Mep1a基因及其表达产物的应用的制作方法

文档序号:6006630阅读:256来源:国知局
专利名称:Mep1a基因及其表达产物的应用的制作方法
技术领域
本发明涉及ー种基因的应用,特别是涉及ー种MEPlA基因及其表达产物的应用。
背景技术
肝癌的诊断,尤其是早期诊断,是临床诊疗和预后的关键。可用作原发性肝癌标志物的生物分子,通常认为有以下四类癌胚和糖蛋白抗原;酶和同エ酶;细胞因子;基因。目前,在我国,对肝癌的定性诊断以检测血清AFP(甲胎蛋白)为主,诊断依据是60%以上的肝癌病例,血清AFP浓度大于400 μ g/L。虽然AFP的敏感性(40% 65% )和特异性(76% 96%)均不令人满意,但由于目前还没有其他肿瘤标志物的特异性可与AFP 相媲美,且血清AFP的检测较少依赖影像学设备和新技术,因此,AFP仍然是目前全球范围内应用最广泛的肝癌肿瘤标志物。除AFP外,近年来用于肝癌检测的其他血清标志物还包括:AFP异质体、Y -谷氨酰转肽酶同エ酶II (GGT-II)、碱性磷酸酶同エ酶I、醛缩酶同エ酶A(ALD-A)、岩藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、异常凝血酶原、铁蛋白与酸性铁蛋白等。AFP异质体和异常凝血酶原的应用提高了肝癌患者的检出率,但早期诊断和指导个性化治疗的分子分型诊断仍是我们面临的极大挑战,而发现灵敏度和特异性更高的新的肿瘤标志物,是提高肝癌早期诊断水平的关键。肝癌的治疗在过去20年里取得了很大的进展,出现了ー些局部非手术治疗方案。例如,经导管动脉内化疗栓塞(TACE),是中晚期肝癌治疗的重要手段,可使90%以上的肝癌患者受益;经皮肝穿刺瘤内无水こ醇治疗(PEI),也是常用的局部化疗方法,对癌直径小于3厘米的肝癌及门静脉癌栓有一定疗效。但是,由于目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物,针对性较差,因此,总体疗效不佳,迫切需要寻找新的作用靶点,研究和开发肝癌特异的新药物,以提高化疗的特异性和有效性。MEPlA基因,定位于人6号染色体(小鼠17号染色体)长臂上炎症性肠病易感区域上,编码金属蛋白酶meprinA中的α亚基,在肠内上皮组织中表达。Meprins由α、β两个亚基组成,编码它们的基因定位于不同的染色体上。两个亚基均有蛋白水解酶活性,并且能够降解不同的蛋白,包括细胞基质成分,例如胶原蛋白IV、层粘连蛋白、巢蛋白、纤维连接蛋白。

发明内容
本发明要解决的技术问题之ー是提供ー种MEPlA基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。本发明要解决的技术问题之ニ是提供ー种MEPlA基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明要解决的技术问题之三是提供ー对特异扩增MEPlA基因的引物,该引物可用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌的产品。
本发明要解决的技术问题之四是提供两对MEPIA基因的siRNA,该两对siRNA可用于制备治疗肝癌的药物。为解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现在本发明的ー个方面,提供了ー种MEPlA基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝癌的产品。所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增MEPlA基因的引物。 所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增MEPlA基因的引物。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括与MEPlA蛋白特异性结合的抗体,包括多克隆抗体和单克隆抗体。所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括与MEPlA基因的核酸序列杂交的探针。所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括与MEPlA基因的核酸序列杂交的探针。在本发明中,可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对MEPlA蛋白特异的抗体。例如,将提纯的人MEPlA基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样,表达人MEPlA蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体,这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的抗体包括可以阻抑MEPlA功能的抗体,也可以是不影响人MEPlA功能的抗体。每ー类抗体都可以通过对人MEPlA基因产物的片段或功能域致免疫而产生,而人MEPlA基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的MEPlA基因产物结合的抗体,可以利用在原核细胞例如E. coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化MEPlA蛋白或多肽结合的抗体,可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。