时发生。显而易见的是在这种配置中， 以如此方式设计该通道从而ー种类型的示踪抗体只能够移动进入ー个反应腔室中。当具有分析物的样本进入通道吋，该示踪抗体将被溶解，然后将作为与分析物的复合物进入反应腔室，或者在所有的分析物都被结合或不存在分析物的情况下作为示踪抗体进入反应腔室。在以上描述的盒体中，将不会发生分析物与每个都结合有磁性颗粒的两种不同抗体的桥接复合。分析物分子将只携载ー种磁性颗粒。在本发明中描述的设备和方法可应用于需要使用不同示踪结合试剂的任何类型的分析物。需要不同示踪结合试剂例如抗体的原因可能是不同的，并且包括转译后修饰 (例如，磷酸化、糖基化)中的差別、蛋白质水解降解或者加工、与阻止诸如抗体的示踪结合试剂结合到分析物的其他成分的复合物形成，以及分析物表位的构象改变。在具体实施例中，该分析物是肌钙蛋白。这ー蛋白质是多亚基蛋白质，其一方面包括形成不同的复合物，该复合物可相对于抗体遮盖表位，并且另一方面在收集血液样本之后该蛋白质易于蛋白质水解降解。血液中的心肌肌钙蛋白-I(cTnl)和心肌肌钙蛋白-T(cTnT)是心脏細胞死亡的指示，并且用于急性心肌梗塞(AMI)、不稳定型心绞痛、术后心肌损伤以及与心脏肌肉损伤有关的其他疾病的诊断。图7中示出了心肌肌钙蛋白-I (cTnl)的结构。该分子的中间部分(AA30-109)是很稳定的，但是具有自身抗体结合到该分子的可能性。该分子的一些其他位点可以被可存在于血液样本中的肝素(抗凝剂)遮盖。该分子的最外面区域(AA 1- 和AA 110-209) 示出较少的干扰，但是其倾向于更不稳定并且在某些情况下被切断。Ser22和Ser23的磷酸化的差异或者CysSO和Cys97的氧化状态的差异可以进ー步影响抗体结合。所有的这些对 TcnI分析物的修饰能够阻止示踪抗体结合到颗粒上，并且因而导致错误的检验結果，然而， 在一个并且相同的反应腔室中使用结合到肌钙蛋白结合的具有磁性颗粒的不同示踪抗体可能产生以上描述的桥接问题，并且阻止导致假阴性结果的分析物与捕获抗体的结合。在分隔的反应腔室中使用不同的磁性标记示踪抗体解决了这ー问题。本发明的另一方面涉及ー种使用磁性标记示踪结合试剂用结合測定来检测样本中的分析物O)的方法。这ー方法包括步骤-a)提供具有至少两个区域(61和62)的盒体(1)，其中将针对所述分析物的结合位点的捕获结合试剂固定在所述区域(61和6 的表面上，-b)在所述第一区域(61)中提供分析物与第一磁性标记示踪结合试剂的复合物， 该第一磁性标记示踪结合试剂针对所述分析物(51)的另外的结合位点，-c)在所述第二区域(6 中提供分析物与第二磁性标记示踪结合试剂(5 的复合物，该第二磁性标记示踪结合试剂(5 针对所述分析物的又另外的结合位点，-d)允许步骤b)和C)中的复合物与所述区域中的捕获结合试剂(4)结合，-e)检测步骤b)和C)中的复合物到该捕获结合试剂的结合，其中在所述方法中该第一区域(61)不包括非该第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂，以及该第二区域(6 不包括非该第二磁性标记示踪结合试剂(5 的磁性标记示踪结合试剂。在具体实施例中，所述区域(61)和阳2)是反应腔室。在另一具体实施例中所述结合试剂是抗体。如以上针对盒体所说明的，将针对其中使用两种不同的捕获抗体(41和42)以及两种不同的磁性标记示踪抗体(51和52)的实施例来详细描述该方法。这ー方法包括以下步骤-提供具有两个反应腔室(61和62)的盒体(1)，其中将针对所述分析物的两个不同表位的两种捕获抗体(41和42)固定在所述反应腔室(61和62)的表面上。在上文中描述了这一反应腔室的细节。现有技术中将抗体应用并固定在表面上的方法是众所周知的。-在所述第一反应腔室(61)中提供分析物与第一磁性标记示踪抗体(51)的复合物，并且在所述第二反应腔室(6 中提供分析物与第二磁性标记示踪抗体(5 的复合物。 这种复合物可在反应腔室之外形成，例如在处理样本时或者通过在样本应用和反应腔室之间的流体通道中提供该示踪抗体。在具体实施例中，在盒体的制造期间在反应之内应用示踪抗体，从而在将样本流体引入反应腔室时可以形成与分析物的复合物。通过颗粒的磁性致动而便于该复合物的形成。-允许步骤b)和C)中的复合物与所述反应腔室中的捕获抗体相结合。