专利名称：食品中动物用药残留的检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种侦测食品中动物用药残留的检验试剂套组，特别是以利用磁性纳米粒子的磁性标记免疫測定配合測量磁减量的方式来做检验。
背景技术：
动物用药品及含药物饲料添加物虽可维护畜禽水产动物健康，促进畜牧事业发展，但若不当使用则会造成食品中的残留，或可能传递抗药性菌株，引起食品安全之疑虑，直接或间接危害国民健康。为预防并遏止动物用药品被滥用于产食动物，配合中国台湾地区卫生署订定的《食品中动物用药残留标准》，中国台湾地区药检局自92年起即协调县市卫生局，稽查传统市场、超级市场、生鮮超市、商号、肉铺、餐厅、小吃店、海产店等，抽验市售农畜禽水产品及其加工制品等进行动物用药残留检测，检测项目包括氯霉素、羟四环霉素、氯四环霉素、脱氧轻四环霉素(doxycycline)、四环霉素、诺伯霉素、乃卡巴精(nicarbazin)、こ型受体素类(β-Agonists)、孔雀绿、还原型孔雀绿、硝基呋喃代谢物及喹诺酮(Quinolone)类动物用药等。历年市售农畜禽产品中残留动物用药抽验结果，禽产品的不合格率相对较高，其中鸡肉不合格率约10. 0%，乌骨鸡为40. 0% 50. 0%，鸡内脏为30. 0% 33. 3%，鹅肉14. 6%，蜂产品中蜂王浆不合格率为10. 0% 30. 0%。鸡肉检出不符规定药品项目为乃卡巴精及脱氧羟四环霉素，乌骨鸡主要为恩氟奎林羧酸，其次为脱氧羟四环霉素，鸡内脏为乃卡巴精，鹅肉为沙丁胺醇(salbutamol)及莱克多巴胺(ractopamine),蜂王衆为氯霉素及四环霉素类抗生素。历年市售水产品中残留动物用药抽验結果，鱼类产品的不合格率相对较高，香鱼的不合格率为5. 3% 22. 2% ;鳟鱼为5. 3% 60. 0% ;石斑鱼为27.2% ;吴郭鱼为3. 8% 18. 1%，虾类为10. 0%。其中鳟鱼为检出氯霉素及硝基呋喃代谢物风险高产品；香鱼不符规定药品项目为恩氟奎林羧酸及硝基呋喃代谢物；吴郭鱼为氯霉素及还原型孔雀緑；鳗鱼及石斑鱼为硝基呋喃代谢物及还原型孔雀緑。由上述资料来看，动物用药残留于食品内的比例甚高，而检测必然会持续进行，以保护国人的健康。目前用来检测水产品中动物用药残留的仪器主要是液相层析质谱仪(LC/MS/MS)，其对各种动物用药残留的检验灵敏度约是零点几个ppb ( 10,)。使用LC/MS/MS进行动物用药残留，固然很精确，但在商业应用上，仍呈现出许多问题；如必须对所取得的水产品进行繁杂且冗长的前处理程序后，才能使用LC/MS/MS量测药残含量；LC/MS/MS的操作，必须在20-25°C的环境下，因此需要一个特别的空间来安置LC/MS/MS ；LC/MS/MS的精确操作与维护，实不容易，故需聘请一位受过专业训练的人员，专职负责操作该仪器，无形中限制了该技术的应用层面，亦増加检测成本。近年来，虽然有众多的研究团队欲使用ELISA及其它已有的技术进行动物用药残留检验，然而常因检测时的操作复杂度、或过高的假阳假阴性，而无法将该种技术普遍地推广。因此，市场上仍期待能开发出ー种在水产品中动物用药残留的检测技木，以符合市场所需。
发明内容
