专利名称：前驱糖尿病的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种前驱糖尿病的检测方法。更详细地，本发明涉及一种通过測定作为血液标记的糖化蛋白来进行特别是前驱糖尿病的胰岛素抵抗以及糖耐量受损的检测的方法、以及能够基于此在一次健康诊断阶段中简便地检测前驱糖尿病的前驱糖尿病检测方法，其中所述糖化蛋白为具有喃唳结构或咪唑啉酮(imidazolone)结构的体内物质,包括精氨卩密唳化合物或轻基咪唑酮(hydroimidazolone)化合物等。
背景技术：
到2030年为止，全世界的糖尿病患者人数将从目前的2亿8，500万人增长到超过4亿人，其中约9成是以生活习惯病为主要原因的肥胖型糖尿病患者。在我国，目前估计已
经有大约超过1，000万人的肥胖型糖尿病患者，患者人数还在逐年上升。然而，实际上接受糖尿病治疗的糖尿病患者还不足300万人，由于未接受足够的诊断而放置病情，耽误了治疗，从而引发肾脏疾病的患者，毎年持续增加I万人。而且，近年来，有人指出，在前驱糖尿病(所谓的糖尿病预备军)中，尽管空腹血糖(Fasting Plasma Glucose :FPG)正常，但是由于糖耐量受损(Impaired GlucoseTolerance :IGT)而导致饭后血糖值极高(隐匿型糖尿病)，因而引发心血管疾病的患者正在増加。因此，美国糖尿病学会和世界保健机构规定，前驱糖尿病是显著的疾病，提倡通过生活习惯的质量改善和药物治疗来改善前驱糖尿病的IGT的重要性。考虑到在日本患有这样的前驱糖尿病的患者估计有超过1，000万人的现状，不难想象，糖尿病患者人数在不久的将来将会剧增。作为前驱糖尿病和糖尿病的诊断标准，日本糖尿病学会在一次健康诊断中指导空腹血糖(FPG)的实施,另外在二次健康诊断中指导ロ服葡萄糖耐量试验(Oral GlucoseTolerance Test :0GTT)的实施。由于仅进行一次健康诊断的FPG检测或糖化血红蛋白(HbAlc)检测，难以准确诊断前驱糖尿病患者的IGT，因此，对于在一次健康诊断中疑似患有前驱糖尿病的受试者，建议接受OGTT的二次健康诊断。由于该OGTT除带来糖摄取这样的身体负担以外，为了接受检测还不得不请假，因此，事实上，对于从事前驱糖尿病患病率高的工作的中老年人来说，接受OGTT的二次健康诊断是较大的负担。但是，疏于接受二次健康诊断的潜在前驱糖尿病患者，在未接受治疗的情况下确实发展成真性糖尿病，而未觉察到糖尿病或其并发症，从而导致出现严重的并发症症状，或者不得不进行肾透析。鉴于该现状，考虑到在仅目前的治疗费就已经达到几万亿日元水平的肾透析患者的原发性糖尿病患者中，约半数患者因心肌梗塞或脑梗塞等缺血性疾病而死亡，这样下去，与糖尿病及其并发症相关的医疗费将不可避免地高涨。如上所述，在一次健康诊断中，通常实施以空腹血糖(FPG)、随时血糖或糖化血红蛋白(HbAlc)为判断指标的检测，FPG值为100mg/dL以上、或HbAlc值为5. 2%以上时，诊断疑似胰岛素抵抗或由此引发的IGT。但是，由胰岛素抵抗引发的IGT表现为以饭后高血糖为主的初期变化，因此，可以说在现有的一次健康诊断中使用的所有指标在准确度这一点上都不够。因此，现实是，对于在一次健康诊断中使用这些指标而疑似胰岛素抵抗或IGT的受试者，在二次健康诊断或以后的健康诊断中实施ロ服75g葡萄糖耐量试验(75g 0GTT)、血液中膜岛素、稳定模型评估指数(Homeostasis model assessment ratio、H0MA-R)等检测，通过这些费事的试验来检测胰岛素抵抗或IGT是否是阳性，从而进行前驱糖尿病的确诊。因此，如果有能够利用一次健康诊断中所使用的相同的用于测定血糖的采血样品、以与OGTT同等的准确度来确诊前驱糖尿病的方法，就能够飞跃提高前驱糖尿病患者的检出率，而且不需要二次健康诊断中的OGTT检测，能够推进世界保健机构等提倡的通过前驱糖尿病的早期诊断和治疗而实施的糖尿病化阻止战略。在此，对在二次健康诊断或其之后的糖尿病诊断中使用的检测方法进行简单说明。 (I) ロ服75g葡萄糖耐量试验(75g OGTT)该ロ服75g葡萄糖耐量试验(75g OGTT)为表示检测时刻的IGT的检测，包括喝完含75g葡萄糖的溶液后，经过一定时间測定血糖值、尿糖、血液中胰岛素值等，观察经时变化。在国内的诊断标准中，采用该OGTT的2小时血糖值。关于该75g 0GTT，除检测花时间以外，还有摄取葡萄糖后导致严重的高血糖的可能性，因此应该慎重实施。