在以上提及的致动期间或者之后，将磁性颗粒朝向捕获抗体所位于的表面操纵。在这ー结合步骤的最后，远离该捕获抗体的方向施加磁场以移除未结合的示踪抗体。-检测示踪抗体和分析物到捕获抗体的结合。这ー检测可以通过测量颗粒的可检测特性来完成，例如检测磁性材料的电特性的磁性，使用光学技术例如光散射，更具体的 FTIR，来检测颗粒的存在，或者检测发色基团(例如，荧光)的存在，该发色基团可存在于该磁性颗粒之内。该检测典型地在反应腔室之内固定捕获抗体的表面上发生。然而，可选实施例设想在反应腔室的外部收集和測量磁性颗粒(例如在变性情况或者其中例如捕获抗体结合到表面涉及ニ硫键减少的情况之后)。可以调整以上方法以包括对夹心測定、微流体设备、致动方法，以及检测方法的修改，并具有附帯条件在根据本发明的方法中，第一区域(61)不包括第二磁性标记示踪抗体(52)，并且其中第二区域(6 不包括第一磁性标记示踪抗体(51)。在生物传感器中的实施对用户而言可以是显然的，可以使用算法来組合来自两个腔室或者区域中的信号，并且可以只将最终结果显示给用户。将本发明具体化的系统和方法的其他布置对于本领域技术人员而言将是显而易见的。将理解的是虽然在本文中针对根据本发明的设备论述了优选实施例、特定构造和配置以及材料，但是可以在形式和细节中作出各种变化或修改而不脱离本发明的范围和精神。例子例1.心肌肌钙蛋白I(cTnl)的检测以下针对cTnl的情况图示了在本发明中描述的方法的原理，其中使用针对稳定区域[S]的两种抗体(Ab-Sl (51)和AbS2Gl))以及针对该分子的不稳定区域[US]的两种抗体(US-Abl (52)和US-Ab2(42))。在每个反应腔室中只存在结合到该靶分子的一个表位的示踪抗体，因而不可能发生分析物分子与两种磁性颗粒的复合。由于在传感器的表面上存在针对分子的稳定部分和针对分子的不稳定部分的捕获抗体两者，因此这ー測定仍然具有鲁棒的特性。在存在自身抗体(其遮挡该分子的稳定部分的结合位点)的情况下，腔室中的颗粒仍然可以结合到传感器表面上的US-Ab2 (42)。在无法获得分子的较不稳定区域的情况下，仍然可以结合腔室中的示踪抗体。在图5所描绘的形式中，反应表面包含两种捕获抗体类型的組合。在磁性标记物測定中使用的血液样本的体积(大约20μ1)足够大以将样本分在 2个腔室中而不用额外地措施来执行这一測定。在不同腔室中可以用具有针对其他靶的抗体的其他磁性颗粒来执行复用，因为那些颗粒之间的桥接是不可能的。用于C肌钙蛋白I的各种抗体可从例如芬兰的Hytest商业获得。两种捕获抗体和两种示踪抗体的組合已经由Hytest描述，并且包括以下組合。
权利要求
1.一种用于在结合測定中利用磁性标记物C3)检测分析物O)的盒体(1)，所述盒体包括针对所述分析物上的结合位点的至少ー种捕获结合试剂(4)，并且包括针对所述分析物上的另外不同的结合位点的至少两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其特征在干，所述盒体包括至少两个区域(61和62)，其中，第一区域(61)包括所述至少ー种捕获结合试剂 (4)和第一磁性标记示踪结合试剂(51)，并且其中，第二区域(62)包括至少ー种捕获结合试剂(4)和第二磁性标记示踪结合试剂(52，)其中，所述第一区域(61)不包括非所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂，并且其中，所述第二区域(6 不包括非所述第二磁性标记示踪结合试剂(5 的磁性标记示踪结合试剂。
2.如权利要求1所述的盒体，包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，其中，所述第一区域(61)包含所述第一捕获结合试剂Gl)和所述第一示踪结合试剂(51)，并且其中，所述第二区域(6 包含所述第二捕获结合试剂0 和所述第二示踪结合试剂(52)。
3.如权利要求1或2所述的盒体，包括针对所述分析物上的两个不同结合位点的两种捕获结合试剂(41和42)，并且包括针对所述分析物上的另外两个不同的结合位点的两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其中，所述盒体包括两个区域(61和62)，其中，第一区域(61)包括所述第一和第二捕获结合试剂(41和4 和所述第一磁性标记示踪结合试剂 (51)，并且其中，所述第二区域(6 包括所述第一和第二捕获结合试剂(41和4 和所述第二磁性标记示踪结合试剂(52)。
