专利名称：一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法
技术领域：
本发明涉及一种评价饮用水健康风险的方法，特别是涉及一种以Cr6+为标准毒性物质、对饮用水健康风险进行全面评价的方法。
背景技术：
为了保障饮水安全，降低环境恶化给饮用水水质带来的威胁，人们常采用各种方法对水质进行评价，以有效的掌握饮用水引起的健康风险。水是我们必不可少的资源，随着环境的恶化，许多水源都受到了污染，为了保障饮水安全，降低环境恶化给饮用水水质带来的威胁，对水质健康风险的评价就变得越来越重要。基于理化分析方法的水质检测，能够直接分析测定水环境内的有毒有害物质或它们的浓度，但是检测成本高，且因水中各种化学物质之间的协同作用，单一的理化指标无法反映饮用水的综合毒性；另外，水体中的化合物大多是痕量级，理化分析法不能提供暴露于这些低剂量污染物所引起的致癌效应和非致癌效应，尤其不能提供未知污染物的浓度及其所引起的健康影响。利用生物毒性识别技术建立水环境健康风险评价系统是目前国内外水环境质量的一个研究热点，生物毒性识别技术能够从整体上评价饮用水的健康风险，与理化分析方法相比具有优越性。目前，已有多种生物毒性识别技术开始应用到水质评价领域，像生物鱼毒性试验、发光菌毒性试验、SOS/umu测试、蚕豆根尖微核试验、单细胞凝胶电泳试验等，但这些评价技术的标准都有一定的主观性，结果不易于统一。评价水质毒性的各种技术本身存在各自的缺点，例如，生物鱼毒性试验一般是对单一的有毒物质来进行检测，而且检测结果是由某一时间段的生物鱼死亡率来限定的，存在着一定的不稳定性。直接用发光菌冻干粉对有机物进行检测时，相对于阴性对照，有机物不但不抑制发光菌的发光性，反而促进其发光强度。由于水中可能含有有机和无机的多种物质，如果用传统的发光菌毒性试验进行水质综合毒性评价的话势必会使结果产生很大的偏差。SOS/umu测试系统在实际应用时存在对氯代有机物不敏感，不利于水体，特别是饮用水中消毒副产物的检测，鼠伤寒沙门菌为致病菌，易传播的问题。大多数微核试验和单细胞凝胶电泳试验毒性反应不够直观，毒性等级划分有一定的主观性。由此可见，如果仅用一种技术对水质毒性进行评价的话，对于污染物复杂的水质得到的评价结果或许会不准确，也会存在一定的片面性，不能准确、全面的得知水质的实际风险状况。因此，筛选一种即简洁又高效、且能够全面反应水质状况的评价方法是水质检测领域一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供了一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法，该方法能够全面的评价水质健康风险，降低由于饮用水暴露导致的人类致癌风险，且结果直观，易于统一。在我们检测水质毒性时，不知道水中有机物质的含量，这就使我们无法正确的选择以何种方法来评价水质毒性，水中的毒性物质很复杂，要使用一种技术或许会存在一定的片面性，而且单一的检测技术在灵敏度选择或时间选择上存在缺陷，不能同时达到满足灵敏度和解决时间的目的。由于各种检测技术都存在灵敏度越高而耗时越多的问题，为了更好的反应水质总体情况，简洁、高效、全面的检测水质毒性，本发明提供了一种对于高毒性的水质采用简便、快捷的检测方法进行检测，而对于低毒性水质采用相对复杂的、精确的检测技术。为了很好的反应水质中毒性物质的情况，本发明旨在提供一种能简洁、高效、全面、结果易于统一的检测水质毒性的方法，本方法根据水质中毒性物质的多少进行判断，以 Cr6+为标准毒性物质、层次化、定量化评价水质健康风险的方法，能够根据灵敏度的高低，选择合适的技术组合，实现对水质综合毒性，尤其是致癌、致畸、致突变(三致性)的评价。 本发明选择铬离子作为标准毒性物质，六价铬离子是世界卫生组织致癌物名单中的一种，在生活饮用水卫生标准中属于毒理指标，限值为0. 05mg/L，在地表水环境质量标准中也有不同等级的限值，因此用铬离子浓度表示水质毒性结果易于统一，且避免了其他实验因素所产生的影响，使水质毒性更加准确。本发明技术方案如下
一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法，其特征是包括以下步骤
(1)生物鱼毒性试验
将待测水样进行生物鱼毒性试验，测定96小时内生物鱼的死亡率； 若96小时内有死鱼现象，则将生物鱼放入不同浓度的铬离子溶液中进行生物鱼毒性试验，在24 h、48 h、72 h、96 h后检查生物鱼的死亡率，得24 h、48 h、72 h和96 h的Cr6+ 对死亡率的标准曲线，将待测水样的死亡率代入相应的标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；
若96h内无死鱼现象，则将待测水样按照步骤(2)的方法进行发光细菌毒性试验；
(2)发光菌毒性试验
将待测水样与发光菌菌悬液1:1体积比混合，进行发光菌毒性试验，测得待测水样的发光抑制率，所述发光菌为青海弧菌；
若发光抑制率高于40%，则将发光菌菌悬液与不同浓度Cr6+溶液进行发光菌毒性试验， 得不同浓度Cr6+的发光抑制率，绘制Cr6+对发光抑制率的标准曲线，将待测水样的发光抑制率代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；
