专利名称：一种次氯酸的新型绿色荧光变体蛋白探针及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学、蛋白质化学、分子生物学。具体地，本发明涉及一种可高灵敏度地检测细胞内次氯酸水平的新型绿色荧光突变蛋白及其编码核苷酸序列。本发明还涉及该突变蛋白及其核苷酸序列的制备方法和用途。
背景技术：
传统的次氯酸(HOCI)探针为有机化学荧光探针，这类探针虽然灵敏度很高，特异性好，但存在可溶性差、易发生荧光淬灭、有细胞毒性等缺 点，不能用于活菌及活细胞检测，不能用于定位检测细胞内不同细胞器中的次氯酸水平，而且有环境污染问题。绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein,简称GFP)是从水母分离出的一种天然绿色荧光蛋白，分子量约27KDa，由239个氨基酸残基组成的单链多肽。GFP的生色基团由位于第65-67位的3个氨基酸丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯咪唑啉酮(4-p-hydroxybene-5-imidazo-linone)构成。其主要突光激发波长为395nm,激发GFP产生的发射波长主要为508nm荧光。野生型GFP分子的支架包含多条折叠的β片层，由多个小环将这些片层相连。天然GFP折叠不稳定在大肠杆菌中表达常可产生错误折叠，溶解性差，而且与目的蛋白融合后常变为不溶性，荧光弱，提取复性时对化学处理和温度导致的变性耐受差，因而难以广泛应用。一些学者对野生型GFP进行了分子基因工程学改造，主要是引入增强折叠的定点突变和随机突变，从中筛选得到了折叠更强、荧光更亮，溶解性更好的GFP变体蛋白。例如，第65位的丝氨酸突变为苏氨酸后(S65T)，此GFP变体的最大激发光为485nm,突光发射光为528nm,蛋白自身折叠较快而稳定,突光强度提高了 5倍。另外,也制备了增强型 GFP (enGFP) [Crameri 等；Nat. Biotechnol. 14 ;315_319，1996],折叠型报导蛋白GFP[Waldo等；NatBiotechnol. 17 :691-695,1999]和环重排和/或受体插入的绿色荧光蛋白变体[Topell. S等；Methodr Mol Biol. 183 :31_48，2002 和 Topell. S等；FFBS Lett. 457 283-289，1999 及、Baird. G. S 等；Proc Natl Acad Sci USA. 96 :11241-11246,1999] 这些变体与GFP相比，折叠强度和稳定性、荧光强度和溶解性，对化学试剂和温度导致的变性耐受力等有所改善。特别是近年制备的新型超折叠绿色突光蛋白(Superfolder greenfluorescent protein,简写为 SFGFP) [Pedelacq J-D 等；Nature biotechnolegy. 24(1)79-88，2006]性能优异，折叠强度和稳定性、荧光强度和溶解性，对化学试剂和温度导致的变性耐受力大大提高，复性时重折叠快而活性好，不论与其融合的伴侣蛋白是否错误折叠或不溶都不影响SFGFP的这些性能。GFP及其改进变体作为不需要酶底物或辅因子的可检测报导分子，已广泛用于各类细胞和生物的基因表达和蛋白靶向各种研究中[Tsien. R. Y等·，Annu Rev Biochem. 67 509-549，1998]，例如，与目的蛋白融合(或称为加入绿荧光蛋白尾)作为探针在细胞内表达，可用荧光显微镜直接观察，追踪目的蛋白在细胞内的分布部位和动态变化。此外，可将一些具有生物学、化学、电学和物理学性能的传感肽(如钙调蛋白肽)插入到GFP中，形成的构建物可用于检测这种传感肽对体内外环境刺激的反应(如氧还电势，细胞内离子浓度等)[Roger. Y. Tsien 和 Geoffrey Baird 的美国专利 US7, 060, 793]。近年来发现GFP的生色基团可被HOCl氯化从而改变其荧光强弱，一些学者利用这个原理用其研究中性粒细胞杀菌机制。如Palazzolo. A. M等[Biochemistry. 44 6910-6919,2005]用转化了 GFP蛋白基因而显示绿色荧光的大肠杆菌研究中性粒细胞吞噬体中的杀菌性次氯酸生化反应，提出在存在NADPH氧化酶产生的H2O2下，髓过氧化物酶(MPO)氧化氯产生的次氯酸可以淬灭大肠杆菌表达的GFP荧光，但中性粒细胞产生的其他氧化剂不能淬灭GFP。而表达GFP的活菌绿色荧光可被次氯酸淬灭，不能被过氧亚硝酸及由其0-0裂解产生的氧自由基淬灭。当使受血清调理素调理的细菌接触人中性粒细胞时，荧光显微镜观察到被中性粒细胞吞噬的细菌绿色荧光完全消失，而中性粒细胞细胞膜外的细菌荧光仍然很强；培养液中加入MPO抑制剂叠氮钠时，这种荧光淬灭现象消失，Palazzolo.
