专利名称：羊膜内感染的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及用诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的试验。本发明进ー步涉及试验、诊断算法、生物标记、材料、方法及装置，它们与用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的生物标的用途有关并且为此类诊断提供诊断性试验系统，和如本文所述的多种其他实施方案。
背景技术：
早产是生命头ー个月中死亡的主导原因并且在超过三分之一全部婴儿死亡案例中是助长原因。羊膜内感染(IAI)是妊娠不足37周时特发性早产的主导原因之一。与早产(preterm birth)相关的其他病状包括未足月分娩(preterm labor)、早产胎膜破裂、先兆子痫、陡变、前置胎盘、胎儿生长迟缓、羊膜液体积过多或不足、胎儿畸形、子宮内出血、糖 尿病、药物滥用和应激。未足月分娩和早产的控制措施可以包括用抗分娩剂(tocolyticagent)治疗和视病情用促进胎儿肺成熟的皮质类固醇治疗。对于B组链球菌覆盖率待定的阴性培养结果，可以开具窄谱抗生素。IAI是特发性未足月分娩和早产的最重要病因之一。IAI是羊膜腔的微生物性侵入并且在10-15%全部未足月分娩病例中发生。(Newton ER. Clin Obstet Gynecol1993;36(4):795-808 ；ffatts DH 等人，Obstet Gynecol 1992;79:351-7 ；Romero R 等人，Am J Obstet Gynecol 1993;169:805-16 ;HilIier SL 等人，Obstet Gynecol1993;81:941-8)。用来描述伴有或不伴有完整胎膜的IAI的其他术语包括羊膜液感染、羊膜炎和临床绒毛膜羊膜炎。除IAI作为未足月分娩的ー个病因之外，IAI还与增加的新生儿发病率和死亡率相关，特别在未足月的初生婴儿当中是如此。通常，已经在患有IAI的母亲产下的低出生体重初生婴儿当中观察到3至4倍围产期死亡率増加。还存在呼吸窘迫综合征、心室内出血和新生儿败血症的增加。(Morales, ff. J. Obstetrics和Gynecology70:183,1987)。IAI已经独立地牵涉新生儿脑室周围白质软化病和脑瘫；大脑白质损伤和脑_的风险在 IAI 的背景下大9倍。(Bejar,R.等人,Am. J. Obstet. Gynecol. 159:357,1988 ；Grether, J. K.和 Nelson, K. B. JAMA278:207,1997)。大部分IAI病例(80%至90%)是亚临床的(无症状的)，而不是未足月分娩。目前，特发性未足月分娩的控制措施包括观察、用抗分娩剂治疗和可能通过羊膜腔穿刺术证实IAI。単独的羊膜液培养低估IAI的真实患病率，原因是存在不可培养的微生物、难以分离苛养性微生物和既往抗生素疗法(Romero, R.等人，Am. J. Obstet. Gynecol. 161:817,1989)。本发明的阳性IAI试验将为临床医生可用的当前诊断及治疗方案提供有用辅助。IAI的精确诊断对于用祀向抗生素(targeted antibiotics)恰当治疗母体、保持抗分娩疗法(其在IAI中是禁忌)以及预定母体的分娩地点和必要的婴儿护理水平是重要的，其中所述婴儿可能因IAI的过度后果而是非常未足月的并且患病。本发明的阴性IAI试验提供这样的再保证未足月分娩的病因学可能来自感染之外的来源。阴性试验，连同其他体征和/或症状的30种观察结果，允许医师治疗未足月分娩。发病机理和风险因素羊膜内感染可能因下牛殖道微牛物的上行感染而发牛。IAI的患病率与孕龄强烈地反相关。(Watts DH等人，Obstet Gynecol 1992; 79:351-7) 从10-20%具有完整羊膜、没有IAI临床体征的全部未足月分娩妇女的羊膜液中(RomeroR等人，Ann N Y Acad Sci 1991; 622:355-75)和在至多到67%在妊娠第23-24周终结怀孕的未足月分娩妇女中回收下生埴道 天然具有的细菌。(Watts DH等人，Obstet Gynecol1992;79:351-7)。另外，这些观察结果得到组织学绒毛膜羊膜炎支持，其中已经在60-90%第20和24周之间终结的妊娠中发现所述组织学绒毛膜羊膜炎。这些观察结果支持这样的假设=IAI是特发性未足月分娩的重要病因，尤其在早期孕龄时。诊断=IAI的早期诊断可能允许及时的治疗和介入。然而，在形成正确诊断方面存在诸多难题。从临床观点看，早期诊断存在问题，因为IAI的临床体征和症状在感染期晩期出现，并且是常见和非特异性的。常用来诊断IAI的临床标准包括未足月分娩伴随母体发热(彡37.8°C )，连同以下项中两项或更多项母体白细胞增多(彡15，000/mm3)、母体或胎儿心动过速、子宫压痛或腐臭味羊膜液。(Gibbs RS等人，Am J Obstet Gynecol1980; 136 (6) :709-13)。在Watts等人对未足月分娩妇女的研究中，具有或不具有阳性羊膜液培养的妇女之间在平均最高母体温度、WBC计数和鉴别方面没有差异。亚临床IAI是用来描述下述IAI的术语，在所述IAI中体征和症状在大约88%具有阳性羊膜液培养的病例中最少或不存在。(Watts DH等人，Obstet Gynecoll992; 79:351-7)。亚临床IAI的概念进一歩由Gravett等人使用非人灵长类模型时的研究结果确证。这些研究者证明，在用B组链球菌引起的实验性IAI后，发热和白细胞增多仅在感染引起的未足月分娩发作的50%时间存在，所述的发作在实验性感染后28至40小时出现。(Gravett MG等人，Am J ObstetGynecol 1994;171 (6):1660-7)。因为临床特征的不一致性，已经其他辅助性实验室试验来帮助诊断IAI。这些试验包括測量母体C反应蛋白、直接对羊膜液检查白细胞或在革兰氏染色时检查细菌、羊膜液培养、測量羊膜液的葡萄糖浓度、检测羊膜液的白细胞酯酶、通过气-液相色谱检测细菌有机酸、測量多种羊膜液的细胞因子(例如，白介素2、4、6、粒细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子-α )、基质金属蛋白酶-9、乳铁蛋白和铜鼓超声波扫描术评估胎儿活动性(生物物理图谱)。细胞因子或其他生物化学因子的測量是昂贵的，通常在临床上不可用，并且主要作为研究工具。另外，这些试验的检验效率并不总是比更容易获得的传统试验如羊膜液革兰氏染色和培养、羊膜液的葡萄糖浓度和检测羊膜液的白细胞酯酶好。先前已经回顾了这些试验的效率。(Ohlsson, A.和 Wang, E. :An analysis of antenatal tests to detectinfection at preterm rupture of the membranes. American Journal of Obstetricsand Gynecology 162:809，1990)。虽然它们均具有合理的灵敏度、特异性和预示值，但是若在诊断IAI时不依赖于临床特征而利用吋，则没有ー个试验是足够灵敏或特异的。因此，迫切需要允许早期和精确诊断的IAI新方法。发明概述本发明涉及用诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的试验。