若待测水样的发光抑制率低于40%，则将待测水样按照步骤(3)的方法进行SOS/umu测
试；
(3)SOS/umu 测试
将携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌培养成OD值为0. 3-0. 5的大肠杆菌检测液，将检测液与待测水样接触，同时设立空白样作为对照，然后收集细胞、超声破碎菌体，分别测定待测水样与空白样的荧光强度；
若待测水样与空白样的荧光强度之比大于1. 5，为阳性反应，则记录待测水样与空白样的荧光强度比值，同时将大肠杆菌检测液与不同浓度的Cr6+溶液进行接触，并设立空白样作为对照，测得不同浓度Cr6+与空白样的荧光强度，记录不同浓度Cr6+与空白样的荧光强度比值，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线，将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；若待测水样与空白样的荧光强度之比小于等于1. 5，为阴性反应，则将待测水样按照步骤(4)的方法进行蚕豆根尖微核试验；
(4)蚕豆根尖微核试验
以松滋青皮豆为指示生物，通过浸种、催芽，得初生根为1. 5cm 2cm长的松滋青皮豆种子，用待测水样对种子进行处理，同时设立空白样作为对照组，处理后通过根尖细胞修复培养、固定、染色，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算待测水样和对照组处理的细胞微核千分率；
若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值大于1.5，则用不同浓度的 Cr6+溶液对根为1. 5cm 2cm长的松滋青皮豆种子进行处理，处理后通过根尖细胞修复培养、固定、染色，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算不同Cr6+浓度处理的细胞微核千分率，绘制Cr6+浓度对细胞微核千分率的标准曲线；将待测水样的细胞微核千分率代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；
若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值小于等于1. 5，则将待测水样按照步骤(5)的方法进行单细胞凝胶电泳试验；
(5)单细胞凝胶电泳试验
用不同浓度的Cr6+溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr6+染毒的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳胶板、 细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不同浓度Cr6+染毒的DNA迁移的各种参数，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线，将浓缩富集的待测水样用同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测得待测水样处理后的olive尾距，将待测水样所得的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性。上述生物鱼毒性试验中，若96小时内有死鱼现象，则以下列方法评价水样健康风险
a.选择成年青鏘鱼为实验鱼种，在与待测水样水质条件相同的标准水中驯养7天；
b.采用与待测水样水质条件相同的标准水配制不同浓度的铬离子溶液；
c.以标准水为空白对照，与上述配得的不同浓度的铬离子溶液同时进行生物鱼毒性试验，在24 h、48 h、72 h、96 h后检查青鏘鱼的死亡率；
d.以Cr6+浓度为横坐标 ，死亡率为纵坐标，绘制24h、48 h、72 h、96 h的Cr6+对死亡率的标准曲线；
e.采集待测水样，进行生物鱼毒性试验，在24h、48 h、72 h、96 h后检查青鏘鱼的死
亡率；
f.将待测水样的青鏘鱼的死亡率代入相应的标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。上述发光菌毒性试验中，若发光抑制率高于40%，则以下列方法评价水样健康风险
a.将菌悬液与不同浓度Cr6+溶液1 1体积比混合10-15min，然后测得不同浓度Cr6+的发光抑制率；
b.以Cr6+浓度为横坐标，发光抑制率为纵坐标，绘制Cr6+对发光抑制率的标准曲线；C.将测得的待测水样的发光抑制率代入上述标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。上述发光菌毒性试验中，所用的发光菌菌悬液以下列方式制备
a.固体培养将发光菌在LB固体培养基中进行固体培养，培养条件为温度22°C，时间 24h ；
b.液体培养将固体培养得到的发光菌菌种接种到液体LB培养基中，在22°C下振荡培养16-24h，使发光菌的发光量在IO5-IO6之间；
c.制备菌悬液取上述步骤(2)的含发光菌的液体培养基，进行离心分离，然后用无菌生理盐水进行悬浮，得菌悬液，调节菌悬液的OD值至0. 4-0. 9。d.
