专利名称：一种检测杂色曲霉素的酶电极及其制备与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物传感器领域，涉及一种酶电极以及由该酶电极组装的生物传感器，以及该酶电极与生物传感器的用途。
背景技术：
普鲁士蓝(Prussian blue, PB)是一种有效的氧化还原媒介体，PB膜修饰电极具有优良的电化学可逆性、极高的稳定性及电催化性能，它对H2A具有高灵敏的电催化作用， 被称为“人工过氧化物酶”。PB修饰电极能有效降低检测H2A的过电位，避免溶液中共存物质对测定产生的干扰。电流型氧化酶生物传感器通常是通过检测酶反应的产物H2O2来达到检测底物的目的，因此，使得基于PB修饰膜组装的氧化酶生物传感器在临床、环境和食品分析中发展迅速。但PB修饰电极在中性偏碱性溶液中极不稳定、易溶解脱落，限制了它在生物传感器中的广泛应用。因此制备一种具有耐碱性环境的PB修饰电极具有重要意义。杂色曲霉素(Sterigmatocystin，ST)是一种致癌致畸的真菌毒素，是黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)的合成前体，二者结构相似，都是由双呋喃环与氧杂蒽醌连接组成。ST是国际癌症研究机构划分的2B类致癌物质，与肺癌、肝癌、胃癌密切相关。目前， 测定ST的方法主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC-MS)、 气质联用法(GC-MS)和偶联质谱法(Tandem MS)等(Versilovskis, A.，De Saeger, S. Sterigmatocystin Occurrence in foodstuffs and analytical methods—An overview. Molecular Nutrition & Food Research, 2010，54，136-147.)。这些方法各有其特点， 但有的需要使用昂贵的仪器，有的操作繁琐，有的样品前处理麻烦，从而难于实现实际样品中ST含量的快速检测。黄曲霉毒素氧化酶(Aflatoxin-Oxidase，AF0)对ST具有催化作用，以AFO为分子识别元件的酶生物传感器对ST的检测具有操作简单，检测迅速，不用繁琐的样品前处理等优点。在报道的组装黄曲霉毒素解毒酶修饰电极对ST的检测中(Yao，DS., Cao, H. , Wen, SM. , et al. A novel biosensor for sterigmatocystin constructed by multi-walled carbon nanotubes (MffNT) modified with aflatoxin-detoxifizyme (ADTZ). Bioelectrochemistry, 2006，68，U6-133·)，其检测限为 41. 6 ng/mL，检测电位为400mV。但该类酶生物传感器的检测灵敏度有待提高，稳定性和重现性有待改善，以及可进一步优化检测电位以提高酶电极的选择性和抗干扰能力。
发明内容
本发明的目的在于针对普鲁士蓝修饰电极在中性偏碱性溶液中的不稳定性，提供一种新型的检测杂色曲霉素的酶电极及其制备方法，提高其对碱性环境耐受性。本发明的另一目的是以耐碱性杂合普鲁士蓝修饰电极为基底电极固定黄曲霉毒素氧化酶，实现对杂色曲霉素的高灵敏、高选择性的快速检测。本发明所述的一种检测杂色曲霉素的酶电极，包括金电极；以及组装在金电极上的普鲁士蓝杂合层；所述的普鲁士蓝是由铁氰化钾和氯化铁溶液电沉积而成；所述的普鲁士蓝杂合层是由以下方法组装在金电极上的提供由L-半胱氨酸单体通过自组装的方式在金电极表面形成的L-半胱氨酸自组装膜；提供含有铁氰化钾、氯化铁以及壳聚糖的混合溶液；以及将上述混合溶液中产生的普鲁士蓝电沉积在金电极的L-半胱氨酸自组装膜上， 形成普鲁士蓝杂合电极。本发明所述的自组装功能膜可以选用硫醇分子、L-半胱氨酸，或其他的一些含有巯基的分子在金电极表面三维组装过程所形成的一类热力学稳定、能量最低的有序膜。本发明优选的是L-半胱氨酸自组装功能膜，它具有促进电子转移作用以及对某些分子或离子具有高选择性的识别功能，使其具有一定抗干扰能力。本发明所述的一种检测杂色曲霉素的酶电极的制备方法，包括以下步骤