在本发明中,所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其他衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15 25个碱基对最佳。所述探针自身互补最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。在本发明的另一方面,提供了ー种MEPlA基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制MEPlA基因表达的双链核糖核酸,或用于抑制MEPIA蛋白活性的蛋白质。在本发明的另一方面,提供了 ー对特异扩增MEPlA基因的引物,用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌的产品,该引物对的上游引物序列具有如SEQID NO :1所示的序列或其互补序列,下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互补序列。在本发明的再一方面,提供了两对MEPlA基因的siRNAs,用于制备治疗肝癌的药物,其中,ー对siRNA的正义链具有如SEQ ID NO :7所示的序列,反义链具有如SEQ ID NO:8所示的序列;另ー对siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 9所示的序列,反义链具有如SEQID NO: 10所示的序列。本发明通过实验证实MEPlA基因在肝癌组织的表达明显高于癌旁组织,因此,MEPlA基因可作为诊断肝癌的特异性标志基因,使肝癌诊断更加准确、快速。MEPlA基因还可作为治疗肝癌的药物的靶基因,为肝癌的防治提供新的途径。


图I是实施例I中RT-PCR验证MEPlA基因在19例肝癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图,图I中,“N”指癌旁组织,“C”指肝癌组织;结果显示9例(47. 4% )病人中癌组织MEPlA基因表达水平高于相应癌旁组织;
图2是实施例2中实时定量PCR检测MEPlA基因在14种人体正常组织(脑、心、肺、脾、肾、胃、食管、小肠、卵巣、前列腺、胰腺、肝、胎肝及睾丸)的表达;图3是实施例I中RT-PCR分析MEPlA基因在16种肝癌细胞中的表达;图4是实施例5中细胞克隆形成分析RNA干扰MEPlA基因对细胞克隆生成能力的影响;结果显示MEPlA基因受到沉默后肝癌细胞Huh-7的克隆形成能力明显减少;图5是实施例6中流式细胞仪分析RNA干扰MEPlA基因对细胞周期的影响;图6是实施例7中,过量表达MEPlA基因对肝癌细胞Focus克隆形成能力、细胞周期的影响。
具体实施例方式下面结合附图和实施例,对本发明作进ー步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册· (NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I RT-PCR检测MEPlA基因在肝癌组织及肝细胞系中的表达情况I.组织分离实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人。手术切除的肝脏ー经离体,迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织,放入液氮中(_80°C )保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。2.抽提总 RNA采用Invitrogen公司的Trizol试剂,按照常规的抽提步骤,抽提总核糖核酸(RNA)。该Trizol试剂是基于酸性酚ー步抽提法生产的。抽提所用器皿和水均进行核糖核酸酶灭活处理,以保证实验中无核糖核酸酶的环境。核糖核酸(RNA)抽提步骤RNA提取的一般步骤是破碎组织一分离RNA —沉淀RNA —洗涤RNA —融解RNA —保存RNA。破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分离RNA—半用酚、氯仿等有机溶剤,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA—般分布于上层,与蛋白层分开。沉淀RNA—般用こ醇、3M NaAc (pH-5. 2)或异丙醇。洗涤RNA使用70%こ醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干こ醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存ー个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA :加入NaAc 至 O. 3M, 12,OOOXg 离心 5 分钟。