本发明进一步涉及可以用于非侵入性诊断羊膜内感染(IAI)的生物标记和生物标记集合或组合基团的鉴定和检测，和使用此类生物标记的诊断测定法，包括基于使用三种蛋白质生物标记的独特组合诊断孕妇中羊膜内感染(IAI)和/或评估其风险的非侵入性试验。本发明一般地涉及用来创建实验室开发的羊膜内感染试验和体外诊断装置的材料和方法并且涉及在IAI的诊断中具有临床用途的生物标记。具体而言，本发明涉及用来创建体外诊断装置以通过分析生物学样 品(如从孕妇获得的宫颈阴道液(CVF))诊断IAI或评估其风险的材料和方法。特别地，本发明涉及生物标记，其中所述生物标记具有利用一种基于宫颈阴道棉拭子的非侵入性免疫诊断试验以高的准确度预测IAI存在的能力，尤其与诊断算法组合使用吋。与诊断算法联合使用时，这种独特的标记组合具有利用一种基于宫颈阴道棉拭子的非侵入性免疫诊断试验以高的准确度预测IAI存在的能力。在一个实施方案中，本发明提供新的生物标记组，其中所述生物标记组可以被测量并且用来确定IAI在怀孕雌性哺乳动物受试者中的存在或不存在。在ー个方面，本发明提供用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，本发明的方法包括測量所述蛋白质中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部的丰度。在ー个方面，本发明提供用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β _2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述样品中的每个所述水平相对于所述蛋白质中每一者在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，受试者是人患者。在某些实施方案中，本发明的方法包括測量所述蛋白质中至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种或全部的水平。在一个实施方案中，测量的生物标记包括生长调节的癌基因a (GRO-a)和巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)。在另ー个实施方案中，测量的生物标记包括生长调节的癌基因a (GRO-a)和α-I-酸性糖蛋白(AlAG)。在又一个实施方案中，测量的生物标记包括α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)。在这些实施方案中，测量的其他生物标记可以包括α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和/或金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。在其他实施方案中，测量的生物标记可以包括IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)和生长调节的癌基因a (GRO-a)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶_1组织抑制剂0 ΜΡ1)和巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括金属蛋白酶-I组织抑制剂(TIMP-I)和α-I-酸性糖蛋白(AlAG)。在这些实施方案中，测量的其他生物标记可以包括白介素_6(IL-6)。在某些实施方案中，测量的生物标记包括α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL_6)和巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb) 0在某些实施方案中，测量的生物标记包括白介素-6(IL-6)、α-l-酸性糖蛋白(A1AG)、脂多糖结合蛋白(LBP)、生长调节的癌基因a (GRO-a)和 α -甲胎蛋白(AFP)。在一个实施方案中，本发明的方法包括測量选自巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)中的两种或更多种蛋白质的蛋白质的水平，并且如果在宫颈-阴道液样品中，所检定的蛋白质的两种或更多种相对于正常宫颈-阴道液显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明的方法包括測量选自巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α -I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)的两种或更多种蛋白质中每一者的水平，并且如果在宫颈-阴道液样品中，所检定的蛋白质的两种或更多种中每ー者的水平相对于正常宫颈-阴道液中相应的蛋白质水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，本发明的方法包括如果在宫颈-阴道液样品中，全部所述检定的蛋白质的水平相对于所述蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在全部实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以由免疫測定法測定。在某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用蛋白质阵列測定。在某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用免疫色谱试验装置測定。在使用免疫色谱试验装置的某些实施方案中，本文中鉴定的蛋白质的水平可以使用包括一个或多个色谱测试条的免疫色谱试验装置測定。在使用免疫色谱试验装置的某些实施方案中，免疫色谱试验装置是横向流装置。 在某些实施方案中，本发明提供了ー种免疫色谱试验装置，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的两个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-l-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂( ΜΡ-1)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置包含测试条，所述测试条包含针对两种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。在某些实施方案中，本发明提供ー种免疫色谱试验装置，其包含用于检测三种或更多种蛋白质的三个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α -I-酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)、IGF结合蛋白-1 (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-I (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)。