上述SOS/umu测试中，若为阳性反应，则以下列方法评价水样健康风险
a.将携带绿色荧光蛋白的重组大肠杆菌贮藏物用改良的LB液体培养基在30-35°C， 150-200rpm的转速下振荡培养16-18小时，使其复苏活化，复苏活化液按照1/100的体积比加入到改良的LB液体培养基中，在35-37°C，180-250rpm的转速下振荡培养，至菌液OD值为0. 3-0. 5，得大肠杆菌检测液；所述改良的LB液体培养基的组成为胰化蛋白胨10g/L， 酵母提取物 2. 5g/L, NaCl 5g/L ；
b.将富集的待测水样与大肠杆菌检测液混合接触，同时设立添加相同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作为对照，待测水样或加入量为大肠杆菌检测液体积的0. 1-20% ；
c.将与待测水样接触过的大肠杆菌检测液和对照组的大肠杆菌检测液分别进行离心分离，收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤后利用超声法破碎菌体，得菌体破碎物；
d.将菌体破碎物离心，收集上清液，利用荧光光谱仪检测菌体的发射荧光强度，得待测水样的荧光强度比值，待测水样的荧光强度比值=待测水样接触的菌体的发射荧光强度 /对照组菌体的发射荧光强度；
e.用不同浓度的Cr6+溶液分别与大肠杆菌检测液接触，采用上述b、c、d相同的方法测得不同Cr6+溶液的荧光强度比值；
f.以Cr6+浓度作横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线；
g.将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。进一步的，上述SOS/umu测试中，对重组大肠杆菌贮藏物进行复苏活化时，改良的LB液体培养基中添加0. 3 (v/w)%的葡萄糖；步骤b中，待测水样与大肠杆菌检测液在 35-37 0C、180-250rpm的转速下充分接触1-2小时；步骤c中，以8000-10000rpm的转速将大肠杆菌接触液离心分离2-5min ；超声法破碎菌体采用破碎4、秒、间隔4、秒、破碎15 25 次的程序进行；步骤d中，以12000-14000rpm的转速将菌体破碎物高速离心8-lOmin。上述SOS/umu测试中，待测水样与不同浓度Cr6+溶液进行试验时，对照组中所用的纯溶剂为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜，当与检测液接触的受试物(具体指本发明中的待测水样或Cr6+溶液)中均为水溶性的物质时，纯溶剂可以为蒸馏水、去离子水或二甲基亚砜， 当受试物中含有水不溶性物质时，纯溶剂只能为二甲基亚砜。 上述蚕豆根尖微核试验中，若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值大于1. 5，则以下列方法评价水样健康风险a.以松滋青皮豆为指示生物，通过浸种、催芽，得初生根为1.5cm 2cm长的松滋青皮豆种子；
b.用不同浓度的铬离子分别对松滋青皮豆种子的根尖进行处理5-7h，处理后将松滋青皮豆种子分别用去离子水浸洗干净，对根尖细胞修复22h 24h，然后从根尖顶端切下 Icm的幼根，加入卡诺氏固定液固定24-48h，最后用孚尔根染色法染色5_6h，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算细胞微核千分率；
c.以铬离子浓度为横坐标，细胞微核千分率为纵坐标，绘制铬离子浓度对细胞微核千分率的标准曲线；
d.采用同样的方法对经待测水样处理过的松滋青皮豆进行微核试验，计算细胞微核千分率；
进一步的，上述蚕豆根尖微核试验中，浸种时间为24h 36h，催芽时间为48-72h。上述单细胞凝胶电泳试验的具体步骤包括
a.以合适浓度的Cr6+溶液对小白鼠进行5d的处理；
b.制备单细胞悬浮液按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备
用；
c.制作电泳胶板吸取150μL0. 8wt%的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片，制成底层胶板；将90 μ L细胞悬浮液和90 μ L0. 7wt%的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层胶板上得第二层胶；将100 μ L0. 7wt %的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶均在3-5°C固化；
d.细胞裂解将步骤(3)中的盖玻片移开，将载玻片浸入4°C裂解液中，裂解至少Ih；
e.DNA解旋将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30min ；
f.电泳调整电泳仪的电压为25V，电泳15min；
g.中和、染色电泳结束后，加入0.4mol/LTris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15min，吸干 Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋lh，吸取乙醇，存好可用于镜检；
h.镜检与分析将各载玻片加入EB染色剂染色后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；