A)L-半胱氨酸自组装修饰金电极的制备将L-半胱氨酸单体通过自组装的方式组装在金电极表面，形成L-半胱氨酸自组装膜，得到L-半胱氨酸自组装膜功能化修饰的金电极；
B)杂合普鲁士蓝电沉积液的制备配制含有铁氰化钾、氯化铁的溶液，与壳聚糖相混合，形成杂合普鲁士蓝电沉积液；
C)普鲁士蓝杂合电极的制备将L-半胱氨酸修饰的金电极浸入杂合普鲁士蓝电沉积液中，采用电化学恒电位电沉积的方法，将沉积液中的普鲁士蓝电沉积在金电极的L-半胱氨酸自组装膜上，形成普鲁士蓝杂合电极。根据本发明所述的酶电极的制备方法的进一步特征，所述步骤A包括以下具体步骤将金电极清洗干净；配制0.0广0.05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作为L-半胱氨酸自组装液；将处理好的金电极插入到L-半胱氨酸自组装液中低温自组装12-M小时(时间需要具体范围)，制得L-半胱氨酸修饰的金电极。根据本发明所述的酶电极的制备方法的进一步特征，所述步骤B包括以下具体步骤配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl 充分溶解后组成的混合液；加入壳聚糖，使其浓度在0. 019Γ0. 05%之间；将上述溶液混勻后即为杂合普鲁士蓝电沉积工作液。根据本发明所述的酶电极的制备方法的进一步特征，所述步骤C包括以下具体步骤将步骤A中所制得的L-半胱氨酸修饰的金电极插入到步骤B中所制备的杂合普鲁士蓝电沉积液中，恒电位下进行电沉积，然后转入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中进行循环伏安扫描，取出电极用二次蒸馏水小心冲洗后烘干，然后置于0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl缓冲液中进行电活化，制得普鲁士蓝杂合电极。根据本发明所述的普鲁士蓝杂合电极可以应用于制备生物传感器。本发明提供了一种检测杂色曲霉素的生物传感器，所述生物传感器包括本发明所述的酶电极。本发明所述的一种检测杂色曲霉素的生物传感器的制备方法，是以碳纳米管为电子传递体，均勻分散在壳聚糖溶液中，形成碳纳米管-壳聚糖功能膜，将黄曲霉毒素氧化酶包埋在碳纳米管-壳聚糖功能膜中，再滴加于本发明所述的普鲁士蓝杂合电极表面，低温组装过夜，即制得用于检测杂色曲霉素的生物传感器。根据本发明所述的检测杂色曲霉素的生物传感器的制备方法的进一步特征，所述的碳纳米管是采用经强酸或强氧化剂活化处理后洗至中性烘干的多壁碳纳米管或者单壁碳纳米管。根据本发明所述的检测杂色曲霉素的生物传感器的制备方法的进一步特征，所述壳聚糖溶液是通过以下方法制备的用乙酸溶解壳聚糖粉末，制备成浓度为0. 19Γ1. 5%的壳聚糖溶液，调节壳聚糖溶液的PH值为5. 5，置于低温保存备用；所述碳纳米管溶于壳聚糖溶液，混勻，制得0. Γ1. 5 mg/mL的碳纳米管-壳聚糖溶液。本发明所述的电子传递体可选用有机分子或高分子电子传递体。有机分子电子传递体主要有二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、离子液体等；高分子电子传递体主要有碳纳米管、金属纳米颗粒、变价过渡金属离子型和有机氧化还原型等氧化还原聚合物等。本发明优选的电子传递体是活化后的碳纳米管，可以采用强酸或强氧化剂进行活化处理。本发明中将碳纳米管分散在壳聚糖溶液中，也可以选用溶胶凝胶(sol-gel)及其复合物、明矾以及一些其他具有成膜能力的化合物代替壳聚糖。根据本发明所述方法制备的生物传感器可应用于检测真菌毒素等用途。本发明所述的酶生物传感器是以黄曲霉毒素氧化酶为分子识别元件来检测杂色曲霉素的，其原理是黄曲霉毒素氧化酶催化ST反应产生了 H2O2，普鲁士蓝修饰电极对酶促反应产生的H2A具有很好的电催化还原作用，碳纳米管对这一反应具有促进作用，通过检测H2O2，就可以达到检测底物杂色曲霉素的作用。由于该电极具有较高的选择性和灵敏性， 能满足实际样品中杂色曲霉素的定量检测。与现有技术相比，本发明所述的酶电极与生物传感器具有如下有益效果