本发明提供了ー种用于检测食品中动物用药残留的试剂，包括多个磁性纳米粒子，分布于溶液中；其中磁性纳米粒子的构造为ー个磁性核；ー个界面活性剂层，被覆于该磁性核上；以及待测的动物用药抗体，结合于该界面活性剂层上。本发明中所指的磁性核，其材料包括但不限于Fe3O4, Fe2O3, MnFe2O4, CoFe2O4及NiFe2O4,于较佳的实施例中，磁性核的材料为Fe3O4。本发明中所指的 界面活性剂是指能使目标溶液表面张カ显著下降的物质，以及降低两种液体之间表面张カ的物质，界面活性剤一般为具有亲水与疏水基团的有机两性分子，可溶于有机溶液和水溶液。于本发明中，所使用的界面活性剤材料包含但不限于有机酸、蛋白质A、蛋白质G、葡聚醣或微脂粒，于较佳的实施例中，界面活性剤的材料为葡聚醣。本发明中,可测试的动物用药包含但不限于氯霉素(Chloramphenicol,CAP)、轻四环霉素、氯四环霉素、脱氧羟四环霉素、四环霉素、诺伯霉素、乃卡巴精、こ型受体素类、孔雀绿、还原型孔雀緑、硝基呋喃代谢物及喹诺酮(Quinolone)类，于较佳之实施例中，本发明检测的动物用药为氯霉素。在本发明中，所指的动物包含任何可食用的动物，于较佳的实施例中，动物为水产动物，于更佳的实施例中,此水产动物为虾。本发明另提供一种检测食品中动物用药残留的方法，包括提供本发明的萃取检体内残留的动物用药，将萃取物与试剂混合后，量测磁减量讯号，且比对受测药物的磁减量讯号标准曲线，以定量动物用药的残留量。由于每颗单独磁性核的磁偶极方向，在没有外加磁场时，由于热运动，每颗磁性核的磁偶极方向都是指向随意的方向，而各方向的机率都是ー样的，因此，当检测试剂无外加磁场下，并不会表现出磁性。当外加磁场为交流变化时，单颗磁性纳米粒子因为磁作用，会随外加交流磁场转动，因而使试剂产生交流磁化率。而当试剂与样品混合后，部分的纳米粒子上的抗动物用药抗体会与待测样品中的动物用药相结合，造成磁性纳米粒子体积变大，或多颗纳米粒子聚集成磁性纳米粒子的丛集。如此ー来，会使与待测动物用药相结合的磁性纳米粒子无法再随着外加交流磁场转动，而造成试剂的交流磁化率减小；因此，若待测样品中含有越多的残留动物用药，会有越多的磁性纳米粒子与其结合，而使试剂的交流磁化率降低越多。因此，检测出样品中磁化率減少多少的量，即可比对该动物用药的磁减量讯号标准曲线，以定量动物用药的残留量。为配合本发明的检验方式，本发明另提供ー种萃取检体内残留的动物用药的方法，其步骤为(I)、将检体打成泥状，(2)、加入萃取液萃取后离心留上清液，(3)、以低压真空挥发法(使用抽气帮辅协助萃取液的挥发)，使该上清液浓缩干燥，且(4)、以稀释液溶解该浓缩干燥物。本发明方法中的萃取液为有机溶剂，于较佳的实施例中，萃取液为こ酸こ酷；于较佳的实施例中，稀释液则为ニ甲基亚砜以及磷酸盐缓冲液。若想要得到较佳的萃取率，步骤(2)可重复多次以提高萃取率。此萃取方式萃取程序需时约60分钟，现行用于LC/MS/MS的萃取程序需时约180分钟，大大的缩减了萃取的时间，并且不需要再用正己烷进行繁杂的萃取步骤。本发明所开发出的萃取程序，相较于现行用于LC/MS/MS的萃取程序，能有效提升萃取时效，并增加萃取程序的使用便利性。且本萃取程序中所使用的仪器较为简易。例如现行用于LC/MS/MS的萃取仪器,需要使用减压真空浓缩机(vacuum evaporator),在本发明的萃取程序中，不需使用，而是以一个抽气帮辅协助萃取液挥发的简易的帮辅来取代。如此，不仅可降低检测成本，亦有助于将来对动物用药残留检测的推广。本发明的检测食品中动物用药残留的方法，其中的动物体内药物包括但不限于氯霉素、羟四环霉素、氯四环霉素、脱氧羟四环霉素、四环霉素、诺伯霉素、乃卡巴精、こ型受体素类、孔雀绿、还原型孔雀緑、硝基呋喃代谢物及喹诺酮(Quinolone)类，较佳实施例中的动物用药为氯霉素。