i.以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的曲线；
j.将待测水样进行浓缩富集后对小老鼠进行染毒处理，然后按步骤(2)- (8)的方法对小白鼠进行单细胞凝胶电泳试验，测得olive尾距；
k.将水样染毒的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的曲线，即可得到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性。上述进行生物鱼毒性试验时，所用的标准水为没有其他杂质的去离子水或蒸馏水，在试验时，调节标准水的温度、PH、溶解氧等条件使其与待测水样保持一致；进行生物鱼毒性试验时，应保证对照组和试验组的水质条件(测定pH、溶解氧和温度)及实验容器中试验液的受试物浓度不变，以排除生物鱼的死亡与环境的关系，保证结果的准确性。此外，进行生物鱼毒性试验时，每组中青鏘鱼至少10尾；在计算不同Cr6+浓度的青鏘鱼死亡率或待测水样的青鏘鱼死亡率时，应减去对照组的青鏘鱼死亡率，以保证结果的准确性，避免自然死亡所造成的误差；在对铬离子溶液和待测水样进行生物鱼毒性试验时，每组实验设定3组平行样，取平均值；青鏘鱼在驯养时的死亡率应低于10%，若高于10%则重新选择鱼进行试验；以标准水作为对照组进行生物鱼毒性试验时，青鏘鱼的死亡率均应保证低于10%，若 高于10%则重新选择鱼进行试验。发明人在进行发光菌毒性试验时发现，有机毒物不但不会抑制发光菌的发光性， 还具有促进作用，这样在测定含有有机和无机毒性物质的水样使会使测量结果发生错误， 偏离真实数据，发明人经创造性实验，发现在将发光菌用于检测毒性物质前，先对其进行一定的培养，则可使发光菌对有机物质也同样具有发光抑制性，使检测水质毒性时结果更加准确。SOS/umu测试是基于SOS反应机理的，大肠杆菌在受到污染物作用，导致DNA分子受到大范围损伤、复制受到抑制时，可诱导产生有错误倾向的修复功能，通过敏感操纵子 Pumu启动表达下游基因，本发明中设计下游基因表达绿色荧光蛋白，可通过检测产生的荧光获得污染物信息。利用大肠杆菌的生理生化特征，可以提高大肠杆菌与毒物接触后SOS 反应的灵敏度，降低在非测定条件下SOS反应的背景，本发明方法中使用一定浓度的葡萄糖、降低培养温度与转速可抑制大肠杆菌SOS效应背景值，采用对数前中期的菌体提高反应的灵敏度；另外改良的LB培养基可以降低检测荧光背景值；根据大肠杆菌对绿色荧光蛋白的胞内表达特征而破碎细胞可提高荧光检测灵敏度。通过受试物的Cr (VI)当量浓度换算可实现与其它遗传毒性检测方法的比较，便于各毒性检测方法的联合使用及建立毒性分级。本发明采用重组大肠杆菌代替常用的鼠伤寒沙门氏菌，无致病风险，培养及操作简便易行。重组大肠杆菌是将大肠杆菌启动基因序列与绿色荧光蛋白基因序列连接，与质粒载体连接后导入大肠杆菌，形成携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌，即为本发明中所用的重组大肠杆菌。将绿色荧光蛋白的基因导入大肠杆菌体内后，遇到致DNA损伤物，则启动该基因表达，细胞内产生绿色荧光蛋白，可通过检测产生的荧光获得污染物信息。携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌在国际上有的实验室已有报道(Ryoichi et al. , 2001 ；Kostrzynska et al. , 2002 ；Norman et al.，2006)，下列文献中也提到了制备携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌的方法，本领域技术人员可根据相关文献得到，此处非本发明的创新点，不再赘述。 文献为1. Ryoichi Araij Yukimasa Makitaj Yoshimitsu Odaj Teruyuki Nagamune. Construction of Green Fluorescent Protein Reporter Genes for Genotoxicity Test (SOShmu-Test) and Improvement of Mutagen-Sensitivity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001，92 ( 3):301-304. 2. Magdalena Kostrzynska, Kam T. Leung, Hung Leej Jack T. Trevors. Green fluorescent protein-based biosensor for detectingSOS-inducing activity of genotoxic compounds. Journal of Microbiological Methods, 2002，48 (1): 43 - 51. 3. Anders Norman, Lars Hestbjerg Hansen, S0ren J S0rensen. A flow cytometry-optimized assay using an SOS -green fluorescent protein (SOS - GFP) whole-cell biosensor for the detection of genotoxins in complex environments. Mutation Research. 2006，603 (1): 164 - 172.