3. cDNA 的合成(I)在冰浴离心管中加入模板RNA 4yL(lyg/yL),随机引物2yL(20pmol/μ L),去离子水5 μ L,混匀,离心3-5秒;(2) 70 V水浴5分钟,冰浴30秒;(3)加入5 X M-MLV逆转录酶第一链缓冲液4 μ L (200U/ μ I), RNase抑制剂I μ L (Ribonuclease Inhibitor, 40U/ μ I,TaKaRa),dNTP 2 μ L (2. 5mM, TaKaRa),(这些应该先配好,然后分再装到每一管),混匀;(4) 37°C水浴5分钟,加入I μ L M-MLV RT反转录酶(200U/ μ I),混匀;(5)37°C水浴I小时(此步是反转录过程);(6) 70°C, 10分钟结束反应,产物置冰上进行下ー步PCR实验,余下的_70°C保存。4. RT-PCR的弓I物设计及扩增理想的引物对只同目的序列两侧的単一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。设计5’端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。避免引物对3’末端存在互补序列,这会形成引物ニ聚体,抑制扩增。避免3’末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。避免3’末端的错误配对。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。避免存在可能会产生内部ニ级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。因此,本实施例中设计的引物具体如下MEPlA-F :5’ -GAAATCCAGAAATGGCCTGA-3’ (SEQ ID NO 1);MEPlA-R :5,-TCCACACAGGACTTGAGACG-3’ (SEQ ID NO 2);β -actin(F) :5,-CATCCTGCGTCTGGACCT-3,(SEQ ID NO :3);β -actin(R) :5,-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO :4)。以β-actin作为内对照,反应混合物中各成分为β-actin(F)、β -actin(R) >MEPlA(F)、MEPIA (R)、10 X PCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分别为O. 2,O. 2,O. 4,O. 4,I. 0,I. O,O. 2,O. I和5 μ LcDNA模板,最后补充ddH20使反应体系为10 μ LoPCR的反应条件如下94 °C,5分钟预变性;94 °C,30秒变性;55 °C,30秒退火;720C,30秒延伸;35个循环,电泳检测PCR扩增产物。5.实验结果显示,MEPlA基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平。根据上述实验结果,可通过RT-PCR诊断肝癌设计MEPlA基因的PCR引物,检测肿瘤组织中MEPlA基因RNA的含量,RNA含量高则说明患肝癌的可能性高,反之则低。实施例2实时定量PCR实验采用相对定量法检测MEPlA基因在肝癌样本中的表达差异。使用日本Takara公司的 TP800 型实时荧光定量 PCR 仪(Thermal Cycler Dice Real Time System)和SYBR Premix Ex Taq 试剂。仪器的使用按厂家的说明操作。 荧光定量PCR(real_time PCR)反应体系总体积 20 μ L,SYBR Premix ExTaq10 μ L,上、下游引物(10ymol/L)各 0.4 μ L,cDNA I μ L,ddH20 8. 2 μ L,混匀试剂,离心后放入PCR仪中进行扩增反应。反应条件95°C变性5秒,68°C退火延伸30秒,40循环。本实施例中设计的引物具体如下MEPlA所用引物与半定量RT-PCR所用MEPlA引物一致,上游引物为5’-GAAATCCAGAAATGGCCTGA-3’ (SEQ ID NO 1);下游引物为5’-TCCACACAGGACTTGAGACG-3’ (SEQ ID NO :2)。管家基因β-actin作为内參,其上游引物为AATCGTGCGTGACATTAAGGAG(SEQID NO 5);下游引物为ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT(SEQ ID NO 6)。实时定量PCR检测表明=MEPlA基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达水平,经t检验,P < 0.001(请參见图2)。该实验结果表明,可通过实时定量PCR诊断肝癌设计MEPlA基因的PCR引物,检测肿瘤组织中MEPlA基因RNA的含量,RNA含量高,则表明患肝癌的可能性高,反之则低。实施例3原位杂交用MEPlA基因探针,与肿瘤切片进行原位杂交,阳性杂交信号越強,患肝癌的可能性越高。实验步骤为将肝脏肿瘤组织取材后OCT包埋、液氮速冻,恒冷冰冻切片,该冰冻切片进ー步用于原位杂交。实施步骤如下(I)冰冻切片与杂交前预处理I)将样品从_80°C取出,用OCT包埋,在-23°C (切片机腔体温度)平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上,切10 μ m厚的连续组织切片,平铺于涂有多聚赖氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片预先经180°C干烤6小吋),保存于-70°C冰柜备用。2)冰冻切片经室温干燥IOmin后,在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin。3)活跃的DEPC-PBS (未高压的O. I % DEPC-I X PBS溶液)洗2次,每次5min。4)在O. 2M的盐酸作用中作用IOmin后,重复步骤4)。5)在切片上滴加蛋白酶K(0. 1^/1111),37で孵育15min,重复步骤4)。6)经O. IM TEA (三こ醇胺)作用5min后,再在新配制的O. 25% ΑΑ/0. IM TEA (こ酸酐/三こ醇胺,pH8. O)中こ酰化IOmin (在大多数实验中,步骤4,5,6省略)。