A.M等认为淬灭细菌荧光所需的次氯酸量比抑制细菌生长量要高一个数量级水平。这些结果提示人中性粒细胞能产生足够量的次氯酸来杀死微生物病原。Schwartz. J等[J Immunol. 183(4) =2632-2641,2009]也尝试用表达GFP荧光的金黄色葡萄球菌研究其在人中性白细胞中的命运，发现GFP可作为一种高灵敏的实验用探针来监测吞噬体中的相关生化反应，鉴定耐受中性粒细胞抗细胞毒性作用的金黄色葡萄球菌亚种群。另有报道不仅次氯酸能通过修饰GFP生色基团改变其荧光强弱，其他活性氧/活性氮(R0S/RNS)物质，如过氧化亚硝酸盐[Espey MG 等；Proc Natl Acad Sci U S A. . 99 (6) :3481-3486, 2002],轻基自由基[Chartchalerm 等；EXCLI Journal. 8 :89-96, 2009]等也可以淬灭 GFP 的突光。但他们采用的都是野生型GFP，其稳定性差，荧光弱，检测细胞内次氯酸的特异性、灵敏度不够好。我们想到SFGFP的性能大大优于野生型GFP，如果制备出更多种环重排超折叠绿荧光蛋白(circularly permuted Superfolder green fluorescent protein,简写为 cpSFGFP),有可能从中选择出对次氯酸更具选择性和更高灵敏度的新型次氯酸cpSFGFP探针。我们在Pedelacq J-D 等[Nature Biotechnolegy. 24(1) :79-88,2006]制备SFGFP技术的基础上，对SFGFP进行环变换重排和截短突变双重改造，成功获得了多个新的cpSFGFP突变体。并从所制备的众多突变体中筛选出对HOCl选择性好、灵敏度高的多个cpSFGFP荧光探针，从而完成了本发明。在本发明之前，尚没有文献公开或报道过本发明所涉及的专门的次氯酸绿色荧光突变蛋白探针。发明概述本发明的第一个目的是提供一类对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光突变蛋白的编码基因。本发明的第二个目的是提供包含这类列新型绿色荧光突变蛋白编码基因的质粒载体。本发明的第三个目的是提供一类对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光突变蛋白。本发明的第四个目的是提供利用分子生物学手段产生和选择上述绿色荧光突变蛋白及其编码核酸序列的方法。本发明第五个目的是提供用这类绿色荧光突变蛋白或其编码基因作为探针检测次氯酸的初步应用。本发明提供的对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光突变蛋白的编码基因是核苷酸序列由一柔性短肽接头编码序列相连的二个SFGFP基因序列I通过环重排而成的cpSFGFP的编码基因。该编码基因选自序列3所示cpSFGFP39/40的编码基因、序列5所示的cpSFGFP91/92的编码基因、序列7所示的cpSFGFP 129/130的编码基因、序列9所示的cpSFGFP140/141的编码基因、序列11所示的cpSFGFP145/146的编码基因、序列13所示的cpSFGFP189/190的编码基因、序列15所示的cpSFGFP195/196的编码基因和序列17所示的cpSFGFP214/215的编码基因。该编码基因可以是N-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因，例如，N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N146)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N147)的编码基因、N-端截短的重排cpS FGFP145/146(N148)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N149)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N151)的编码基因和N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N152)的编码基因。该编码基因可以是C-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因，例如，C-端截短的重排cpSFGFP145/146(C143)的编码基因、C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C142)的编码基因、C-端截短的重排cpSFGFP145/146(C141)的编码基因、C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C140)的编码基因、重排cpSFGFP145/146 (C139)的编码基因和C-端截短的重排cpSFGFP145/146(C138)的编码基因。