(1)本发明制备的普鲁士蓝杂合电极具有很好的碱性环境耐受性，克服了传统普鲁士蓝修饰电极在中性和弱碱性不稳定，易脱落的缺点。该杂合普鲁士蓝修饰电极为组装一系列酶生物传感器提供了一个很好的反应平台。(2)本发明制备的酶生物传感器对ST具有更灵敏的响应，响应时间快，为8s。在 0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0.1 mol/L KCl 的电解缓冲液中，对ST 的检测限为 2 ng/mL ； 线性范围宽，为10 ng/mL 950 ng/mL。(3)本发明制备的酶生物传感器具有很好的重现性和稳定性；检测电位低，可在 OV检测，极大地提高了检测的选择性；同时由于普鲁上蓝杂合膜的引入，极大地提高了酶电极的抗干扰能力；实际样品只需经过简单的预处理即可用组装的生物传感器检测，其回收率在91. 49Γ107. 3%之间，相对标准偏差在2. 1-5. 4%之间，能满足实际样品检测需要。(4)本发明所述的电极制备过程简单，性能优良；组装的用于检测ST的酶生物传感器使用简单，省时、省力，检测迅速方便，是一种理想的检测真菌毒素的替代方法。
图1为普鲁士蓝修饰电极在pH8. 0的PBS中的循环伏安曲线图；其中，图中曲线a 为PB-CS/Cys/Au修饰电极；曲线b为PB/Au修饰电极。扫描速度50mV/s。图 2 为 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au 修饰电极在含不同浓度 ST 的 pH6. 5 的 PBS 中的循环伏安曲线图；其中，图中曲线从a到c的变化对应ST的浓度分别是0 ng/mL，20 ng/mL, 40 ng/mL。扫描速度50mV/s。图3为CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极检测ST的电流-时间曲线。检测电位0V ；检测体积10mL ；搅拌速度50r/min。
具体实施例方式实施例一用于检测ST的酶生物传感器的制备
(一)、仪器与试剂
CHI660C型电化学工作站(上海辰华仪器公司)，实验采用三电极系统金电极(内直径为2 mm)或修饰电极为工作电极；Ag/AgCl (饱和KCl)电极为参比电极；钼丝电极为辅助电极。壳聚糖(CS，85-90%的脱乙酰度，平均分子量为1 χ IO6 g/mol，浙江澳兴生物科技有限公司)；单壁碳纳米管(SWCNTs，直径<2 nm，长度5_15>m，纯度>95%，深圳纳米港公司)，L-半胱氨酸(L-Cys，>99%，北京奇华盛生物技术发展中心)，铁氰化钾(广州化学试剂厂)，三氯化铁(广州化学试剂厂)，磷酸氢二钾(广州化学试剂厂)，磷酸二氢钾(广州化学试剂厂)。所有化学试剂均为分析纯，使用前未经过进一步处理，实验用水为二次蒸馏水。L-半胱氨酸(L-Cys)自组装液的配制自组装液为0. 02 mol/L的L_Cys，用0. 1 mol/L的HCl配制。杂合普鲁士蓝电沉积工作液的配制由2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2.5 mmol/L FeCl3 + 0.1 mol/L KCl + 0.1 mol/L HCl混合液充分溶解后组成，然后加入壳聚糖，使其浓度为0. 019Γ0. 05%之间，超声充分混勻，即为杂合普鲁士蓝电沉积工作液，每次使用前新鲜配制。支持电解质为PBS 缓冲液(0. 05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)