图Ia为本发明的检测试剂示意图；图Ib为检测试剂接合待测物的示意图；图2为合成出的氯霉素检测试剂中的磁性粒子粒径分布图；图3a为表面接有氯霉素抗体(Anti-CAP)的磁性纳米粒子与附有FITC的ニ级抗体的示意图；图3b为表面接有氯霉素抗体(Anti-CAP)的磁性纳米粒子与附有FITC的ニ级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的移动行为图；图3c为表面接有氯霉素抗体(Anti-CAP)的磁性纳米粒子与附有FITC的ニ级抗体在荧光显微镜下观察到受磁铁吸引的移动行为图； 图4为氯霉素磁减量检测的标准曲线；图5为含有不同干扰物的溶液对氯霉素磁减量讯号的影响比较图；图6为本发明实施例四的从虾中萃取氯霉素的流程图；图7为MR以及LC/MS/MS检测结果的相关度曲线图。
具体实施例方式下列实施例仅代表本发明几种不同态样及特征，但不用于限制本发明的内容。实施例ー试剂合成将化学计量比率为I : 2的硫酸亚铁七水(FeSO4 · 7H20)与氯化铁六水(FeCl3 · 6H20)混合的铁溶液与等量的水性葡聚醣，使其作为四氧化三铁的接ロ活性剂而能使其分散在水中。该混合物加热至70-90°C并以强碱溶液滴定形成黒色的四氧化三铁粒子。丛聚物以及多余的葡聚醣则以离心的方式移除，并以凝胶过滤层析已获得高度浓缩的磁流体。该试剂可透过PH-7. 4的磷酸盐缓冲液稀释以获得合适的浓度。为了使抗体结合至磁性纳米粒子外层的葡聚醣上，以抗氯霉素抗体(Ab35658-500，Abeam)为例，加入NaIO4溶液至磁性溶液中，使葡聚醣氧化以得到醛基(-CH0)，之后，葡聚醣可透过-CH = N-的连结与抗氯霉素抗体反应，因而能使抗氯霉素抗体共价的连接到葡聚醣上，如图Ia所示。未接合的抗氯霉素抗体则可透过磁性分离，从溶液中移除，此试剂可于检体内的待测样品结合，而造成磁化率的降低，如图Ib所示。使用磁力显微镜(magnetic force microscope, MFM),量测到所合成出的氯霉素检测试剂中的磁性粒子粒径分布如图2所示。粒径平均值在63nm，标准差为3. 5nm。为确定磁性粒子表面有接合上氯霉素抗体，本实施例使用一端接有FITC荧光(异硫氰酸突光素，Fluorescein isothiocynate)的ニ级抗体,来标示披覆在磁粒子表面的氯霉素抗体，如图3a所示。实验中，加入过量的FITC ニ级抗体与披覆有氯霉素抗体的磁性粒子混合。充分混合后，再通过磁性分离技木，将混合液中的磁性粒子分离出，而未与磁性粒子表面的氯霉素抗体接合的FITC ニ级抗体，因不具有磁性，会留在原混合液中。将分离出的磁性粒子再分散到PBS溶液中。由于荧光标记FITC可吸收495nm波长的紫外光，并发散528nm波长的绿光，因此，将此溶液放入荧光显微镜下观察，首先会看到绿色亮点，如图3b中箭头所指之处。此亮点是FITC所发出的光亮。继之，在溶液旁摆上磁铁。此时溶液中的磁性粒子会受到磁铁的吸引而移动。倘若磁性粒子表面已接上氯霉素抗体，附有FITC的ニ级抗体会应与磁性粒子上的氯霉素抗体結合，而披覆在磁珠表面上。当磁珠受到磁铁的吸弓I而移动时，图3b所观察到的绿色亮点，也会往磁铁的方向移动。本实施例中，将磁铁放于图3b的下方，磁性粒子应该往下方移动，因此图3b的绿色亮点也应该往下方移动。此预测在图3c中被观察到,这证实磁性粒子上确实已接上氯霉素抗体(Anti-CAP)。实施例ニ氯霉素含量的磁减量标准曲线建立不同量的氯霉素(C1863-25G，Sigma)溶于pH_7. 4的磷酸盐缓冲液以获得不同浓度由O. lng/g至30ng/g的标准氯霉素溶液。每种浓度的标准氯霉素溶液作三重复的磁减量(IMR)测试，测试方法如下40μ I的磁试剂与60 μ I的不同浓度的标准氯霉素溶液于玻璃管中混合，MR检测使用的磁试剂浓度为O. lemu/g( = 5mg-Fe/ml)。