本发明还提供一种重组质粒载体，包含对次氯酸具有高选择性的由一柔性短肽接头编码序列相连的二个SFGFP基因序列I通过环重排而成的绿色荧光cpSFGFP突变蛋白编码基因。本发明还提供由上述重组质粒载体转化的宿主细胞。本发明进一步提供由上述编码基因编码的、通过转化大肠杆菌诱导表达产生、并通过纯化得到的对次氯酸具有高选择性的绿色荧光cpSFGFP突变蛋白。本发明进一步提供上述绿色荧光cpSFGFP突变蛋白作为次氯酸检测探针的用途。发明详述原始的野生型GFP荧光弱，与目的蛋白融合后荧光更弱，溶解性更差，为此多年来一些学者相继对其进行了基因工程(突变)改造，通过挑选获得了性能有所改善的GFPjnCrameri等的增强型GFP (enGFP) ,Waldo等的折叠型报导蛋白GFP和Topell. S等和Baird.G. S等的环重排和/或受体插入的绿色荧光蛋白等。近年PedelacqJ-D等[2]制备了性能更加优异的新型超折叠绿色荧光蛋白(SFGFP)，见图I。本文所用的术语“超折叠绿色荧光蛋白”指Pedelacq J-D等在Waldo等的“折叠型报导蛋白GFP”和Crameri等的“增强型GFP (enGFP) ”基础上，经4轮DNA改组，进一步弓丨入S30R、Y39N、N105T、Y145F、1171V、A206V六个新突变和环重排，筛选得到折叠较好的以两个绿色荧光蛋白融合为原型的一种绿色荧光蛋白超级折叠体，称为超折叠绿色荧光蛋白(SFGFP)。SFGFP比折叠型报导蛋白GFP和enGFP稳定得多，折叠强度高、荧光强、可溶性好、重组表达提取时对尿素处理变性的耐受力高、复性时重折叠快(快3. 5倍)、活性好。牛蛙红细胞铁蛋白单独在大肠杆菌中表达为不溶性蛋白，表达它的菌落荧光强度很弱；将牛蛙红细胞铁蛋白与SFGFP融合后，得到可溶性好的强荧光融合蛋白。表达该融合蛋白的大肠杆菌细胞的荧光比表达与该铁蛋白融合的折叠型报导蛋白GFP的细菌细胞强50倍，只表达SFGFP的细菌荧光也比只表达折叠报导剂GFP的细菌强约2倍。因此将其命名为“超折叠GFP，简写为 SFGFP” [Pedelacq J-D 等；Naturebiotechnolegy. 24(1) :79-88,2006]。本文所用术语“环重排(或环变换)”指采用基因工程技术，如聚合酶链式反应(PCR)，在GFP中的β片层和连接小环所选的特定位点(除活性位点外)氨基酸的编码核苷酸序列进行扩增导致环重排，虽然导致产生新的C-末端和N-末端但不改变重排蛋白的基本结构和生物学活性而且可能改进其稳定性。已用这种技术对20多种蛋白的编石马核酸序列进行重环排[Rojas. Α·等·，Biologia. 54 :255-277,1999 ；Iwakura 等.NatStructBiol. 7 :580-585，2000]，包括对荧光蛋白的编码核酸序列进行环重排[Nagai. T等·，Proc Natl Acad Sci USA 98 :3147-3202,2001 ;Roger. Y. Tsien 和 Geoffrey Baird.US 7, 060, 793 ；以及 Jason Jui-Hsuan Chiang, Isaac Li 和 Kevin Truong., BiotechLetters 28:471-475,2006]。本发明采用 Roger. Y. Tsien 和 Geoffrey Baird 美国专利 US7，060, 793. 2006所述的环重排技术，对SFGFP编码基因进行定点扩增时(见实施例1_2， 3)，避开65-67位氨基酸生色基团，分别在其39、或91、或129位氨基酸密码子等处进行扩增，导致环重排。例如以两个串联融合的SFGFP为基础在它们的第39位氨基酸密码子等处进行扩增，对SFGFP进行环重排，得到的突变体序列为“第一个SFGFP分子的第40-239位氨基酸+柔性接头+第二个SFGFP分子的第1-39位氨基酸”形成环(园桶)状重排结构的cpSFGFP(见实施例1-1)。从重新置换后得到的众多蛋白突变体中挑选出保持原蛋白荧光强度或更高的和对次氯酸反应性更好的cpSFGFP。本文所用术语“柔性接头”指连接融合蛋白中的二个SFGFP蛋白之间的短肽，柔性指可屈曲在空间结构上不影响二蛋白(如SFGFPl和SFGFP2)的正确折叠。例如，一个短接头肽的氨基酸序列为GGGS，其编码核苷酸序列为GGTGGCGGATCC。