在实施方案中，所述免疫色谱试验装置包含测试条，所述测试条包含针对三种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α -I-酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL_6)、IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I) 0在实 施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。在另ー个方面，本发明提供一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)从所述受试者获得宫颈-阴道液样品；(b)相对于两种或更多种蛋白质中每一者在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，确定所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β _2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和如果确定所述两种或更多种蛋白质中每ー者在所述样品中的相应水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在另ー个方面，本发明提供ー种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂( ΜΡ-1);和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，所述体征和症状包括，但不限于母体发热(彡37. 8°C )、母体白细胞增多(彡15，000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。在另ー个方面，本发明提供ー种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，所述方法包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平或相对于所述两种或更多种蛋白质在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，測量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α _1_酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂( ΜΡ-1)；和(b)如果确定所述两种或更多种蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所·述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，所述体征和症状包括，但不限于母体发热(>37.8°C)、母体白细胞增多(> 15，000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。在ー个方面，本发明涉及一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，所述方法包括(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的水平；和(b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-I在所述样品中的每个所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-I在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-I中每ー者在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在一个实施方案中，受试者是人患者。在另ー个实施方案中，使用适应于确定蛋白质水平的装置，进行检定。在又一个实施方案中，通过使用由合适处理器执行的软件程序，进行检定。在又一个实施方案中，该程序体现于有形介质上存储的软件中。仍在另一个实施方案中，有形介质选自闪盘、⑶-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。在ー个不同实施方案中，所述方法还包括准备ー份记录所述检定或诊断结果的报告的步骤，其中所述报告可以记录或存储在有形介质上，如纸、闪盘、CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。在另ー个实施方案中，所述方法还包括将所述诊断的结果传达至利益方，例如患者或主治医师的步骤。在多个实施方案中，所述传达以书面、通过电子邮件或电话进行。在又一个实施方案中，通过免疫測定法确定蛋白质水平。在又一个实施方案中，通过免疫測定法确定蛋白质水平，所述免疫色谱试验可以使用横向流装置。在另外其他实施方案中，通过质谱法或通过使用蛋白质阵列确定蛋白质水平。在另ー个方面，本发明涉及ー种免疫測定试剂盒，其包含用于检测α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的抗体和试剂。
在又ー个方面，本发明涉及ー种免疫色谱试验装置，其包含用于用于检测α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-I(IGFBP-I)的ー个或多个色谱条。在一个实施方案中，在免疫色谱试验装置中，所述测试条或多个测试条包含针对α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的抗体。在另ー个实施方案中，所述免疫色谱试验装置是横向流装置。在又ー个方面，本发明涉及ー份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的水平；和(b)如果确定所述水平相对于正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在又ー个方面，本发明涉及ー份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的水平；和(b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-I的每个所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-I在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-I在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在又ー个方面，本发明涉及有形介质，其存储基于下述试验的结果和/或诊断，所述试验包括(a)检定从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中α-甲胎蛋白、白介素-6 (IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的水平；和(b)如果确定所述水平相对于正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在某些实施方案中，使用适应于确定所述蛋白质的水平的装置，进行测量。