(2)血液中胰岛素值近年来，血液中胰岛素值不包含在诊断标准中，但是，其由干与代谢症候群相关而受到关注。肥胖型糖尿病或前驱糖尿病的IGT的较大原因有，血液中胰岛素的灵敏度降低即胰岛素抵抗，因此，被确认为IGT的前驱糖尿病或肥胖型糖尿病患者的血液中胰岛素浓度比健康人高(例如，早晨空腹时的血液中胰岛素浓度为15iiU/mL以上时，胰岛素抵抗明显为阳性，发生IGT的可能性高)。(3)稳定模型评估指数(Homeostasis model assessment ratio、H0MA-R)空腹血糖为140mg/dL以下时，认为HOMA-R与IGT的值等很相关，利用下述式中所示的空腹血糖与空腹时血液中胰岛素浓度之间的关系来计算HOMA-R。HOMA-R =空腹时胰岛素值(U U/mL) X空腹血糖(mg/dL) /405在上述式中，HOMA-R为2. 5以上时，有胰岛素抵抗；HOMA-R为1.6以下时，正常。但是，HOMA-R是一次健康诊断以外的项目，不能用于胰岛素治疗中的患者。(4)葡萄糖钳夹法葡萄糖钳夹法是，通过注射葡萄糖和胰岛素，并制定維持血糖值的正常值的要点，从而调查胰岛素能够使受试者的血糖值下降多少，即给予胰岛素的有效程度(机体的胰岛素灵敏度)的方法。在目前所使用的胰岛素抵抗的測定中，该葡萄糖钳夹法最准确，但是，由于其处理麻烦，因此，一般即使在医院中也很少用。另外，众所周知，作为生成糖基化终末产物(Advanced Glycation Endproducts AGEs)的反应而公知的美拉德反应在体内进行，參与老化或已经出现症状的糖尿病并发症的发展，其中所述糖基化终末产物作为氧化应激诱导因子而公知(例如參照非专利文献I)。该美拉德反应为包括前期阶段和后期阶段这两个阶段的反应，在前期阶段的反应中，蛋白质的侧链氨基或N末端氨基与糖的羰基反应，生成席夫碱后，生成阿马多利重排(amadori rearrangement)化合物。这样生成的存在于体内的该前期阶段反应产物，已知例如有HbAlc或糖化白蛋白等，已知其參与各种疾病，特别是糖尿病。另ー方面，在后期阶段的反应中，上述前期阶段反应产物进ー步经过氧化、脱水、缩合、环状化等复杂反应，生成具有荧光性、褐色化、分子内和分子间交联以及生物识别中至少任意ー种特性的作为后期反应产物的被称作糖化蛋白的糖基化终末产物(AGEs)。S卩，已知氨基酸、肽或蛋白质的氨基与还原糖的醛基发生非酶缩合并被糖化，分别被转化成糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白(以下有时简称为“糖化蛋白等”)。作为在上述美拉德反应前期阶段中的反应性羰基化产物之一的丙酮醛(以下有时简称为“MG0”)，已知特别是在血液中大量存在，还公开了其在糖尿病患者中的血清水平高，或者在通过链脲霉素而诱导糖尿病的大鼠的眼球晶体中大量存在(非专利文献2、3)。另外，不仅发表了 MGO以体内浓度水平与蛋白质反应生成荧光性产物，起生成AGE的直接介质的作用，而且还发表了 MGO与糖尿病或老化之间的关联性(非专利文献4、5、6)，MGO与胰岛素 抵抗或血管疾病之间的关联性(非专利文献7、8)等。可以说，具有这样的功能的丙酮醛(MGO)与构成蛋白质的氨基酸侧链，特别是与碱性的赖氨酸或精氨酸侧链发生化学反应，阻碍參与组织重建的蛋白酶或胶原酶的酶反应，引起组织损伤，另一方面，MGO使构成与代谢、调节相关的功能蛋白质的活性中心的氨基酸侧链改性失活，參与代谢毒性。然而，可以认为，MGO在通常的状态即氧化应激不亢进的状态下，通过こニ醛酶被解毒为d-乳酸，但是，在氧化应激亢进的血糖管理状态下，MGO的解毒机制发生障碍，对神经细胞和血管内产生障碍，成为神经损伤、或视网膜病变、肾炎等糖尿病并发症的原因(例如參照专利文献I)。因此，尽管測定MGO作为糖尿病并发症的指标非常有用，但是，由于MGO的化学反应性高，而且因其含量变化而难以控制等原因，MGO的直接测定极其困难。然而，已知未在体内发生解毒代谢而残留的过量MGO中的一部分利用其高化学反应性，与蛋白质的精氨酸侧链反应，生成作为糖基化终末产物(AGE)的精氨喃唳化合物(argpyrimidines APs )或轻基咪唑酮化合物等丙酮酸-精氨酸加合物(methylglyoxal-arginine adduct)(例如參照非专利文献9、10)。因此,尝试着眼于该丙酮醛-精氨酸加合物，测定该丙酮醛-精氨酸加合物，以间接測定MG0。