本方法所用的Cr6+溶液均是用重铬酸钾配制的。有益效果本发明将各种检测技术按照灵敏度高低的方式进行排列，在检测时先用灵敏度低的技术对水质进行检测，避免了水质污染严重而使用精确的检测技术造成时间浪费。本方法环环相扣，在生物个体、细胞、基因三个水平程度上检测水质情况，使水质中污染物含量无论高低都能进行检测，且检测时间较短，结果准确、易于统一。本方法选择Cr6+ 为标准毒性物质，对水质综合毒性的判断更加直观、准确，实现了对水质毒性的定量化评价，能够对水质污染状况做出判断，为突发性水质污染和水厂的水处理技术提供支持，降低由于饮用水暴露导致的人类致癌风险。
图1为实施例1中24h时Cr6+浓度对青鏘鱼死亡率的标准曲线； 图2为实施例1中48h时Cr6+浓度对青鏘鱼死亡率的标准曲线； 图3为实施例1中72h时Cr6+浓度对青鏘鱼死亡率的标准曲线； 图4为实施例1中96h时Cr6+浓度对青鏘鱼死亡率的标准曲线； 图5为实施例2中Cr6+浓度对发光抑制率的标准曲线； 图6为实施例3中Cr6+浓度对荧光强度比值的标准曲线； 图7为实施例4中Cr6+浓度对微核千分率的标准曲线； 图8为实施例5中Cr6+浓度对olive尾距的标准曲线。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本发明所用的铬离子溶液均是采用重铬酸钾配制而成的。本发明所用的LB固体培养基的配方如下胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L、琼脂粉18g/L。本发明所用的LB液体培养基的配方如下胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、 氯化钠10g/L。所用裂解液为2·5ΜNaCl, IOOmM Na2EDTA, IOmM Tris，1% 肌氨酸钠，1% Triton X-100，10% DMSO ；
所用的碱性电泳缓冲液配方组成为lmM Na2EDTA和300mM NaOH，调pH > 13，临用前将两种溶液等体积混合。本发明的重组大肠杆菌的实现方法为现有技术，本领域技术人员可根据现有文献获得携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌，在此不再赘述，下面对本发明的关键创新点进行详细阐述。实施例1
下面以本市0. 04mg/L溴氰菊酯的地表水为例，对其中污染程度进行评价，地表水的水质条件为PH为8. 07，温度为25°C，溶解氧9mg/L，硬度305 mg/L。方法如下
1、生物鱼毒性试验
(1)选择体长为2 3cm之间的青鏘鱼(Medakaf ish，Oryzias latipes)，放在标准水 (标准水采用蒸馏水或去离子水进行配制，其水质条件与地表水一致)中驯养7d，驯养期间死亡率低于10%，如果高于10%则换一批鱼重新驯养。试验前Id开始禁食；标准水采用蒸馏水或去离子水进行配制，其水质条件与地表水一致；(2)采集待检水样，经充分曝气后，向2L水中加入15条青鏘鱼，设立三个平行，同时设立设一个空白对照，观察24 h、48 h、72 h、96 h内生物鱼在待测水环境中的反应，经观察发现96小时内有死鱼现象，鱼的24 h、48 h、72 h、96 h得死亡率分别为26. 6%，33. 3%，46. 7%， 100% ；
(3)在Cr6+浓度0.5-50mg/L的范围内取6个浓度点分别进行生物鱼毒性试验，这5个浓度点的铬离子浓度分别为0.5 mg/LU mg/L、5 mg/LUO mg/L、20 mg/L、40mg/L，采用重铬酸钾配制Cr6+溶液；
(4)以标准水作为对照组，不同浓度Cr6+溶液作为试验组，同时进行生物鱼毒性试验， 每个浓度点设3个平行样，每组加15尾实验鱼，在24 h、48 h、72 h、96 h后检查青鏘鱼的死亡率，试验期间保持水质pH、溶解氧、温度及实验容器中Cr6+浓度不变；试验时，保持对照组的死亡率低于10%，若高于10%重新进行试验；
(5)以Cr6+浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，绘制不同时间下(24h、48 h、72 h、96 h) Cr6+对死亡率的标准曲线；
(6)将待测水样的青鏘鱼死亡率带入相应的标准曲线，结果为24h水质毒性为7.48mg/ L Cr6+毒性当量，48h水质毒性为8. 53 mg/L Cr6+毒性当量，72h水质毒性为15. 3 mg/L Cr6+ 毒性当量，96h水质毒性为41. 84mg/L Cr6+毒性当量。因水样中毒性物质含量较大，采用生物鱼毒性试验就能准确的检测水质情况，不必再进行以下的试验，节省时间。实施例2
下面以某日常城市水厂的进厂水为例，对其中污染程度进行评价，方法如下
1、生物鱼毒性试验
按照实施例1的方法进行生物鱼毒性试验，经观察发现96小时内无死鱼现象，则继续进行发光菌毒性试验；
2、发光菌毒性试验以青海弧菌进行发光菌毒性试验
(1)制备菌悬液
a.将青海弧菌在LB固体培养基上于22°C培养24h，将30个单菌落菌种接种到150ml 液体LB培养基中，22°C振荡培养20h ；
b.将含有发光菌的液体培养基在4000r/min的离心条件下进行离心分离，再用无菌生理盐水进行悬浮，得OD值为0. 9的菌悬液；