7) 5 X SSC 中平衡 15min。(2)杂交I)在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μ L/玻片),置于放有湿盒液(50%甲酰胺 ν/ν ;0. 3Μ NaCl ;lmM EDTA ;10mM Tris_Cl,pH8. 0)的湿盒中,55 58°C下的烘箱中预杂交2h。2)甩掉预杂交液,地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度l_2ng/ μ L)经70°C变性10分钟,置冰上lmin,玻片上滴加预杂交液(约60 μ L/玻片),覆盖parafilm膜,放湿盒中在48 58°C下杂交18-30h。
(3)杂交后处理I)取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉杂交液,用52°C预热的5XSSC洗30min。2)在无 DNA 的 RNA 酶 A (20 μ g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min。3)分别依次用52°C预热的2XSSC,1XSSC和O. I X SSC洗2次,每次30min。(4)杂交信号检测I)在缓冲液 A (O. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15Μ NaCl)中平衡 5min。2)在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(I 500 I : 2000稀释于含
O.5%阻断液的缓冲液A中),室温反应2h。3)用缓冲液A洗2次,每次15min。4)在缓冲液 B (O. IM Tris-HCl ;0. IM NaCl ;0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5)中平衡 5min。5)硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中,每ml缓冲液B含有4. 5 μ L NBT和3. 5 μ L BCIP0在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。6)充分显色后,用 EDTA(lmM EDTA, ρΗ8. O)洗 15min 终止反应。7)在95%こ醇中洗Ih以除去非特异的背景。8)用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。9)脱水、透明,用中性树胶封片。10)充分干燥后在显微镜下观察、照相。实施例4免疫检测I.抗原蛋白获得从美国基因库Genebank中获得人MEPlA基因的cDNA序列,通过PCR扩增获得编码框,插入原核生物或真核生物表达载体中,表达MEPlA蛋白,并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。2.抗体制备可采用以下几种方法制备抗体(I)细胞融合法用上述制备的MEPlA蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等),获得脾脏细胞,再与骨髄瘤细胞融合,并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。(2)利用噬菌体表面展示库,克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。(3)利用纯化的蛋白免疫动物,制备多抗血清。3.检测
(I)用制备的抗体(多抗或单抗),用组织化学方法进行肝癌的病理检测,阳性信号为肝癌。(2)取患者血清,用ELISA方法检测,阳性反应为肝癌可疑病人。(3)将MEPlA抗体作为蛋白质芯片的探针之一,用于多种肿瘤诊断。实施例5MEP1A基因的小干扰核糖核酸(siRNA)针对MEPlA基因mRNA序列,设计并体外化学合成两对siRNAs,对应靶序列分别如下 Sil-正义链5’-CCCUAUGAAGGAGAGAGCUCAUAdTdA-3’ (SEQ ID NO :7);sil-反义链5’-UAUAUGAGCUCUCUCCUUCAUAGdGdG-3’ (SEQ ID NO :8);si2-正义链5’-CAGCACAACUUUGACACCUAUGAdTdG-3’ (SEQ ID NO :9);si2-反义链5’ -CAUCAUAGGUGUCAAAGUUGUGCdTdG-3’ (SEQ ID NO :10)。另外,设置无关序列作为阴性对照siRNA 正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’ (SEQ ID NO :11);反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’ (SEQ ID NO :12)。在96孔板中每孔接种3X IO3个Huh_7,H印3B,MHCC-97H和MHCC-97L细胞细胞(无血清培养液)。待细胞密度达到40%左右吋,利用脂质体(LipOfectamine2000)转染试齐U,分别将上述3种siRNA按终浓度50nmol/L转染进Huh_7,H印3B,MHCC_97H和MHCC-97L细胞中,4小时后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24小时为I个检测单位,培养7天,每天检测I次该细胞密度。