发表了实际上在使用了对于被MGO改性的氨基酸的多克隆抗体的免疫组织学研究中，人动脉硬化病灶存在于利用该多克隆抗体较强染色的部位(例如參照非专利文献11)。而且，公开了使用能够特异性地识别精氨嘧啶的抗单克隆抗体(例如參照专利文献I、3、4)来測定丙酮醛-精氨酸加合物的结果显示，对糖尿病性肾脏疾病或缺血性脑梗塞中的脑动脉病变部的特异性免疫染色是有用的(例如參照非专利文献12);公开了丙酮醛-精氨酸加合物与糖尿病性视网膜病变部位之间的关联性(例如參照非专利文献13);公开了丙酮醛-精氨酸加合物对糖尿病患者的血管并发症是有用的(例如參照非专利文献14)。从上述背景来看，认为通过特异性地检测精氨嘧啶或其部位来检测糖化蛋白，在临床学上或分析方法上非常有用。因此，有人提出了使用了上述抗单克隆抗体的丙酮醛-精氨酸加合物的测定方法(例如參照专利文献1、3、5)。在这些现有技术文献中，均记载了丙酮醛-精氨酸加合物可用作已经出现症状(血糖值显著上升)的糖尿病或糖尿病并发症用标记的可能性，但是，既未明示也未暗示丙酮醛-精氨酸加合物作为由胰岛素抵抗引起IGT的前驱糖尿病的诊断标记的有用性。有人发表了，通过对于该AGE衍生物的抗体进行的免疫学研究发现，该AGE衍生物在老化、糖尿病、和糖尿病性肾炎等中为阳性(例如參照非专利文献15、16、17)。还记载了作为该AGE衍生物之一的羧甲基赖氨酸可用作已经出现症状(空腹或随时血糖值显著上升)的糖尿病的并发症诊断用标记(例如參照专利文献2)。但是，既未明示也未暗示该AGE衍生物能否用作对于前驱糖尿病的诊断标记。现有技术文献专利文献专利文献I :特开2004-309147号(专利第4146264号)专利文献2 :特开平9-178740号专利文献3 :特开平1ト246600号(专利第4013312号)专利文献4 :特开平11-246599号专利文献5 :特开2004-309147号(专利第4146264号) 非专利文献非专利文献I Bio Industry, Vol. 3, No. 7, p. 14, 1996非专利文献2 Biochem. Pharmacol. , Vol. 46, pp. 805-811，1993非专利文献3 Clin. Sci.，Vol. 87，pp-21-29，1994非专利文献4 Biochim. Biophys. Acta. , Vol. 1270, pp. 36-43，1995非专利文献5 J. Biol. Chem.，Vol. 269，pp. 32299-32305，1994非专利文献6 J. Biol. Chem.，Vol. 267，pp. 4364-4369，1992非专利文献7 Diabetes, Vol. 55，pp. 1289-1299，2006非专利文献8 J. Cell Biochem.，Vol. 103，pp. 1144-1157，2008非专利文献9:Archives Of Biochemistry And Biophysics, 1997, Vol. 344, No. I,pp.29-36非专利文献10 :Invest6.0phthalmol.Vis.Sci. ,December2003, vol. 44, no. 12, pp. 5287-5292非专利文献11 FEBS Letters, Vol. 410，pp. 313-318，1997非专利文献12:The Journal Of Biological Chemistry 1999, Vol. 274, No. 26, pp. 18492-18502非专利文献13 :Current Eye Research 2001, Vol. 23, No. 2, pp. 106-115非专利文献14:The Journal OfBiological Chemistry1998，Vol. 273, No. 12，pp. 6928-6936非专利文献15 J. Clin. Invest.，85，380-384，1990非专利文献16 J. Biol. Chem.，263，3758-3764，1989非专利文献17 J. Clin. Invest.，89，1102-1112，199
发明内容
