专利名称：一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通量测定的方法。
背景技术：
纤维素是光合作用的初级产物，也是生物圈中最为丰富的可再生资源。随着生活水平的提高，以纤维素类物质为主的有机废弃物日益增多。合理开发和科学利用这一丰厚天然资源对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义，采用先进的技术手段将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料是世界各国研究开发的重点领域。纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水解作用。利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖的关键就是纤维素酶的生产。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，纤维素的完全降解由内切葡聚酶(Endo-l,4-^-D-gulcanase, EC3. 2. 1.4)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶(Ex0-l，4-i3-D-gulcanase，EC3. 2. 1.91)和 β -葡萄糖苷酶(β_1， 4-β -D-gulcanase，EC3. 2. 1. 21)协同作用而完成的。纤维素酶的活性测定对于纤维素酶的定量分析和筛选具有十分重要的意义。经过对现有文献检索发现，国际理论与应用化学联合会于1987年在Pure and Applied Chemistry (理论与应用化学)59卷，第2期，257-268页发表了由(ihose TK撰写的 "Measurement of cellulase activities”(纤维素酶活的测定方法)。该方法作为纤维素酶活力测定的标准方法，至今仍被广泛使用，但该方法的测定过程较为繁琐，而且难以实现高通量测定。随着自动化技术的发展，机械手也被用于纤维素酶活力的测定过程中， Decker SR 等在 Applied Biochemistry and Biotechnology (应用生化和生物科技)，2003 年，105-108 期，689-703 页发表了 "Automated filter paper assay for determination of cellulase activity"(自动化滤纸片分析法测定纤维素酶活性)。虽然这种自动化方法能够实现快速高通量的测定酶活，但需要较为昂贵的器械设备，难以在实际生产中大范围推广。因此，开发一种操作简便、结果可靠的高通量酶活测定方法对于纤维素酶的科研和生产具有非常重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有方法的不足，提出一种高通量快速测定纤维素酶活力的方法，使其能够用于纤维素酶活的分析和纤维素酶的高通量筛选。本发明通过以下技术方案实现。一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其对滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶活力测定步骤如下1)葡萄糖标准曲线的建立取PCR微孔板，每孔内加缓冲液及不同浓度的葡萄糖标准溶液，然后在每孔中加入DNS溶液，90°C-100°C孵育5min-15min ；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；以此得标准曲线；
2)样品酶活力测定于PCR微孔板中，每孔内加缓冲液、酶液及底物，45°C-55°C于孵育30min-60min，然后在每孔中加入DNS溶液，90°C _100°C孵育5min_15min ；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于96孔平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；3)根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值。所述的DNS溶液，其配制方法为3，5- 二硝基水杨酸2. 65g，氢氧化钠4. 95g，四水酒石酸钾钠102. 70g，重蒸酚1. 9ml，焦亚硫酸钠2. 08g，加水35細1溶解，置棕色瓶中保存，
放置一周后使用。所述的缓冲液为50mmol/l醋酸钠缓冲液，其配制方法为无水醋酸钠2. 05g，定溶至 1000ml，调 pH 至 4. 8。所述的底物分别为滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。本发明所建立的微孔板法高通量测定纤维素酶活力的方法，稳定性、精密度高，重现性好，具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例11)标准曲线的建立取96孔PCR板，每孔内加40 μ 1缓冲液及20 μ 1浓度分别为0mg/ml、2. Omg/ml、 3. 3mg/ml、5. Omg/ml,6. 7mg/ml和1 Omg/ml的葡萄糖溶液，随后每孔加入120 μ 1 DNS溶液， 95°C于基因扩增仪中孵育5min。