在又一个实施方案中，通过使用由合适处理器执行的软件程序，进行测量。在某些实施方案中，该程序体现于有形介质上存储的软件中。仍在某些其他实施方案中，有形介质选自CD-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。在某些实施方案中，本发明的方法还包括准备ー份记录所述检定或诊断的结果的报告的步骤。在一个实施方案中，该报告记录或存储在有形介质上。在具体实施方案中，有 形介质是纸。在另ー个实施方案中，有形介质选自、⑶-ROM、软盘、硬盘、DVD和与处理器连接的存储器。在某些其他实施方案中，本发明的方法还包括将所述诊断的结果传达至利益方的步骤。在一个实施方案中，利益方是患者或主治医师。在另ー个实施方案中，所述传达以书面、通过电子邮件或电话进行。在另ー个方面，本发明提供ー种免疫測定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。在一个实施方案中，该免疫測定试剂盒包含用于检测本文中鉴定的全部蛋白质的抗体和试剂。在另ー个方面，本发明提供ー种免疫測定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β-2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I) 0在ー个实施方案中，该免疫測定试剂盒包含用于检测本文中鉴定的全部蛋白质的抗体和试剂。在又ー个方面，本发明提供ー种免疫測定试剂盒，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白 (AlAG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。在另ー个方面，本发明提供ー份包含基于下述试验的结果和/或诊断的报告，所述试验包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。在另ー个方面，本发明提供有形介质，其存储基于下述试验的结果和/或诊断，所述试验包括(a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和(b)如果确定所述水平相对于所述正常宫颈-阴道液中的水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。附图简述图I描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中GROa (测定法I)的自然対数值。图2描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MIPlb的自然対数值。
图3描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中MCP-I的自然対数值。图4描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中B2MG的自然对数值。图5描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中 ΜΡ-1的自然対数值。
图6描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中AlAG的自然对数值。图7描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中IL_6的自然对数值。图8显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中LBP的自然対数值。图9描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中AFP的自然对数值。
图10描述箱线图，其显示IAI感染患者(n=14)与未感染患者(n=95)中VCAM-I的自然対数值。图11描述用于预测IAI与非IAI的三标记模型的AUR0C。灵敏度是86%，特异性是 85%。图12描述用于预测IAI与非IAI的五标记模型的AUR0C。灵敏度是x%并且特异
性是y%。图13描述针对复合IAI状态的生物标记Z评分水平O或I。图14描述13图中显示的数据，将所述数据以灵敏度对I-特异性作图，AUROC为O. 86。灵敏度是82%，特异性是85%，PPV是33%并且NPV是98%。图15描述Kaplan-Meier图，其显示由CVF状态和AF感染状态所致的距分娩时间。图16描述针对复合IAI状态的生物标记Z评分水平O或I。图17描述16图中显示的数据，将所述数据以灵敏度对I-特异性作图，AUROC为O. 88。灵敏度是82%，特异性是89%，PPV是41%并且NPV是98%。发明详述定义应当理解，本发明不限于具体的方法或方案，它们当然可以变动。还应当理解本文中所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不g在限制。如本说明书和所附权利要求书中所用，単数形式“ー个(a)”、“ー种(an)”和“该(the) ”的术语，例如，任选包括复数指称，除非上下文另外清楚地说明。因而，例如，对“ー个探针”的指称任选地包括多个探针分子；类似地，根据上下文，术语“ー个核酸”的用途任选地包括，实际而言，包括该核酸分子的众多副本。根据上下文，基因或蛋白质的字母命名可以指基因形式和/或蛋白质形式。通过參考本文中的序列、已知序列和遗传密码，技术人员完全能够联系相关生物学分子的核酸形式和氨基酸形式。除非另外限定，否则本文中所用的技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 第 2 版,J. Wiley&Sons (New York, N. Y. 1994)为本领域技术人员提供了本申请中所用的许多术语的一般指南。术语“对应”和“相应”和语法等同物在本文中用来指类似或相似的物质；例如，当提到蛋白质的两种混合物时，第一混合物中的蛋白质A对应于第二混合物中的蛋白质A，并且是第二混合物中蛋白质A的相应蛋白质；第一混合物中的蛋白质B对应于第二混合物中的蛋白质B，并且是第二混合物中蛋白质B的相应蛋白质；如此类推。术语“蛋白质组”在本文中用来描述在给定时间在生物学样品中的蛋白质的主要部分。蛋白质组的概念与基因组根本不同。基因组实际上是静态的，而蛋白质组应答于内部和外部事件而持续变化。术语“蛋白质组图谱(proteomic profile) ”用来指在给定时间在生物学样品例如生物流体中多种蛋白质的表达模式的表述。蛋白质组图谱可以例如表述为质量谱，但是还包括基于蛋白质的任何物理化学特征或生物化学特征的其他表述。因而蛋白质组图谱可以例如基于蛋白质的电泳特征的差异，如ニ维凝胶电泳例如2-DPAGE所測定，并且可以例如表述为ニ维电泳凝胶中的多个点。差异性表达谱可能具有重要的诊断价值，即使在特异 性鉴定的蛋白质不存在的情况下也是如此。可以随后例如通过免疫印迹法检测到单一蛋白质点，使用蛋白质微阵列检测到多个点或多种蛋白质。蛋白质组图谱一般描述或含有这样的信息，其可能是几个峰至代表50个或更多个峰的复杂图谱。