4.如权利要求1-3中任ー项所述的盒体，其中，所述结合试剂是抗体。
5.如权利要求1-4中任ー项所述的盒体，其中，所述区域是反应腔室。
6.如权利要求1-5中任ー项所述的盒体，其中，所述分析物是肌钙蛋白。
7.如权利要求1-6中任ー项所述的盒体，其中，所述分析物是心肌肌钙蛋白I(cTnl)。
8.ー种使用磁性标记示踪结合试剂利用结合測定来检测样本中的分析物O)的方法， 所述方法包括步骤-a)提供具有至少两个区域(61和62)的盒体O)，其中，将针对所述分析物上的结合位点的捕获结合试剂固定在所述区域(61和6 的表面上，-b)在所述第一区域(61)中提供所述分析物与第一磁性标记示踪结合试剂(51)的复合物，所述第一磁性标记示踪结合试剂针对所述分析物上的另外的结合位点，-c)在所述第二区域(6 中提供所述分析物与第二磁性标记示踪结合试剂(5 的复合物，所述第二磁性标记示踪结合试剂针对所述分析物上的又另外的结合位点， -d)允许步骤b)和c)中的所述复合物与所述区域中的所述捕获结合试剂结合， -e)检测步骤b)和c)中的所述复合物到所述捕获结合试剂的结合，其中，在所述方法中所述第一区域(61)不包括非所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂，以及所述第二区域(6 不包括非所述第二磁性标记示踪结合试剂(5 的磁性标记示踪结合试剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述结合试剂是抗体。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述区域是反应腔室。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述分析物是肌钙蛋白。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，所述分析物是心肌肌钙蛋白I (cTnl)，并且其中，示踪抗体和捕获抗体(51)结合到cTnl的稳定区域上的不同表位，并且，其中，示踪抗体0 和捕获抗体(5 结合到肌钙蛋白的不稳定区域上的不同表位。
13.一种用于使用磁性致动来执行结合測定的设备，包括如权利要求1所述的盒体。
14.ー种试剂盒，包括结合到同一分析物上的不同结合位点的至少三种不同的结合试剂，其中，所述结合试剂中的至少两种用磁性颗粒标记，并且其中，所述结合试剂中的至少 ー种不用磁性颗粒标记。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其中，所述分析物是心肌肌钙蛋白，并且其中，第一未标记抗体和第一磁性标记抗体结合到肌钙蛋白的稳定区域上的不同表位，并且，其中，第二未标记抗体和第二磁性标记抗体结合到肌钙蛋白的不稳定区域上的不同表位。
全文摘要
本发明涉及一种用于在结合测定中利用磁性标记物(3)检测分析物(2)的盒体(1)，所述盒体包括针对所述分析物上的结合位点的至少一种捕获结合试剂(4)，并且包括针对所述分析物上的另外不同的结合位点的至少两种磁性标记示踪结合试剂(51和52)，其特征在于所述盒体包括至少两个区域(61和62)，其中第一区域(61)包括所述至少一种捕获结合试剂(4)和第一磁性标记示踪结合试剂(51)，并且其中第二区域(62)包括至少一种捕获结合试剂(4)和第二磁性标记示踪结合试剂(52)。在本文中所述第一区域(61)不包括非所述第一磁性标记示踪结合试剂(51)的磁性标记示踪结合试剂，并且其中所述第二区域(62)不包括非所述第二磁性标记示踪结合试剂(52)的磁性标记示踪结合试剂。
文档编号G01N33/543GK102597774SQ201080047534
公开日2012年7月18日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月23日
发明者J·H·尼乌文赫伊斯, T·H·埃弗斯 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司