最后从每孔中转移出40 μ 1置于含160 μ 1水的酶标板中， 用酶标仪于540nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程Y = 0. 208X+0. 0006，标准曲线在0mg/ml-10mg/ml的浓度范围内线性较好，线性相关系数为r = 0. 99975。2)样品中滤纸酶活力的测定于96孔PCR板中，每孔内加40μ 1 ρΗ4. 8的醋酸钠缓冲液、20 μ 1稀释2倍的酶液及4mmX6mm滤纸片。50°C于孵育60min，随后每孔加入120 μ 1 DNS溶液，95°C孵育5min， 上述孵育分别在基因扩增仪和烘箱中进行。而后从每孔中转移出40 μ 1置于含160μ 1蒸馏水的酶标板中，用酶标仪于^Onm处测定吸光度。从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。滤纸酶活按下面公式(1)计算。
FPU/ml= Α·样品 x5.55"mol/mg A540标准品 χ 60 minx X ml公式(1)其中FPU/ml为每毫升酶液中滤纸酶的活力；A54(I样品是样品用微孔板DNS测定法测得的酶活力值;A54tlAig标准品是在葡萄糖标准曲线中，Img的葡萄糖的吸光值; 5. 55ymol/mg为Img溶液中葡萄糖的毫摩尔数，60min为测定中的孵育时间，X为稀释后酶液的体积(20 μ 1)。3)稳定性、精密度和重现性实验样品显色后，分别在不同的时间测定三份样品的吸光度，每隔20min测定3次并记录数据，以表征测定方法的稳定性。在测定过程中，每个浓度平行测定3个复孔，每个样品同时用三块板子进行孵育和测定，计算测定方法的精密度。对同一份样品分别吸取3份等量酶液进行测定，以验证其重现性。为验证微孔板法酶活测定方法的精密度及重复性，将所得酶液进行稀释，在不同时间进行精密度和重复性试验(见表1)。结果表明，孔间和板间酶活力值的变异系数均在 5%以下，也就是说酶活力测定方法的精密度及重复性均较好。
表1微孔板法测定滤纸酶活力的精密度
权利要求
1.一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤如下1)葡萄糖标准曲线的建立取PCR微孔板，每孔内加缓冲液及不同浓度的葡萄糖标准溶液，然后在每孔中加入DNS溶液，90 0C -100 °C孵育5 min-15 min ；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；以此得标准曲线；2)样品酶活力测定于PCR微孔板中，每孔内加缓冲液、酶液及底物，450C-55 °C孵育 30 min-60 min，然后在每孔中加入DNS溶液，90 "C -100 °C孵育5 min-15 min ；而后从每孔中转移出部分孵育溶液置于平底酶标板中，用酶标仪测定吸光度；3)根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值。
2.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1)所述的每孔内加缓冲液的量为40炒1。
3.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1)所述的葡萄糖溶液的浓度依次为0、2. 0 mg/ml、3.3 mg/ml、5.0 mg/ml、6. 7 mg/ml和10 mg/ ml ο
4.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1)所述的DNS溶液的加入量为120炒1。
5.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1)和 2)所述的每孔中转移出溶液量为40 ？？1，置于含160 ？？1水的96孔平底酶标板。
6.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤2)所述的缓冲液为50 mmol/1醋酸钠缓冲液，pH值为4. 8。
7.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤2)所述的底物分别为滤纸片、羧甲基纤维素、微晶纤维素和水杨苷。
8.根据权利要求1所述的基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，其特征是，步骤1)和 2)所述的酶标仪测定波长为540nm。
全文摘要
一种基于微孔板法的纤维素酶活测定方法，涉及生物化学领域，具体是基于微孔板法对纤维素酶的活性进行高通量测定的方法。步骤为1)葡萄糖标准曲线的建立，2)样品酶活力测定，3)根据样品酶的吸光度，从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算酶活值，适用于滤纸酶、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶等的活力测定，具有操作方便、快速、所需设备简单、易于推广等特点。
文档编号G01N21/31GK102230887SQ20111008056
公开日2011年11月2日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者尚若峰, 李兆周, 梁剑平, 王学红, 王曙阳, 郝宝成, 郭志廷, 郭文柱, 陶蕾 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所