(二)、L-Cys自组装修饰金电极的制备
将待修饰的金电极(Au)在5#金相砂纸(上海辰华仪器公司)上打磨，然后分别用粒径为1. ΟΜπκΟ. 3Mm和0. 05Mffl的氧化铝粉末打磨至镜面，用二次蒸馏水超声清洗2次，每次 5min。将处理好的电极浸入新鲜配制的Piranha溶液(浓硫酸和双氧水体积比为7:3)中浸泡IOmin进行活化处理；再分别用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗2次(每次5min)。处理后的电极在0. 5 mol/L的硫酸中进行循环伏安扫描(电位窗口为-0. 2^1. 5V,扫描速度为0. lV/s)直至出现稳定的金的特征峰。将活化后的Au电极浸入L-Cys自组装液中，于 40C自组装他，取出后用水充分淋洗，除去非特异性吸附的L-Cys分子，便制得L-Cys自组装修饰的金电极，记为Cys/Au。(三)耐碱性普鲁士蓝杂合电极的制备
将步骤二中所制备的Cys/Au自组装电极插入新鲜配制的杂合普鲁士蓝(PB)电沉积工作液中，在恒电位400mV下电沉积40s，用二次蒸馏水小心冲洗后转入0. 1 mol/L HCl + 0. 1 mol/L KCl混合溶液中，以50mV/s扫描速度在-0. 05、. 35V之间扫描至稳定，取出电极用二次蒸馏水小心冲洗后于100°C烘烤lh，冷却至室温后置于0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl缓冲液中(pH=6. 5)于-0. 05V电活化IOmin后，在支持电解质PBS缓冲液于-0. 05、. 35V之间循环伏安扫描(扫速50mV/s)稳定后，便可制得杂合普鲁士蓝膜修饰电极，记为 ra-CS/Cys/Au。(四)碳纳米管-壳聚糖混合液的制备
用1% (体积比)的乙酸溶解壳聚糖粉末，制备成0.5%的壳聚糖(CS)溶液，充分溶解后滤去不溶杂质，用浓NaOH调节壳聚糖溶液的pH值为5. 5，置于4°C保存备用。单壁碳纳米管(SWCNTs)在使用前先进行纯化处理，用强酸或强氧化剂使其活化，洗至中性烘干后分散于0. 5%的壳聚糖溶液中，超声分散均勻后，制备成0. 5 mg/mL的单壁碳纳米管-壳聚糖溶液(CS-SWCOTs)。(五)黄曲霉毒素氧化酶(AFO)的制备
黄曲霉毒素氧化酶(AFO)的制备可参照文献1 (Junhua Chen, DalingLiu, etc. Development of an amperometrie enzyme electrode biosensor for sterigmatocystin detection, Enzyme and Microbial Technology 47 (2010) 119 - 126)以及文献 2 (Shi chuan Li, Jun hua Chen, etc. Amperometric biosensor for aflatoxin Bl based on aflatoxin-oxidase immobilized on multiwalled carbon nanotubesFood Control 22 (2011) 43-49)的报道。配制成蛋白浓度为5 mg/mL的AFO酶液，备用。(六)酶生物传感器的制备
取步骤五所制备的AFO酶液5L与步骤四所制备的CS-SWCNTs溶液5L均勻混合，超声 15min，便制备成了 CS-AF0-SWCNTs混合液。取L CS-AFO-SffCNTs 5混合液滴加于步骤三所制备的PB-CS/Cys/Au修饰电极上，在4°C冰箱中干燥组装过夜，即制得用于检测ST的酶生物传感器，记为 CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au。实施例二 杂合普鲁士蓝修饰电极碱性环境稳定性研究