(2)采集待检水样，经除氯后，按1:1的体积比加入刚配制的菌悬液进行发光菌毒性试验，设立三个平行，同时设立一个空白对照，菌种的曝光反应时间控制为lOmin，反应IOmin后利用微孔板化学发光仪测定发光菌的发光强度，得待测水样的发光抑制率为 47. 8%,46. 7%,48. 9%，平均发光抑制率为47. 8%，因为发光抑制率高于40% (发光抑制率高于 40%，用发光菌毒性试验检测水质结果可信度高，若低于40%则要进一步采用更为精确的方法进行检测)，所以直接采用Cr6+浓度对水样毒性进行表示；
(3)将铬离子在0.0025-0. 025mg/L之间选择5个浓度点，分别为0. 0025mg/ L, 0. 005mg/L, 0. Olmg/L, 0. 02mg/L, 0. 025mg/L,将菌悬液与不同浓度 Cr6+溶液以 1 1 的体积比例进行混合，菌种的曝光反应时间统一控制在lOmin，反应IOmin后进行发光量的测定， 测得不同铬离子的发光量的抑制率分别为39. 3%, 42. 7%, 45. 9%, 47. 8%, 52. 1%，以Cr6+浓度为横坐标，发光抑制率为纵坐标，绘制Cr6+对发光抑制率的标准曲线，见图5，其中，图5中纵坐标的发光菌光损失量即发光菌的发光抑制率；
(4)将待测水样的发光抑制率带入标准曲线，得该水样的毒性作用大小相当于0.131 mg/L的Cr6+的作用效果。实施例3
下面以某水厂进厂水为例，对其中污染程度进行评价，方法如下
1、生物鱼毒性试验
按照实施例1的方法进行生物鱼毒性试验，经观察发现96小时内无死鱼现象，则继续进行发光菌毒性试验；
2、发光菌毒性试验
按照实施例2的方法进行发光菌毒性试验，经检测青海弧菌的发光抑制率低于40%，则继续进行SOS/umu测试；
3、SOS/umu测试
(1)水样浓缩富集取4L待测水样，以40mL/min的速度用活化后的XAD-2树脂吸附， 然后用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50°C下氮吹去乙酸乙酯，以一定体积的二甲基亚砜重新溶解样品至Iml ；
(2)重组大肠杆菌检测液制备
a.将重组大肠杆菌贮藏物200yL接入5mL改良的LB液体培养基(胰化蛋白胨IOg/ L,酵母提取物2. 5g/L, NaCl 10g/L)。另外，加入葡萄糖占0. 3% (v/w)，加入氨苄霉素至终浓度50 μ g/mL, 30°C,150rpm的转速下振荡培养16 18小时；
b.将复苏活化液按照1/100的体积比接入新鲜的改良的LB液体培养基，在35-37°C， 180rpm的转速下振荡培养，培养至菌液OD (520nm)为0. 4，大约2小时；
(3)将100μ L富集浓缩后的待检水样加入ImL大肠杆菌检测液中(按1 10的体积比混合)，在35-37°C，ISOrpm的转速下振荡接触1小时，设置3个平行组。同时设置添加相同体积的纯溶剂(100 μ L)的大肠杆菌检测液对照组。本实施例中受试样品溶剂为二甲基亚砜。(4)将与待测水样接触后的菌液及对照组的菌液通过离心(8000rpm，3min)收集菌体，以PBS缓冲液洗涤1次，利用超声波破碎仪破碎菌体，采用破碎5秒、间隔5秒、破碎25 次的程序进行；
(5)将菌体破碎物高速离心(12000rpm，IOmin)，收集上清液，利用荧光光谱仪检测发射荧光强度。采用激发波长395nm，检测波长为507nm。本实施例中检测结果如下表
权利要求
1. 一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法，其特征是包括以下步骤(1)生物鱼毒性试验将待测水样进行生物鱼毒性试验，测定96小时内生物鱼的死亡率；若96小时内有死鱼现象，则将生物鱼放入不同浓度的铬离子溶液中进行生物鱼毒性试验，在24 h、48 h、72 h、96 h后检查生物鱼的死亡率，得M h、48 h、72 h和96 h的Cr6+ 对死亡率的标准曲线，将待测水样的死亡率代入相应的标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；若96h内无死鱼现象，则将待测水样按照步骤(2)的方法进行发光细菌毒性试验；(2)发光菌毒性试验将待测水样与发光菌菌悬液1:1体积比混合，进行发光菌毒性试验，测得待测水样的发光抑制率，所述发光菌为青海弧菌；若发光抑制率高于40%，则将发光菌菌悬液与不同浓度Cr6+溶液进行发光菌毒性试验， 得不同浓度Cr6+的发光抑制率，绘制Cr6+对发光抑制率的标准曲线，将待测水样的发光抑制率代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；若待测水样的发光抑制率低于40%，则将待测水样按照步骤(3)的方法进行SOS/umu测试；(3)SOS/umu 测试将携带绿色荧光蛋白的大肠杆菌培养成OD值为0. 3-0. 5的大肠杆菌检测液，将检测液与待测水样接触，同时设立空白样作为对照，然后收集细胞、超声破碎菌体，分别测定待测水样与空白样的荧光强度；若待测水样与空白样的荧光强度之比大于1. 