本文所用术语“质粒”或“质粒载体”指通常携带有基因的染色体外元件，它不是细胞中心代谢的一部分，通常是环状双链DNA分子形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线形、环状或超螺旋形的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列连接或重组入独特构建物中，这种构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列一起引入细胞。本文所用术语“截短突变”指缺失SFGFP氨基酸序列N-末端或C-末端I个至若干个氨基酸的突变，及其对应的核苷酸序列的改造。本发明中采用TAKARA公司的定点突变试剂(Site-Directed Mutagenesis)盒,按盒中提供的方法构建截短克隆(见图2)。该方法设计一对5’端邻接、3’端方向相反的导入突变点的引物,用高保真DNA聚合酶(PyrobestDNA聚合酶)进行PCR扩增，在同一体系内对PCR产物进行末端平滑化及5’磷酸化反应10分钟，再用高效连接试剂Ligation Solution I进行自身连接(环化)0.5-1小时。然后用所得质粒转化大肠杆菌挑选变异体。本发明构建各种cpSFGFP的主要技术，是本领域从所周知的“聚合酶链式反应(PCR)”，按J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，597-632页，2002年8月，科学出版社出版，北京)进行。其中采用高保真DNA聚合酶PFU，以母链DNA序列为模板，以根据模板设计的特定引物为延伸起点，通过变性、扩增、退火、延伸等步骤，体外大量复制出与母链模板DNA互补的子链DNA产物。本发明的一个方面，提供一类对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光蛋白突变体cpSFGFP的编码基因，在一些实施方式中，该编码基因的核苷酸序列是由柔性接头相连的二个SFGFP基因序列进行环重排而得。较佳地，通过基因工程技术，对编码第一个SFGFP蛋白第39位氨基酸密码子核苷酸序列到编码第二个SFGFP蛋白第214位氨基酸密码子的核苷酸序列之间任意位点进行扩增，导致环重排；例如，从编码第一个SFGFP蛋白的第39、或91、或129、或140、或145、或189、或195或214位氨基酸密码子的核苷酸序列开始，中间包括一短肽接头编码序列，到编码第二个SFGFP蛋白的第40、或92、或130或141或146、或190、或196或215位氨基酸密码子的核苷酸序列为止进行扩增，导致环重排，选择得到对次氯酸浓度变化有良好反应的多个cpSFGFP突变蛋白的编码基因。在一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP39/40的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP91/92的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP 129/130的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP140/141的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP145/146的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP189/190的编码基因。在另一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP195/196的编码基因。在还有一个实施方式中，所述重排的cpSFGFP的编码基因为cpSFGFP214/215的编码基因。本发明的另一方面，提供通过基因工程技术进一步对上述经环重排选出的对次氯酸选择性和灵敏度比较好的cpSFGFP，例如cpSFGFP145/146蛋白，截去其C-末端或N-末端的I个、或2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个氨基酸，选择得到对次氯酸浓度变化有良好反应的多个cpSFGFP突变蛋白，本发明提供这类cpSFGFP突变蛋白的编码基因。在一类实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因。在一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N146)的编码基因。在另一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N147)的编码基因。