采用CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)，利用三电极系统(参比电极Ag/ AgCl (饱和KCl)电极；对电极钼丝电极；工作电极普鲁士蓝修饰电极)，选择循环伏安扫描模式，设置电化学参数如下 工作电位-0. 05V +0. 35V 扫描速率50mV/s 静息时间2s
设置好参数后，在PH8.0的支持电解质PBS缓冲液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中，循环伏安法检测杂合普鲁士蓝修饰电极(PB-CS/Cys/Au)的电流响应信号。 为了进行对比，同时组装了纯普鲁士蓝修饰电极(PB/Au)，组装过程与杂合普鲁士蓝类似， 只是没有自组装L-Cys以及加壳聚糖。如图1所示，PB-CS/Cys/Au修饰电极在pH8. 0的PBS 中有一对较好的普鲁士蓝的氧化还原峰(曲线a)，与PB/Au修饰电极相比(曲线b)，其峰电流明显变大，峰形变好，电位差变小，这说明杂合普鲁士蓝修饰电极的可逆性增加，在碱性环境中的稳定性和耐受性增加。因此组装的PB-CS/Cys/Au修饰电极为构建酶生物传感器提供了一个很好的响应平台。实施例三CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极对ST的电化学响应 (一)循环伏安法检测ST
采用CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)，利用三电极系统(参比电极Ag/ AgCl (饱和KCl)电极，对电极钼丝电极，工作电极CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极)，选择循环伏安扫描模式，设置电化学参数如下 工作电位-0. 05V +0. 35V 扫描速率50mV/s 静息时间2s
8设置好参数后，在PH6. 5的支持电解质PBS缓冲液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加不同浓度的ST，混勻后采用循环伏安法检测。如图2所示，在没有ST的 PBS中，CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极展现出普鲁士蓝的一对氧化还原峰(曲线 a)；随着ST浓度的增大(曲线b=20ng/mL ST ；曲线c=40ng/mL ST)，修饰电极氧化峰电流变小，还原峰电流增大，表明普鲁士蓝杂合修饰电极对AFO催化ST产生的H2A具有很好的电化学还原作用。该酶生物传感器的检测机理是通过检测酶促反应产生的H2A达到检测ST 的目的。(二)检测ST的电流-时间曲线
采用CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司)，选择电流-时间检测模式，采用三电极系统(参比电极Ag/AgCl(饱和KCl)电极；对电极钼丝电极；工作电极CS-AF0-SWCNTs/ PB-CS/Cys/Au修饰电极)，设置电化学参数如下 检测电位0V 静息时间2s 搅拌速度50r/min
待背景电流稳定后，往IOmL支持电解质PBS缓冲液(0.05 mol/L KH2PO4- K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl)中滴加ST，如图3所示，随着ST浓度的变化，响应电流呈梯度变化。该酶生物传感器对ST响应灵敏且迅速，响应时间为8s，检测限为2 ng/mL (信噪比为3)。酶修饰电极对ST检测的线性回归方程为/ (mA) = 0.0791C (ng/ml) -0.8126 (R2=O. 9985)，线性范围为:10ng/mL 950ng/mL。实施例四酶电极的重现性和稳定性