因而，例如，蛋白质组图谱可以含有或代表至少2种、或至少5种或至少10种或至少15种、或至少20种、或至少25种、或至少30种、或至少35种、或至少40种、或至少45种、或至少50种、或至少60种、或至少65种、或至少70种、或至少75种、或至少80种、或至少85种、或至少85种、或至少90种、或至少95种、或至少100种、或至少125种、或至少150种、或至少175种、或至少200种蛋白质。术语“病理学病状”以最广泛的意义使用并且涵盖损害受试者健康的全部变化和现象。母体病理病状包括，而不限于羊膜内感染、胎儿或母体源病状，如例如先兆子痫和未足月分娩和分娩。胎儿病理病状态包括，而不限于染色体缺陷(非整倍性)如Down综合征和在孕龄及胎儿成熟方面的全部异常。术语“[母体或胎儿]病理学病状的状态”在本文中以最广泛的含义使用并且指所述病理学病状的不存在、存在、范围、阶段、本质、进展或消退。术语“独特表达标签”用来描述生物学样品(例如參比样品)的蛋白质组图谱内部的独特的特征或基序，其以统计显著的方式与相应的正常生物学样品(从相同类型来源获得，例如，生物学流体)的蛋白质组图谱不同。术语“羊膜内感染(IAI) ”、“羊膜液感染”、“羊膜炎”、“和〃临床绒毛膜羊膜炎”互換使用，并且指妊娠期间羊膜液和子宮内容物的急性感染，包括，但不限于细菌性急性感染。“患者应答”可以使用显示该患者获益的任何終点来评估，所述终点包括而不限干，(I)抑制病理学病状进展，至少到某种程度，(2)预防该病理学病状、(3)减轻ー种或多种与该病理学病状相关的症状，至少至某种程度；(4)治疗后存活时间长度的增加；和/或
(5)治疗后在给定时间点下降的死亡率。术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止措施，其中目的是防止或减缓(减轻)所指向的病理学状况或病症。需要治疗的那些患者包括已经患有该病症的那些患者以及易于患有该病症的那些患者或待预防该病症的那些患者。
“先天畸形”是非遗传但出生就存在的畸形。如本文所用的任何具体蛋白质名称包括全部片段、前体和天然存在的变体，如可变剪接的和等位变体和同エ型，以及所命名蛋白质的可溶性形式，连同其他物种中的天然序列同源物(包括全部天然存在的变体)。因而，例如，当描述了检定巨噬细胞炎性蛋白I β (Swiss-Prot登录号Ρ13236)的丰度时,这个描述具体地包括检定以Swiss-Prot登录号13236列出的蛋白质的任何片段、前体或天然存在变体，以及该蛋白质的非人类同源物及其天然存在的变体，如果受试者是非人类受试者。迸述 本发明涉及基于母亲或胎儿的生物学流体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入地检定母体和胎儿病状的方法和手段。具体而言，本发明基于蛋白质标记的发现，所述蛋白质标记差异性地存在于IAI患者及对照受试者的样品中，和这种发现在用于确定IAI存在或不存在的方法和试剂盒中的应用。这些蛋白质标记在来自IAI患者的样品中存在的水平与来自非IAI患者的样品中存在的水平不同。因而，存在于试样中的两种或更多种标记与对照相比的量或两种或更多种标记在该试样中的存在或不存在提供了关于该患者的IAI状态方面的有用信息。本发明还涉及基于母亲或胎儿的生物学流体的蛋白质组图谱，早期、可靠和非侵入地检定母体和胎儿病状的方法和手段。具体而言，本发明提供了通过测量从孕妇或胎儿获得的生物学流体如宫颈阴道液(CVF)中的α-甲胎蛋白(α-甲胎蛋白)、白介素-6(IL-6)和胰岛素生长因子结合蛋白-I (IGFBP-I)，早期和可靠检测IAI的诊断试验和预后试验。本发明是进ー步基于这样的发现将受试者体征和症状，例如母体发热(彡37. 80C )、母体白细胞增多(彡15，000/mm3)、母体或胎儿心动过速、子宫压痛或腐臭味羊膜液并入诊断算法可用于确定IAI是否存在或不存在。本发明利用本领域熟知的蛋白质组技术，如在例如以下教材中所述的蛋白质组技术，所述教材的内容在此明确地通过引用方式并入Proteome Research:New Frontiersin Functional Genomics (Principles and Practice), M. R. Wilkins 等人编奢，SpringerVerlag,1007 ；2~D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link 编著，Humana Press,1999 ；Proteome Research:Two-Dimensional Gel Electrophoresis and 丄dentiiicationMethods (Principles and Practice)，T. Rabilloud 编著，Springer Verlag,2000 ；Proteome Research:Mass Spectrometry(Principles and Practice)，P. James 编著，Springer Verlag,2001 ；Introduction to Proteomics，D. C. Liebler 编著，HumanaPress，2002 ;Proteomics in Practice:A Laboratory Manual of Proteome Analysis,R. Westermeier 等人，编著，John Wiley&Sons，2002。本领域技术人员会认出与本文所述的那些方法和材料相似或等同的许多方法和材料，它们可以用于本发明的实施。实际上，本发明无论如何不限于至所述的方法和材料。I.鉴定生物学流体中所表达的蛋白质和多肽根据本发明，可以使用本领域已知的多种方法进行生物学流体的蛋白质组分析。生物学流体包括例如宫颈-阴道液(CVF)、脐带血、新生血清、脑脊液(CSF)、羊膜液、血清、血浆、尿、脑脊液、母乳、粘液、唾液和汗。
一般，比较不同来源的样品(如正常生物学流体(正常样品)和试验生物学流体(试样))的蛋白谱(蛋白质组图)以检测在发病时上调或下调的蛋白质。随后可以将这些蛋白质切下以用于鉴定和充分表征，例如，使用免疫測定法、肽指纹法和/或质谱法和测序方法，或可以将正常和/或疾病特异性蛋白质组图直接用于诊断目的疾病，或用来证实该疾病的存在或不存在。在对比分析中，重要的是以完全相同的方式处理正常样品和试样，目的是正确地描述蛋白质的相对水平或丰度并且获得精确的結果。需要的总蛋白量将取决于所用的分析技术和可以由本领域技术人员轻易地决定。存在于生物学样品中的蛋白质一般根据它们的Pl和分子量的ニ维凝胶电泳(2-DE)分离。使用等电聚焦法(一种ニ维凝胶电泳方法)，蛋白质首先因其电荷而分离。这个步骤可以例如使用可商业获得的固定化PH梯度(IPG)胶条来实施。第二维度是正常SDS-PAGE分析，其中聚焦的IPG胶条用作样品。在2-DE分离后，蛋白质可以用常规染料如考马斯蓝或银染法显现，并且使用已知的技术和设备(例如均可 商业获得的Bio-Rad 10 GS800光密度计和PDQUEST软件)成像。随后将各个点从凝胶中切下、脱色并且进行胰蛋白酶消化。可以通过质谱法(MS)分析肽混合物。或者，可以将肽分离，例如通过毛细管高压液相色谱(HPLC)分离，并且可以通过MS逐一地或以汇集物形式分析。质谱仪由离子源、质量分析仪、离子探測器和数据采集装置組成。首先，在离子源中将肽电离。随后，电离的肽根据它们的质荷比在质量分析仪中分离，并且随后检测分开的离子。质谱法已经广泛地用于蛋白质分析中，尤其自基质辅助激光解吸附电离/时间飞行(MALDI-T0F)和电喷雾电离(ESI)方法的发现起。