本发明人为开发有效、迅速且简便地实施前驱糖尿病的诊断的技术，进行潜心研究，结果发现了通过测定作为机体试样中的体内物质的精氨嘧啶化合物(以下也称作“AP化合物”)或羟基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物作为诊断标记，能够有效、迅速且简便地实施胰岛素抵抗或由其引发的IGT (IGT)的检测的胰岛素抵抗或IGT检测方法，并且发现了根据该结果来检测前驱糖尿病的前驱糖尿病检测方法、特别是可在一次健康诊断中实施的前驱糖尿病的检测方法。S卩，本发明人着眼于作为丙酮醛(MGO)蛋白结合体的AP化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物起IGT诱导因子的作用的可能性，并进行潜心研究，结果发现了丙酮醛改性精氨酸衍生物的增加与IGT的发展之间密切的关联性，通过测定机体试样中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，能够进行IGT的检测，能够在一次健康诊断中检测前驱糖尿病。本发明人使用可选择性识别丙酮醛改性精氨酸衍生物的单克隆抗体，调查血液中AP与由肥胖引起的内脏脂肪的増加之间的关联性，结果发现了血液中丙酮醛改性精氨酸衍生物与内脏脂肪的増加之间具有相关关系。因此，本发明基于这些见解而完成。本说明书中使用的术语“前驱糖尿病”或“前驱”是指，空腹血糖(FPG)为平常值或
比平常值稍高的值、即为lOOmg/dL以上且不足110mg/dl或不足126mg/dL吋，疑似出现前驱糖尿病的症状，在糖耐量(OGTT)试验中，相当于糖负荷2小时后的血糖值为140-199mg/dl的情况(日本糖尿病学会ガィドラィン2010/2009新区分)。即，前驱糖尿病或前驱的患者在日本是被称作所谓的糖尿病预备军的患者。但是，在美国糖尿病学会和世界保健机构中，认为前驱已经是由饭后高血糖等而引发动脉硬化恶化的危险性高的显著的疾病。另外，空腹血糖(FPG)为126mg/dl以上、或糖耐量(OGTT)的血糖值为200mg/dl以上吋，诊断为糖尿病。因此，本发明的目的在于提供一种前驱糖尿病的检测方法，其包括通过测定血液试样等试样中的AP化合物或羟基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物来检测有无特别是前驱糖尿病的胰岛素抵抗或IGT。本发明的目的在于提供一种作为优选的方式的前驱糖尿病的检测方法，其利用测定体系来测定血液等机体试样中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中该测定体系使用了特异性地识别AP化合物或羟基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体，所述测定体系优选为酶联免疫吸附试验(Enzyme-1 inkedimmunosorbent assay)测定体系(以下有时简称作“ELISA测定体系”)。本发明的目的在于提供一种作为更优选的方式的前驱糖尿病的检测方法，其包括一次抗体反应エ序，使试样中的AP化合物或羟基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物与抗丙酮醛单克隆抗体等一次抗体反应；固相化工序，将血清白蛋白(BSA)等蛋白质与丙酮醛(MGO)反应而得到的蛋白质-丙酮醛(MGO)偶联物固相化；MG0- —次抗体反应エ序，将利用该一次抗体反应エ序处理的该试样添加到该固相化蛋白质-MGO偶联物中，使该蛋白质-MGO偶联物的MGO与该试样中的一次抗体反应；以及测定エ序，使利用该MGO- —次抗体反应エ序反应后的一次抗体与标记二次抗体反应，测定该标记二次抗体。本发明的目的在于提供一种作为更优选的方式的前驱糖尿病的检测方法，其根据标准样品中的丙酮醛(MGO)值的校正曲线，使试样中的丙酮醛(MGO)值定量。本发明的目的在于提供ー种作为其它方式的前驱糖尿病的检测方法，其包括根据上述前驱糖尿病的胰岛素抵抗或IGT检测的结果，检测前驱糖尿病。本发明的前驱糖尿病的检测方法对于特别是标准血糖值不足110mg/dl的血液试样的检测有用。
本发明的目的在于提供ー种作为其它方式的測定用试剂盒，其用于通过上述測定方法来检测前驱糖尿病。在本说明书中，即使在仅以“AP化合物”或“精氨嘧啶化合物”或相关术语为例进行说明吋，除应该解释为限于该术语的情况之外，该术语除应该解释为AP化合物以外，还应该解释为包括羟基咪唑酮化合物等丙酮醛改性精氨酸衍生物。为达到上述目的，本发明提供一种前驱糖尿病的检测方法，其通过测定血液等机体试样中的用通式[I][化学式I]
权利要求
1.一种前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，通过测定通式[I] [化学式I]