5，为阳性反应，则记录待测水样与空白样的荧光强度比值，同时将大肠杆菌检测液与不同浓度的Cr6+溶液进行接触，并设立空白样作为对照，测得不同浓度Cr6+与空白样的荧光强度，记录不同浓度Cr6+与空白样的荧光强度比值，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线，将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；若待测水样与空白样的荧光强度之比小于等于1. 5，为阴性反应，则将待测水样按照步骤(4)的方法进行蚕豆根尖微核试验；(4)蚕豆根尖微核试验以松滋青皮豆为指示生物，通过浸种、催芽，得初生根为1. 5cm 2cm长的松滋青皮豆种子，用待测水样对种子进行处理，同时设立空白样作为对照组，处理后通过根尖细胞修复培养、固定、染色，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算待测水样和对照组处理的细胞微核千分率；若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值大于1.5，则用不同浓度的 Cr6+溶液对根为1. 5cm 2cm长的松滋青皮豆种子进行处理，处理后通过根尖细胞修复培养、固定、染色，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算不同Cr6+浓度处理的细胞微核千分率，绘制Cr6+浓度对细胞微核千分率的标准曲线；将待测水样的细胞微核千分率代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性；若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值小于等于1. 5，则将待测水样按照步骤(5)的方法进行单细胞凝胶电泳试验；(5)单细胞凝胶电泳试验用不同浓度的Cr6+溶液对小老鼠分别进行染毒处理，然后将被不同浓度Cr6+染毒的小白鼠脾脏的淋巴细胞分别进行单细胞凝胶电泳试验，经制备单细胞悬浮液、制作电泳胶板、 细胞裂解、DNA解旋、电泳、中和、染色、镜检与分析等步骤后，用CASP软件分析测量不同浓度Cr6+染毒的DNA迁移的各种参数，绘制Cr6+对olive尾距的标准曲线，将浓缩富集的待测水样用同样的方法进行单细胞凝胶电泳试验，测得待测水样处理后的olive尾距，将待测水样所得的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的标准曲线，即可得到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是若96小时内有死鱼现象，则以下列方法评价水样健康风险a.选择成年青鏘鱼为实验鱼种，在与待测水样水质条件相同的标准水中驯养7天；b.采用与待测水样水质条件相同的标准水配制不同浓度的铬离子溶液；c.以标准水为空白对照，与上述配得的不同浓度的铬离子溶液同时进行生物鱼毒性试验，在M h、48 h、72 h、96 h后检查青鏘鱼的死亡率；d.以Cr6+浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，绘制Mh、48 h、72 h、96 h的Cr6+对死亡率的标准曲线；e.采集待测水样，进行生物鱼毒性试验，在Mh、48 h、72 h、96 h后检查青鏘鱼的死亡率；f.将待测水样的青鏘鱼的死亡率代入相应的标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)中所用的发光菌菌悬液以下列方式制备a.固体培养将发光菌在LB固体培养基中进行固体培养，培养条件为温度22°C，时间 24h ；b.液体培养将固体培养得到的发光菌菌种接种到液体LB培养基中，在22°C下振荡培养16-24h，使发光菌的发光量在IO5-IO6之间；c.制备菌悬液取上述步骤(2)的含发光菌的液体培养基，进行离心分离，然后用无菌生理盐水进行悬浮，得菌悬液，调节菌悬液的OD值至0. 4-0. 9。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征是步骤(2)中，若发光抑制率高于40%，则以下列方法评价水样健康风险a.将菌悬液与不同浓度Cr6+溶液1 1体积比混合10-15min，然后测得不同浓度Cr6+的发光抑制率；b.以Cr6+浓度为横坐标，发光抑制率为纵坐标，绘制Cr6+对发光抑制率的标准曲线；c.将测得的待测水样的发光抑制率代入上述标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中，若为阳性反应，则以下列方法评价水样健康风险a.将携带绿色荧光蛋白的重组大肠杆菌贮藏物用改良的LB液体培养基在30-35°C， 150-200rpm的转速下振荡培养16-18小时，使其复苏活化，复苏活化液按照1/100的体积比加入到改良的LB液体培养基中，在35-37°C，180-250rpm的转速下振荡培养，至菌液OD值为0. 3-0. 5，得大肠杆菌检测液；所述改良的LB液体培养基的组成为胰化蛋白胨10g/L， 酵母提取物 2. 5g/L, NaCl 5g/L ；b.将富集的待测水样与大肠杆菌检测液混合接触，同时设立添加相同体积纯溶剂的大肠杆菌检测液作为对照，待测水样或加入量为大肠杆菌检测液体积的0. 1-20% ；c.