先以磁性免疫分析仪(XacPro-E IO I, MagQu)量测未结合成氯霉素-抗氯霉素抗体-葡聚醣-纳米磁性粒子前的X ac,0交流信号，之后，不同浓度的混合物于室温下形成氯霉素-抗氯霉素抗体-葡聚醣-纳米磁性粒子，量测并纪录其交流信号Xip透过量测出的xac,0及Xip可用下列的公式计算出IMR讯号。IMR(%) = (xac,0-xac,Φ)/Χ3ε,0χ 100%对每ー个给定浓度的样品溶液，其时间依赖的Xa。交流信号皆检测三次重复。可获得如图4的MR讯号为氯霉素浓度(ΦαΡ)函数的实验图。图4中可见MR讯号随着氯霉素浓度的增加而降低，而当磁性免疫分析仪(XacPro-ElOl, MagQu)分析的IMR讯号几近噪声(约为虚线所示的O. 82%)时，氯霉素的浓度低于O. lng/g。由以前的试验结果可知，待测物浓度与MR讯号符合下列的逻辑特函数(Logistic Function)
权利要求
1.ー种用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，包括 多个磁性纳米粒子，分布于溶液中，其中磁性纳米粒子的构造为ー个磁性核， ー个界面活性剂层，被覆于该磁性核上，以及 待测的动物用药抗体，结合于该界面活性剂层上。
2.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述磁性核的材料选自 Fe304、Fe203、MnFe2O4, CoFe2O4 和 NiFe204。
3.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述磁性核的材料为Fe304。
4.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述动物用药选自氯霉素、羟四环霉素、氯四环霉素、脱氧羟四环霉素、四环霉素、诺伯霉素、乃卡巴 精、こ型受体素类、孔雀绿、还原型孔雀緑、硝基呋喃代谢物和喹诺酮类。
5.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述的动物用药为氯霉素。
6.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述的动物用药为硝基呋喃代谢物。
7.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述界面活性剂选自有机酸、蛋白质A、蛋白质G、葡聚醣和微脂粒。
8.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述界面活性剂为葡聚醣。
9.如权利要求I所述的用于检测食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述的动物为水产动物。
10.如权利要求9所述的用于食品中动物用药残留的试剂，其特征在于，所述水产动物为虾。
全文摘要
本发明提供一种食品中动物用药残留的检测试剂，该试剂为带有抗动物用药抗体的生物化磁性纳米粒子，其与待测样品混合，由于磁性纳米粒子上的抗体与动物用药结合，而造成磁化率的降低，进而可得知食品中动物用药残留的量。
文档编号G01N27/76GK102650634SQ20111004439
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月24日 优先权日2011年2月24日
发明者杨谢乐 申请人:磁量生技股份有限公司