将一支CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极置于pH8. 0的PBS中连续循环伏安扫描100圈，其峰电流仍保持在90%以上，说明本发明所制备的酶生物传感具有很好的稳定性。该酶电极对20ng/mL ST重复测定9次，其电流响应值的平均相对标准偏差(RSD)为 3. 6%，表明该电极具有较好的检测重复性。另外，同时制备9根酶修饰电极，相同条件下对 20ng/mL ST的响应电流的RSD为4. 6%。表明该修饰电极具有较好的制作重现性。电极不用时置于4°C避光干燥保存，隔天测量，16天后仍保持初始电流响应值的90%以上。说明该酶电极具有较好的存储稳定性。实施例五酶电极的抗干扰性
采用计时电流法对CS-AFO-SWCNTs/PB-CS/Cys/Au修饰电极的抗干扰能力进行研究， 测试条件参数设置如实施例3(二)所示，在IOmL含20ng/mL ST的pH6. 5的PBS缓冲液中， 分别滴加下列不同浓度的可能干扰物，分析其抗干扰能力。分别滴加的干扰物的种类
1000倍于ST浓度的葡萄糖，柠檬酸，PO43-, NO3", L-色氨酸，蔗糖，甘氨酸，D-山梨醇； 500倍于ST浓度的抗坏血酸，尿素，甲醇，草酸，CIO4"； 100倍于ST浓度的油酸，酒石酸钠，苯酚，乙酸铵，EDTA ； 10倍于ST浓度的对苯二酚，CuCl2, 3，5- 二硝基水杨酸。测试效果当控制相对误差不超过检测20ng/mL ST的电流响应值的5% 的情况下，1000倍的葡萄糖，柠檬酸，PO43-, NO3-, L-色氨酸，蔗糖，甘氨酸，D-山梨醇；500倍的抗坏血酸，尿素，甲醇，草酸，C104_ ；100倍的油酸，酒石酸钠，苯酚，乙酸铵，EDTA ；10倍的对苯二酚，CuCl2, 3，5- 二硝基水杨酸等对测定不产生干扰。实施例六实际样品检测
将本发明所述的酶生物传感器用于实际样品测定以及检测其回收率，所述的实际样品可以是玉米、花生、大米、小麦等一系列农副产品和粮食作物，也可以是饲料、饮料、酱油、橄榄油、花生油等一系列可能含ST的产品。本实施例中选用玉米样品进行检测。玉米样品的处理取Ig优质玉米粉，加入不同浓度的ST，于5 ml 80%的甲醇溶液中振荡萃取 45 min，离心(5000 r/min, 10 min)，上清用 0. lmol/L ρΗ7· 0 的 PBS 按 1 :5(V/ V)稀释后检测。其他样品按照类似的方法，经过简单的预处理后即可检测。计时电流法检测检测参数设置如实施例3 (二)所示，对分别含10 ng/nL,50 ng/ nL, 100 ng/nL, 150ng/nL, 200ng/nL ST的玉米样品进行计时电流法检测，每个浓度的玉米样品均测量4次。测试结果如表1所示，所测得样品的相对标准偏差在2. 19Γ5. 4%之间，加标回收率在91.49Γ107. 3%之间，用于实际样品的测定结果令人满意。表1 玉米样品中ST含量的测定
权利要求
1.一种检测杂色曲霉素的酶电极，其特征在于包括金电极；以及组装在金电极上的普鲁士蓝杂合层；所述的普鲁士蓝是由铁氰化钾和氯化铁溶液电沉积而成；所述的普鲁士蓝杂合层是由以下方法组装在金电极上的提供由L-半胱氨酸单体通过自组装的方式在金电极表面形成的L-半胱氨酸自组装膜；提供含有铁氰化钾、氯化铁以及壳聚糖的混合溶液；以及将上述混合溶液中产生的普鲁士蓝电沉积在金电极的L-半胱氨酸自组装膜上，形成普鲁士蓝杂合电极。
2.如权利要求1所述的检测杂色曲霉素的酶电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A)L-半胱氨酸自组装修饰金电极的制备将L-半胱氨酸单体通过自组装的方式组装在金电极表面，形成L-半胱氨酸自组装膜，得到L-半胱氨酸自组装膜功能化修饰的金电极；B)杂合普鲁士蓝电沉积液的制备配制含有铁氰化钾、氯化铁的溶液，与壳聚糖相混合，形成杂合普鲁士蓝电沉积液；C)普鲁士蓝杂合电极的制备将L-半胱氨酸修饰的金电极浸入杂合普鲁士蓝电沉积液中，采用电化学恒电位电沉积的方法，将沉积液中的普鲁士蓝电沉积在金电极的L-半胱氨酸自组装膜上，形成普鲁士蓝杂合电极。