将与待测水样接触过的大肠杆菌检测液和对照组的大肠杆菌检测液分别进行离心分离，收集菌体，菌体用PBS缓冲液洗涤后利用超声法破碎菌体，得菌体破碎物；d.将菌体破碎物离心，收集上清液，利用荧光光谱仪检测菌体的发射荧光强度，得待测水样的荧光强度比值，待测水样的荧光强度比值=待测水样接触的菌体的发射荧光强度 /对照组菌体的发射荧光强度；e.用不同浓度的Cr6+溶液分别与大肠杆菌检测液接触，采用上述b、c、d相同的方法测得不同Cr6+溶液的荧光强度比值；f.以Cr6+浓度作横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，绘制荧光强度比值对Cr6+浓度的标准曲线；g.将待测水样的荧光强度比值代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。
6.根据权利要求5所述的水质遗传毒性检测方法，其特征是复苏活化时，改良的 LB液体培养基中添加0. 3 (v/w)%的葡萄糖；步骤b中，待测水样与大肠杆菌检测液在 35-37 0C、180-250rpm的转速下充分接触1_2小时；步骤c中，以8000-10000rpm的转速将大肠杆菌接触液离心分离2-5min ；超声法破碎菌体采用破碎4、秒、间隔4、秒、破碎15 25 次的程序进行；步骤d中，以12000-14000rpm的转速将菌体破碎物高速离心8-lOmin。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(4)中，若待测水样的微核千分率与对照组的微核千分率的比值大于1. 5，则以下列方法评价水样健康风险a.以松滋青皮豆为指示生物，通过浸种、催芽，得初生根为1.5cm 2cm长的松滋青皮豆种子；b.用不同浓度的Cr6+分别对松滋青皮豆种子的根尖进行处理5-7h，处理后将松滋青皮豆种子分别用去离子水浸洗干净，对根尖细胞修复2 Mh，然后从根尖顶端切下Icm的幼根，加入卡诺氏固定液固定对-4他，最后用孚尔根染色法染色5-6h，在生物显微镜下对根尖细胞进行镜检，计算细胞微核千分率；c.以Cr6+浓度为横坐标，细胞微核千分率为纵坐标，绘制Cr6+浓度对细胞微核千分率的标准曲线；d.将待测水样的细胞微核千分率代入标准曲线，以Cr6+浓度表示该水样的水质毒性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是浸种时间为24h 36h，催芽时间为48-7池。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是单细胞凝胶电泳试验的具体步骤包括a.以合适浓度的Cr6+溶液对小白鼠进行5d的处理；b.制备单细胞悬浮液按常规方法制取小鼠淋巴细胞，用PBS重新悬浮细胞，离心备用；c.制作电泳胶板吸取150μL0. 8wt%的正常熔点琼脂糖滴到载玻片上，加盖玻片，制成底层胶板；将90 μ L细胞悬浮液和90 μ L0. 7wt%的低熔点琼脂糖混和，迅速滴到底层胶板上得第二层胶；将100 μ L0. 7wt %的低熔点琼脂糖滴到第二层胶上得三层胶，每层胶均在3-5°C固化； d.细胞裂解将步骤(3)中的盖玻片移开，将载玻片浸入4°C裂解液中，裂解至少Ih；e.DNA解旋将不同浓度铬离子染毒的载玻片水平并列置于电泳槽阳极端，电泳槽中的碱性电泳缓冲液覆过载玻片，放置30min ；f.电泳调整电泳仪的电压为25V，电泳15min；g.中和、染色电泳结束后，加入0.4mol/LTris-HCl缓冲液，将载玻片淹没15min，吸干 Tris-HCl，再缓缓加入无水乙醇，将载玻片浸埋lh，吸取乙醇，存好可用于镜检；h.镜检与分析将各载玻片加入EB染色剂染色后，用荧光显微镜观察，用随机软件在自动曝光条件下拍照获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的各种参数；i.以Cr6+浓度为横坐标，olive尾距为纵坐标，绘制Cr6+对olive尾距的曲线；j.将待测水样进行浓缩富集后对小老鼠进行染毒处理，然后按步骤(2)- (8)的方法对小白鼠进行单细胞凝胶电泳试验，测得olive尾距；k.将水样染毒的olive尾距代入Cr6+对olive尾距的曲线，即可得到Cr6+浓度表示的待测水样的水质毒性。
全文摘要
一种以铬离子为标准毒性物质评价水质健康风险的方法，包括，进行生物鱼毒性试验，若96h内有死鱼，以Cr6+浓度表示水质毒性，如无死鱼进行发光菌毒性试验；若发光抑制率高于40%，以Cr6+浓度表示水质毒性，若低于40%，进行SOS/umu测试；若为阳性反应，以Cr6+浓度表示水质毒性，若为阴性反应，进行蚕豆根尖微核试验；若微核千分率比值大于1.5，以Cr6+浓度表示水质毒性，若小于等于1.5，进行单细胞凝胶电泳试验，以Cr6+浓度表示水质毒性。本发明环环相扣，使水质中污染物含量无论高低都能进行检测，且检测时间较短，结果准确、易于统一，实现了对水质毒性的定量化评价。
文档编号G01N27/447GK102175828SQ201110022429
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者孙韶华, 宋艳, 李力, 贾瑞宝 申请人:济南市供排水监测中心