在另一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N148)的编码基因。在另一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N149)的编码基因。在另一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N150)的编码基因。在另一个实施方式中，提供N-末端截短的重排cpSFGFP145/146(N151)的编码基因。在还有一个实施方式中，提供N-末端截短的重排 cpSFGFP145/146(N152)的编码基因。在另一类实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因。在一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146(C143)的编码基因。在另一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146(C142)的编码基因。在另一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146(C141)的编码基因。在另一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146(C140)的编码基因。在另一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146(C139)的编码基因。在还有一个实施方式中，提供C-末端截短的重排cpSFGFP145/146 (C138)的编码基因。本发明的另一方面，提供一类包含上述对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光蛋白突变体cpSFGFP的编码基因的重组质粒载体。在一些实施方式中，所述质粒载体是原核表达质粒，如pET28a质粒和pRSETb质粒。在另一些实施方式中，所述质粒载体可以是真核表达质粒，如PVAX-I质粒。例如，在一些具体实施方式
中，本发明提供 pRSETb-cpSFGFP39/40、pRSETb_cpSFGFP91/92、pRSETb-cpSFGFP 129/130,pRSETb-cpSFGFP140/141、pRSETb-cpSFGFP145/146, pRSETb-cpSFGFP189/190,pRSETb-cpSFGFP195/196、pRSETb_cpSFGFP214/215 重组质粒。在另一些具体实施方式
中，本发明提供 pRSETb-cpSFGFP145/146(N146)、pRSETb-cpSFGFP145/146(N147)、pRSETb-cpSFGFP145/146 (N148)、pRSETb-cpSFGFPI 45/I 46 (NI 49)、pRSETb-cpSFGFP145/146(N150)、 pRSETb_cpSFGFP145/146(N151)和pRSETb-cpSFGFP145/146 (N152)重组质粒。在另一些具体实施方式
中，本发明提供 pRSETb-cpSFGFP145/146 (C143)、pRSETb-cpSFGFP145/146 (C142)、pRSETb-cpSFGFP145/146(C141)、 pRSETb_cpSFGFP145/146(C140)、pRSETb-cpSFGFP145/146 (C139)和 pRSETb_cpSFGFP145/146 (C138)重组质粒。本发明的另一方面，提供一种用上述重组质粒载体转化的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在另一些实施方式中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞包括人、非人灵长类动物、小鼠、牛、猪、羊、马、大鼠、兔、狗、猫和豚鼠的细胞。在本发明的另一方面，提供一类用上述重组质粒载体转化宿主细胞(例如大肠杆菌细胞)表达产生并经纯化的上述对次氯酸具有高选择性高灵敏度的新型绿色荧光cpSFGFP突变蛋白。这类纯化的突变蛋白包含环重排的SFGFP多肽的氨基酸序列和其中的生色基团，具有对次氯酸高选择性高灵敏活性。本发明还提供用cpSFGFP突变蛋白检测次氯酸的用途，包括I. cpSFGFP与次氯酸反应时，cpSFGFP的荧光强度会随着次氯酸水平的变化而变化，即随着次氯酸水平的升高而降低，从而可对次氯酸的浓度进行定量或半定量检测；2.可通过基因工程技术将cpSFGFP基因与编码相关蛋白的基因融合再通过质粒导入细胞内，通过融合伴侣定位于不同的亚细胞器，实时定位监测细胞内次氯酸水平的变化。