3.根据权利要求2所述的酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤A包括以下具体步骤将金电极清洗干净；配制0. 0Γ0. 05 mol/L的L-半胱氨酸溶液作为L-半胱氨酸自组装液；将处理好的金电极插入到L-半胱氨酸自组装液中低温自组装12-M小时，制得L-半胱氨酸修饰的金电极。
4.根据权利要求2所述的酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤B包括以下具体步骤配制由 2. 5 mmol/L K3Fe(CN)6 + 2. 5 mmol/L FeCl3 + 0. 1 mol/L KCl + 0. 1 mol/L HCl充分溶解后组成的混合液；加入壳聚糖，使其浓度在0. 019Γ0. 05%之间；将上述溶液混勻后即为杂合普鲁士蓝电沉积工作液。
5.根据权利要求2所述的酶电极的制备方法，其特征在于，所述步骤C包括以下具体步骤将步骤A中所制得的L-半胱氨酸修饰的金电极插入到步骤B中所制备的杂合普鲁士蓝电沉积液中，恒电位下进行电沉积，然后转入0. 1 mol/L HCl + 0.1 mol/L KCl混合溶液中进行循环伏安扫描，取出电极用二次蒸馏水小心冲洗后烘干，然后置于0. 05 mol/L KH2PO4-K2HPO4 + 0. 1 mol/L KCl缓冲液中进行电活化，制得普鲁士蓝杂合电极。
6.一种检测杂色曲霉素的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括根据权利要求1所述的酶电极。
7.如权利要求6所述的生物传感器的制备方法，其特征在于以碳纳米管为电子传递体，均勻分散在壳聚糖溶液中，形成碳纳米管-壳聚糖功能膜，将黄曲霉毒素氧化酶包埋在碳纳米管-壳聚糖功能膜中，再滴加于权利要求1所述的普鲁士蓝杂合电极表面，低温组装过夜，即制得用于检测杂色曲霉素的生物传感器。
8.根据权利要求7所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的碳纳米管是采用经强酸或强氧化剂活化处理后洗至中性烘干的多壁碳纳米管或者单壁碳纳米管。
9.根据权利要求7所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液是通过以下方法制备的用乙酸溶解壳聚糖粉末，制备成浓度为0. 19Γ1. 5%的壳聚糖溶液，调节壳聚糖溶液的PH值为5. 5，置于低温保存备用；所述碳纳米管溶于壳聚糖溶液，混勻，制得 0. Γ1. 5 mg/mL的碳纳米管-壳聚糖溶液。
10.如权利要求6所述的生物传感器在检测杂色曲霉素方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种检测杂色曲霉素的酶电极及其制备方法，以及以其为基底电极固定黄曲霉毒素氧化酶组装的用于检测杂色曲霉素的生物传感器。在金电极表面先自组装上L-半胱氨酸功能膜，再插入到杂合普鲁士蓝电沉积工作液中，采用恒电位法即可制备普鲁士蓝杂合电极。采用碳纳米管作为电子传递体，将其均匀分散在壳聚糖溶液中，作为包埋黄曲霉毒素氧化酶的载体，再将壳聚糖-黄曲霉毒素氧化酶-碳纳米管混合膜组装到杂合普鲁士蓝修饰电极表面，就制成了用于检测杂色曲霉素的生物传感器。本发明所述的酶电极与生物传感器具有较好的稳定性和重现性，对杂色曲霉素响应迅速灵敏，响应时间快，检测电位低，抗干扰能力强，具有很好的选择性。
文档编号G01N27/403GK102175736SQ20111002255
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者刘大岭, 姚冬生, 谢春芳, 陈俊华 申请人:暨南大学