存在几种形式的质量分析仪，包括例如MALDI-T0F和三重或四极杆-T0F，或与ESI偶联的离子阱质量分析仪。因而，例如，ー种Q-Tof-2质谱仪利用了允许同时检测横跨整个质量谱范围的离子的直交式时间飞行分析仪。对于进一步细节，见，例如，Chemusevich 等人，J. Mass Spectrom. 36:849-865 (2001)。根据需要，可以通过本领域已知的技术如质谱法的某些变型或Edman降解法，測定肽片段的氨基酸序列并且最終测定衍生所述肽片段的蛋白质的氨基酸序列。2.羊膜内感染和相关并发症的早期检测羊膜内感染(IAI)是妊娠期间羊膜液和子宮内容物的急性细菌性感染。前瞻性研究表明，IAI在4%至10%的全部分娩案中发生(Newton, E. R.，Prihoda, T. J.和Gibbs,R. b. :Logistic regression analysis οι risk factors for mtra-amniotic infection.Obstet. Gynecol. 73:571, 1989 ；Soper, D. E.，Mayhal I, C. G.,和 Dalton, H. P. : Riskfactors for intraamniotic infection: a prospective epidemicologic study.American Journal of Obstetrics and Gynecology 161:562,1989 ;以及 Lopez-Zeno,J. A. , Peaceman, A. M. , Adashek, J. A.和 Socol, M. L. :A controlled trial of a programfor the active management of labor. N. Engl. J. Med. 326:450,1992) 用来描述 IAI 的其他术语包括羊膜液感染、羊膜炎和临床绒毛膜羊膜炎。羊膜内感染在临床上通过母体发热、子宫压痛、白细胞增多、和胎儿心动过速诊断并且应当与组织学绒毛膜羊膜炎区分。羊膜内感染是母体和新生儿发病率的重要原因。羊膜内感染占围产期内10-40%的热病发病率并且与20-40%的早期新生儿败血症和肺炎病例相关(Newton, E. R. :Chorioamnionitisand intraamniotic infection. Clin. Obstet. Gynecol. 36:795,1993) 母体菌血症在2-6%的IAI患者中出现，并且产后期感染性发病率是增加。IAI患者当中还存在増加的功能障碍性分娩和剖宫产风险。Duff等人报道了分娩时发生羊膜内感染的患者当中75%的功能障碍性分娩发生率和34%剖宫产的发生率(Duff，P·，Sanders, R.和Gibbs，R. : The course οι labor in term pregnancies with chorioamnionitis. AmericanJournal of Obstetrics and Gynecology 147:391，1983)。羊膜内感染还与增加的新生儿发病率和死亡率相关，特別在未足月的初生婴儿当中是如此。通常，在患有IAI的母亲产下的低出生体重初生婴儿当中存在3至4倍围产期死亡率增加(Gibbs，R. S.，Castillo,Μ. Α.和 Rodgers，P. J. :Management of Acute Chorioamnionitis. American Journal ofObstetrics and Gynecology 136:709,1980 ；Gilstrap, L. C.，III，Leveno, K. J.，Cox,S. M.，Burris，J. S.，Mashburn, M.和 Rosenfeld，C. R. : Intrapartum treatment of acutechorioamnionitis: impact on neonatal sepsis.Am.J. Obstet. Gynecol. :579，1988)。还存在呼吸窘迫综合征、心室内出血和新生儿败血症的增加(Morales，W. J. :The effectof chorioamnionitis on the developmental outcome of preterm infants at oneyear. Obstetrics and Gynecology 70:183,1987)。最近，IAI 已经独立地牵涉新生儿脑室周围白质软化病和脑瘫；大脑白质损伤和脑瘫的风险在羊膜内感染的背景下大9倍(Bejar, R.，Wozniak, P.，Allard，Μ.，Benirschke，Κ.，Vaucher, Y.，Coen, R.，Berry, C.， Schragg，P.，Villegas，I.矛ロ Resnik，R. :Antenatal origin of neurologic damage innewborn infants. I. Preterm infants. Am. J. Obstet. Gynecol. 159: 357，1988 ;Grether，J. K.和 Nelson，K. B. :Maternal infection and cerebral palsy in infants of normalbirth weight. JAMA 278:207,1997)。最后，已经在至少10%具有完整胎膜的发生未足月分娩的妇女中发现亚临床IAI中，这表明IAI是重要的和潜在可预防的早产病因(Romero，R.，Avila, C.，Brekus, C. A.和 Morotti，R. :The role of systemic and intrauterineinfection in preterm parturition. Annuals of the New York Academy of Sciences622:355,1991) o Newton的文献综述显示临床IAI的发生率在小于27周的孕龄时是41%，在27-37周的孕龄时是15%，并且在27-37周的孕龄时是2%(Newton等人，上文)。也已经从10-20%具有完整胎膜、没有羊膜内感染临床体征的全部未足月分娩妇女的羊膜液中(Romero等人，上文)和在至多到67%在第23_24周终结怀孕的未足月分娩妇女中回收下生通道天然具有的细菌(Watts, D. H.，Krohn, Μ. A.，Hillier，S. L 和 Eschenbach，D. A. : The association of occult amniotic fluid infection with gestational ageand neonatal outcome among women in preterm labor. Obstet Gynecol 79:351,1992)。大部分这些患者快速地分娩，并且在许多患者中临床上明显的IAI形成。这些观察結果支持这样的假设递增的起初亚临床的子宮内感染先于未足月分娩并且可能极端未足月分娩的重要原因。 将未足月分娩定义为在完成妊娠第37周之前的出生。在美国，早产的发生率是10-11%全部活胎产，并且正在増加，即便积极治疗未足月分娩。总体上，早产及其后果导致80%不归咎于先天畸形的围产期死亡，并且增加毎年大约50亿美元国民保健预算。