而传统的次氯酸有机化学探针有细胞毒性，可溶性和稳定性差不能用于细胞检测。实验证明，与文献报道的采用野生型GFP或其改进型变体蛋白(如SFGFP)检测次氯酸相比，本发明所提供的cpSFGFP探针对次氯酸浓度变化的反应更灵敏，更稳定，选择性更好。本发明的cpSFGFP次氯酸探针为蛋白质，对生物体没有有机化学探针那样的细胞毒性，将来可考虑利用原核细胞或真核细胞表达系统，与有关蛋白融合在细胞内不同的亚细胞器中定位表达，对细胞内的HOCI水平作实时监测。次氯酸作为一种特殊的活性氧(ROS)物质与许多生理和病理状态相关，乐观地预计本发明研制的这种探针不仅可为今后的HOCl研究提供一种良好、稳定、快速的检测探针和方法，还可通过深入研究HOCl生理功能与疾病的关系为治疗药物的开发提供理论与实际依据。附图的简要说明图I是SFGFP结构支架示意图。SFGFP包含enGFP的折叠增强突变F64L和S65T、 折叠型报导蛋白GFP的突变F99S、M153T、V163A(黑园点)和6个新的突变:S30R、Y39N、N105T、Y145F 和 A206V(白园点)。图2是TaKaRa公司定点突变方法各步骤的示意图。图3用Ni2+柱纯化得到的SFGFP和cpSFGFP91/92蛋白样品的SDS-PAGE电泳图。显示这两种蛋白的纯度均达到95%以上(分别见图中的1-200和2-200条带)。
图4-图7显示用次氯酸滴定试验检测几个代表性cpSFGFP对次氯酸浓度变化的反应，并与对照GFP、mCherry、SFGFP相比。图中的CPxx、Nxxx和Cxxx为简写,分别见实施例1、2和3。图8是过氧亚硝酸滴定试验，显示各cpSFGFP对过氧亚硝酸浓度的变化没有显著反应。图9是超氧阴离子检测试验，显示超氧阴离子对SFGFP和cpSFGFP91/92的荧光强度无明显影响，因而不能用它们检测超氧阴离子。
图10是羟基自由基检测试验，显示较高浓度的羟基自由基才对SFGFP和cpSFGFP91/92的荧光强度有所影响，因而不能用SFGFP和cpSFGFP91/92检测细胞中的低含 量羟基自由基。图11是单态氧检测试验，显示SFGFP和cpSFGFP91/92对单态氧的反应性；cpSFGFP91/92对HOCl非常敏感，而对HOCl和H2O2共同存在产生的单态氧不敏感。图12显示用cpSFGFP91/92_mCherry融合蛋白检测次氯酸的结果,表明该融合蛋白中的mCherry对次氯酸浓度变化仍没有反应，而其中的cpSFGFP91/92对次氯酸浓度变化反应十分明显，因而以mCherry作为阴性对照可更有利地用作次氯酸的高选择性高灵敏检测探针。
具体实施例方式以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如简·罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。 实施例中所用的pET28a质粒载体购自Novagen公司，pRSETb质粒载体购自Invitrogen公司，均为原核表达载体，含有His标签、氨苄青霉素抗性基因、T7启动子和IacI基因，可用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中诱导表达目的蛋白。所有用于PCR的引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。Ndel、BamHI等限制性内切酶、T4连接酶购自Fermatas公司，购买时附带有10 X Tango 缓冲液等。T4连接酶分为低浓度酶(lU/mL)和高浓度酶(5U/mL)，前者用于粘性末端连接，后者用于平末端连接。化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公司。实施例I. pRSETb-cpSFGFP克隆质粒载体的构建I. SFGFP重组质粒构建通过计算机上网 http://www. ncbi. nlm. nih. rov/protein/2B3P A 检索获得SFGFP编码基因序列(见序列表)。为在原核生物中更好表达，设计在原序列的第3个碱基后插入KOZACK序列(GTG)，然后由南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成该序列作为模板。设计引物 PI (正向，TATTCATATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG)和 P2 (反向，TATTGGATCCGCCACCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC)，见引物列表。Pl 含NdeI 酶切位点，P2含接头(GGTGGCGGATCC)，其中包括BamHI酶切位点。以SFGFP编码基因为模板，PCR扩增SFGFP核苷酸序列。