2.根据权利要求I所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，符号R所示的含N杂环基为式[VI] [化学式2]
3.根据权利要求I或2所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，丙酮醛改性精氨酸衍生物[I]为通式[II] [化学式6]
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，所述丙酮醛改性精氨酸衍生物[I]为式[VI] [化学式10]
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，利用测定体系来测定所述丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中该测定体系使用了识别该丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗体。
6.根据权利要求5所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，所述抗体为特异性地识别所述丙酮醛改性精氨酸衍生物的单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求5或6所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，该测定体系为ELISA测定体系。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，该测定体系包括 一次抗体反应工序，使试样中的丙酮醛改性精氨酸衍生物与一次抗体反应； 固相化工序，将血清白蛋白与丙酮醛反应而得到的血清白蛋白-丙酮醛偶联物固相化； 丙酮醛-一次抗体反应工序，将利用该一次抗体反应工序处理后的该试样添加到利用该固相化工序而固相化的该血清白蛋白-丙酮醛偶联物中，使该血清白蛋白-丙酮醛偶联物的丙酮醛与该试样中的一次抗体反应；以及 测定工序，使利用该丙酮醛-一次抗体反应工序反应后的一次抗体与标记二次抗体反应，测定该标记二次抗体。
9.根据权利要求8所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，该一次抗体为抗丙酮醛单克隆抗体。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，该方法包括对于进一步测定的丙酮醛值，根据标准试样的校正曲线，使该试样中的丙酮醛量定量。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，测定血液试样中的丙酮醛改性精氨酸衍生物。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的前驱糖尿病的检测方法，其特征在于，该血液试样的标准血糖值小于110mg/dL或小于126mg/dL。
13.一种前驱糖尿病检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒为通过测定丙酮醛改性精氨酸衍生物来进行权利要求I中所述的前驱糖尿病的胰岛素抵抗以及IGT的检测用试剂盒，用于检测有无前驱糖尿病的胰岛素抵抗以及IGT，并根据该结果来检测前驱糖尿病，其包括下述组成 丙酮醛改性精氨酸衍生物、一次抗体、将丙酮醛(MGO)与牛血清白蛋白(BSA)的BSA-MGO偶联物固相化后的固相化板、二次抗体、标记抗体(例如HRP标记抗体等)以及标准试样的标准曲线。
全文摘要
本发明提供一种通过测定丙酮醛改性精氨酸衍生物来进行前驱糖尿病检测的方法，其能够与测定血糖值相同地，简便且安全地处理多个试样，并且利用在一次健康诊断中实施的一次采血完成，且能够解决受试者的时间限制和繁杂性或危险性等问题。本发明的通过测定丙酮醛改性精氨酸衍生物来检测前驱糖尿病的方法包括利用测定体系来测定血液中的丙酮醛改性精氨酸衍生物，其中该测定体系使用了特异性识别丙酮醛改性精氨酸衍生物的抗体。
文档编号G01N33/53GK102792162SQ20108005801
公开日2012年11月21日 申请日期2010年12月24日 优先权日2009年12月28日
发明者渡边俊明 申请人:学校法人福冈大学