早产的风险因素包括非白人种族、幼龄、低下社会经济地位、母体重量低于55kg、未经产、头三个月出血、多胎妊娠(Meis P J，Michielutte R，Peters T J，等人 Factors associated withpreterm birth in Cardiff，Wales:II. Indicated and spontaneous preterm oirth. Am JObstet Gynecol 173:597-602,1995)。不幸地是，对存在自发性早产风险的患者的预测总体上令人失望(Creasy R K，Iams JD.引自 Maternal-Fetal Medicine, Creasy R K, Resnik R(编著)· W. B. SaundersCompany, Philadelphia, Pa.第4版，1999.第498-531页)。在定义存在最大早产风险的群体并且因此可能从早期介入治疗中受益时，先前的工作已经包括风险评定指标、生物化学检测宫颈胎纤连蛋白、超声測量宫颈长度和子宫活动性居家监测。这些方案既昂贵，还受阻于不能准确预测哪些患者可能从早期介入治疗或预防中获益。全部方案均受大约30%不良阳性预示值困扰，其中大部分患者被鉴定“存在足月分娩风险”。介入治疗，包括药理学治疗以抑制宫缩，是有效的，但是取决于早期和可靠的未足月分娩诊断。因此需要可鉴定存在最大早产风险的患者的早期和可靠标记以减少与早产相关的巨大费用和新生儿死亡率和发病率。3.使用生物学流体中的生物标记早期检测和诊断羊膜内感染A)本发明提供ー种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析生物学流体如宫颈-阴道液(CVF)、羊膜液、血清、等离子体、尿、脑脊液、母乳、粘液或唾液来诊断羊·膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供提供ー种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过免疫測定法或ー组免疫測定法诊断羊膜内感染。在一个实施方案中，本发明提供提供ー种早期和可靠的非侵入性方法，用于通过蛋白质组分析CVF来诊断羊膜内感染。通过非限制性实例，本发明提供了用于诊断怀孕雌性受试者中羊膜内感染的方法，所述方法包括检定从所述受试者获得的母体宫颈阴道液样品中ー种或多种蛋白质的水平或量，其中所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。羊膜内感染的诊断可以基于所述蛋白质在定义为IAI阳性的患者试样及不存在IAI的对照试样中的水平、量或丰度的统计显著差异。在某些实施方案中，可以通过受试者的体征和症状并入诊断算法来增强羊膜内感染的诊断。例如，可以在诊断算法中包括掺入这样的体征和症状，它们包括，但不限于母体发热(彡37. 8V )、母体白细胞增多(彡15，000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。表1:IAI的生物标记
登录号「ID|"蛋白原|"SEQ ID NO
P09341 GRO-a生长调节的癌基因aI
P13236 MIPlb巨噬细胞炎性蛋白IP2
P02763 AlAG" α-1-酸性糖蛋白3
Ρ02771 AFPc(-甲胎蛋白权利要求
1.一种用于诊断怀孕雌性哺乳动物受试者中的羊膜内感染的方法，包括 (a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白.1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和 (b)如果确定所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述两种或更多种蛋白质包括α-甲胎蛋白(AFP)和白介素_6 (IL-6)，所述方法还包括测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的水平；和 (b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-I中每ー者在所述样品中的每个所述水平相对于AFP、IL-6和IGFBP-I中每ー者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-I中每ー者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述受试者是人患者。
4.根据权利要求I所述的方法，包括检定所述蛋白质中至少三者的丰度。
5.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，包括检定所述蛋白质中至少四者的丰度。
6.根据权利要求I所述的方法，包括測量选自巨噬细胞炎性蛋白Iβ (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂(TIMP-I)中两种或更多种蛋白质的水平，和如果在宫颈-阴道液样品中，所述两种或更多种选择的蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种选择的蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
7.根据权利要求6所述的方法，包括如果在宫颈-阴道液样品中，全部所述蛋白质在所述样品中的水平相对于所述蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
8.根据权利要求I至7中任一项所述的方法，其中所述水平由包括使用免疫測定法、蛋白质阵列、免疫色谱试验、质谱法或其组合的方法測定。
9.根据权利要求8所述的方法，其中利用了使用横向流装置的免疫色谱试验，測定所述水平。
10.ー种免疫測定试剂盒，包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-I (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)。
11.ー种免疫測定试剂盒，包含用于检测三种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-I (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β _2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。
12.ー种免疫測定试剂盒，包含用于检测两种或更多种蛋白质的抗体和试剂，所述蛋白质选自巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶_1组织抑制剂(TIMP-I)。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的免疫测定试剂盒，包含用于检测全部所述蛋白质的抗体和试剂。
14.ー种免疫測定试剂盒，其包含用于检测α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1 (IGFBP-I)的抗体和试剂。
15.—种免疫色谱试验装置,其包含用于检测α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-1 (IGFBP-I)的ー个或多个色谱条。