_PCR扩增反应体系包含_
模板序歹Li (5 Ong/pL)_0.5 pL
_正向引物_2μL
_反向引物_2μL10 X PFU 缓冲液_5μL
高保真DNA聚合酶PFU 0.5pL
_dNTP_3μL
_灭菌超纯水_3 μL
_总体积_50 μLPFU购自天根生化科技(北京)有限公司，IOX缓冲液、dNTP为PFU购买时附带。
_PCR扩增步骤_
变性95°C5min
r 94°C30s
30轮循环彳 55°C 30sL 72°C lmin45s延伸_7￡C_I OminPCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离目的扩增子DNA条带，用加拿大BBI公司的DNA凝胶回收试剂盒回收该扩增子。用NdeI、BamHI分别双酶切质粒载体pET28a和纯化的扩增子。
权利要求
1.一种对次氯酸具有高选择性的绿色荧光突变蛋白cpSFGFP的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列由一柔性短肽接头编码序列相连的二个SFGFP基因序列I通过环重排而形成。
2.如权利要求I所述的编码基因，其中所述编码基因选自序列3所示cpSFGFP39/40的编码基因、序列5所示的cpSFGFP91/92的编码基因、序列7所示的cpSFGFP 129/130的编码基因、序列9所示的cpSFGFP140/141的编码基因、序列11所示的cpSFGFP145/146的编码基因、序列13所示的cpSFGFP189/190的编码基因、序列15所示的cpSFGFP195/196的编码基因和序列17所示的cpSFGFP214/215的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其中所述编码基因选自N-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因N_端截短的重排cpSFGFP145/146 (N146)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N147)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N148)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146(N149)的编码基因、N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N151)的编码基因和N-端截短的重排cpSFGFP145/146 (N152)的编码基因。
4.如权利要求2所述的编码基因，其中所述编码基因选自C-末端截短的重排cpSFGFP145/146的编码基因=C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C143)的编码基因、重排 cpSFGFP145/146 (C142)的编码基因、C-端截短的重排 cpSFGFP145/146 (C141)的编码基因、C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C140)的编码基因、C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C139)的编码基因和C-端截短的重排cpSFGFP145/146 (C138)的编码基因。
5.一种重组质粒载体，包含权利要求I所述编码基因。
6.一种由权利要求5所述重组质粒载体转化的宿主细胞。
7.一种由权利要求I所述编码基因编码、通过转化大肠杆菌诱导表达产生并纯化而得的对次氯酸具有高选择性的绿色荧光cpSFGFP突变蛋白。
8.权利要求7所述cpSFGFP突变蛋白作为次氯酸检测探针的用途。
全文摘要
本发明提供一种对次氯酸具有高选择性的绿色荧光突变蛋白cpSFGFP的编码基因、包含该编码基因的重组质粒载体、用该重组质粒载体转化的宿主细胞，以及该宿主细胞表达的由所述编码基因编码的对次氯酸具有高选择性的绿色荧光cpSFGFP突变蛋白。这种重组cpSFGFP突变蛋白可用作次氯酸检测探针。本发明所提供的cpSFGFP突变蛋白探针对次氯酸浓度变化的反应比野生型GFP或其变体蛋白如SFGFP更灵敏，更稳定，选择性更好。
文档编号G01N21/64GK102618548SQ20111002956
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者徐磊, 朱青, 杨弋 申请人:华东理工大学