每孔待测细胞液中加10 μ L CCK-8,37°C孵育I小吋。利用酶标仪在450nm波长下检测吸光度,以代表细胞存活能力,绘制生长曲线。实验结果表明特异性干扰MEPlA表达的siRNA能够抑制肝癌细胞系MHCC-97H的生长,肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞,说明人MEPlA基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。实施例6流式细胞仪检测细胞周期I、细胞消化,最好消化时加入EDTA ;2、细胞消化后不可吹打过度,减少细胞破碎;以后的吹打也要注意,尤其是固定后的细胞容易破碎;3、细胞用PBS洗涤离心,转速不超过1000r/min ;可在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞;4、离心后的固定,标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精;5、4°C固定过夜;6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题;7、PI (作用为DNA染色剂)的浓度为10 μ g/ml, RNAs酶一般浓度为50 μ g/ml,配方中的Triton-X-IOO (曲拉通)主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。8、检测时细胞要达到I 2X106个细胞(实际检测是I万到2万个细胞),为了既保持初始条件相同,又可搜集到足够的细胞。实施例7MEP1A基因过量表达促进肝癌细胞的生长I.构建pcDNA3. IB-MEPlA质粒,PCR扩增相应片段,酶切后连接到空质粒pcDNA3. IB 上,测序。
2.细胞克隆形成分析I)转染采用 LipofectamineTM2000 转染细胞;2) 35mm培养皿培养24小时后消化计数,接种5 10 X IO4细胞至IOOmm培养皿,继续培养24小时后,再加G418至终浓度600-1000mg/ml (根据不同细胞的敏感度而不同)
培养2 3星期直至有克隆形成,期间每隔三天换液;

3)吸去培养皿内的培液,IXPBS洗两次,用结晶紫染色液染色2-4小时;4)按照相同的标准计数每个培养皿上的细胞克隆数。
权利要求
1.ー种MEPlA基因及其表达产物的应用,其特征在于所述MEPlA基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。
2.如权利要求I所述的应用,其特征在于,所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝癌的产品。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增MEPIA基因的引物。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增MEPlA基因的引物。
5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括与MEPlA蛋白特异性结合的抗体。
6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括 与MEPlA基因的核酸序列杂交的探针。
7.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括与MEPIA基因的核酸序列杂交的探针。
8.ー种MEPlA基因及其表达产物的应用,其特征在于所述MEPlA基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制MEPlA基因表达的双链核糖核酸,或用于抑制MEPlA蛋白活性的蛋白质。
10.用于制备用RT-PCR或实时定量PCR诊断肝癌产品的ー对特异扩增MEPlA基因的引物,其特征在干所述引物对的上游引物序列具有如SEQ ID NO: I所示的序列或其互补序列,所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互补序列。
11.用于制备治疗肝癌药物的ー对MEPlA基因的siRNA,其特征在于该siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 7所示序列,该siRNA的反义链具有如SEQ IDNO 8所示的序列。
12.用于制备治疗肝癌药物的ー对MEPlA基因的siRNA,其特征在于该siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 9所示的序列,该siRNA的反义链具有如SEQID NO 10所示的序列。
全文摘要
本发明公开了一种MEP1A基因及其表达产物的应用,用于制备肝癌诊断及治疗的产品。本发明的MEP1A基因及其表达产物,可作为诊断肝癌的特异标志基因,使肝癌诊断更加准确、快速;本发明的MEP1A基因及其表达产物还可作为制备治疗肝癌药物的靶基因,提供新的肝癌治疗途径。
文档编号G01N33/573GK102690869SQ201110070029
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月23日 优先权日2011年3月23日
发明者邓庆, 韩泽广, 高昇 申请人:上海人类基因组研究中心
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1