16.根据权利要求15所述的免疫色谱试验装置，其中所述测试条或多个测试条包含针对α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)的抗体。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的免疫色谱试验装置，其是横向流装置。
18.ー种免疫色谱试验装置，其包含用于检测两种或更多种蛋白质的两个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-l-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。
19.根据权利要求18所述的免疫色谱试验装置，其中所述测试条包含针对两种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I MMIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(A1AG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL_6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β_2_微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。
20.根据权利要求19的免疫色谱试验装置，其是横向流装置。
21.ー种免疫色谱试验装置，其包含用于检测三种或更多种蛋白质的三个或更多个色谱条，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α -I-酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-I (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂(TIMP-I)。
22.根据权利要求21所述的免疫色谱试验装置，其中所述测试条包含针对三种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白I β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)、α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂(TIMP-I)。
23.根据权利要求22的免疫色谱试验装置，其是横向流装置。
24.ー种免疫色谱试验装置，包含用于检测两种或更多种蛋白质的两个或更多个色谱条，所述蛋白质选自巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。
25.根据权利要求24所述的免疫色谱试验装置，其中所述测试条包含针对两种或更多种蛋白质的抗体，所述蛋白质选自巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1)。
26.根据权利要求25的免疫色谱试验装置，其是横向流装置。
27.ー种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括 (a)相对于两种或更多种蛋白质在正常宫颈-阴道液中的相应水平或相对于所述两种或更多种蛋白质在已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的相应水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中所述两种或更多种蛋白质的水平，所述蛋白质选自生长调节的癌基因a (GRO-a)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)、α-I-酸性糖蛋白(AlAG)、α -甲胎蛋白(AFP)、白介素-6 (IL-6)、脂多糖结合蛋白(LBP)、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-I)、单核细胞趋化肽-I (MCP-I)、β -2-微球蛋白(B2MG)和金属蛋白酶-I组织抑制剂( ΜΡ-1);和 (b)如果确定所述两种或更多种蛋白质在所述样品中的每个所述水平相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于所述两种或更多种蛋白质中每一者在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
28.权利要求27所述的方法，其中所述体征和症状包括母体发热(>37. 8°C )、母体白细胞增多(> 15，000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
29.根据权利要求I所述的方法，包括測量巨噬细胞炎性蛋白Iβ (MIPlb)和α-Ι-酸性糖蛋白(AlAG)的水平，和如果MIPlb和AlAG的所述水平在宫颈-阴道液样品中分别相对于MIPlb和AlAG在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
30.根据权利要求I所述的方法，包括測量巨噬细胞炎性蛋白Iβ (MIPlb)和生长调节的癌基因a (GRO-a)的水平，和如果巨噬细胞炎性蛋白1β (MIPlb)和GR0_a的所述水平在宫颈-阴道液样品中分别相对于MIPlb和GRO-a在正常宫颈_阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
31.根据权利要求I所述的方法，包括測量α-I-酸性糖蛋白(AlAG)和生长调节的癌基因a (GRO-a)的水平，和如果AlAG和GR0_a的所述水平在宫颈-阴道液样品中分别相对于AlAG和GRO-a在正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
32.ー种用于确定指示羊膜内感染的体征和症状的方法，包括 (a)相对于α-甲胎蛋白(AFP)、白介素-6(IL-6)和IGF结合蛋白-I (IGFBP-I)在正常宫颈-阴道液或已知提示有羊膜内感染的宫颈-阴道液中的水平，测量从所述受试者获得的宫颈-阴道液样品中AFP、IL-6和IGFBP-I的水平；和 (b)如果确定AFP、IL-6和IGFBP-I在所述样品中的每个所述水平相对于AFP、IL_6和IGFBP-I在所述正常宫颈-阴道液中的相应水平显示出统计显著的差异，或确定其相对于AFP、IL-6和IGFBP-I在已知提示有羊膜内感染的所述宫颈-阴道液中的相应水平不显示出统计显著的差异，则诊断所述受试者患有羊膜内感染。
33.权利要求32所述的方法，其中所述体征和症状包含母体发热(>37. 8°C)、母体白细胞增多(> 15，000/mm3)、母体和/或胎儿心动过速、子宫压痛和/或腐臭味羊膜液。
全文摘要
本发明涉及可以用于非侵入性诊断羊膜内感染的生物标记和生物标记集合或组合基团的鉴定，和使用此类生物标记的诊断测定法。
文档编号G01N33/68GK102667486SQ201080053405
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月22日 优先权日2009年11月25日
发明者E.I.拉德曼, T.H.格罗夫 申请人:霍洛吉克股份有限公司