专利名称：非对称二甲基精氨酸浓度的测定方法及测定试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种非对称二甲基精氨酸浓度的测定方法及测定试剂。
背景技术：
非对称二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine, ADMA)是一种甲基化精氨酸，是内源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase, N0S)抑制剂，其可竞争性抑制一氧化氮(Nitric oxide,NO)的合成。非对称二甲基精氨酸由细胞内蛋白质在精氨酸甲基转移酶作用下发生甲基化，再经水解反应所生成。许多细胞，如人的内皮细胞均可产生ADMA。正常人体内每天产生约300 μ mol (约60mg)，体内浓度远远高于其他同样可产生NOS抑制作用的内源性精氨酸，故被认为是最重要的NOS抑制剂。ADMA从细胞进入血液循环后，一部分被进一步分解代谢直接通过肾脏由尿液排出，但大部分(达250μπιΟ1)通过广泛分布于肾脏、肝脏和心血管系统的二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)降解。因此通过DDAH降解被认为是 ADMD最为重要的代谢途径。目前国内外多项研究证实在多种疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、心衰和中风等患者的血浆中ADMA水平呈显著性升高。因此，ADMA被公认为是一种新的心血管疾病危险因子。ADMA不仅参与心脏结构重塑，还与心脏功能异常有关，且还是肾功能和糖尿病诊断的重要指示因子。鉴于此，建立适用于临床的非对称二甲基精氨酸的测定方法有重
Jk 眉、ο但目前临床应用中，非对称二甲基精氨酸的测定方法主要包括高压液相色谱法和酶联免疫法等。上述方法的共同特点是需要特别的测定仪器，操作复杂，试验耗时较长，不能应用于临床大流量的自动化分析，且价格昂贵。由于上述缺陷的制约，目前非对称二甲基精氨酸尚未成为临床检测的常规项目。由于非对称二甲基精氨酸在体液和组织样本中的含量很低，通常每升为几微摩尔到数十微摩尔，无法达到临床上常规酶学测定方法所需的测定灵敏限，从而限制了常规酶学方法的采用。虽然近年来酶学检测方法的信号增量技术不断发展，但至今尚未见有关采用酶学方法测定非对称二甲基精氨酸的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的非对称二甲基精氨酸测定方法需特殊仪器、操作复杂、耗时长、不能进行大流量的自动化分析，且价格昂贵的缺陷，而提供一种非对称二甲基精氨酸浓度的测定方法，以及测定试剂。本发明人巧妙的利用酶循环反应，首次建立了非对称二甲基精氨酸的酶学测定方法及测定试剂。该方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本测试，使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。具体的，本发明通过下述技术方案解决上述技术问题
本发明涉及一种非对称二甲基精氨酸的测定方法，其包括如下步骤将待测样本在酶循环反应系统中，进行如式1 3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中非对称二甲基精氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase EC 3.5.3.18， DDAH)、瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC3. 5. 1. 20)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2. 1. 3. 3)和氨基甲酰磷酸或其盐。
二甲基精氨酸二甲胺水解酶非对称二甲基精氨酸+水- L-瓜氨酸+ 二甲胺式1
mem , 瓜氨酸水解酶 ^yl ^ h 4 L-瓜氨酸+水- L-鸟氨酸+ 二氧化碳+氨式权利要求
1.一种非对称二甲基精氨酸浓度的测定方法，其特征在于其包括如下步骤将待测样本在酶循环反应系统中，进行如式1 3所示的反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中非对称二甲基精氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括二甲基精氨酸二甲胺水解酶、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、以及氨基甲酰磷酸或其盐；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的瓜氨酸水解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的鸟氨酸氨甲酰转移酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的氨基甲酰磷酸或其盐的用量为0. 1 50mmol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统为PH6 9的缓冲液体系；所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’42-乙基磺酸)缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为20 300mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统还包括酶稳定剂； 所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶循环反应系统中还包括α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，所述的测定酶循环反应生成的氨的生成速率的方法为谷氨酸脱氢酶反应检测法，所述的谷氨酸脱氢酶反应的反应式如式4所示；
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的谷氨酸脱氢酶的用量为0. 1 50kU/L ；和/或，所述的α -酮戊二酸或其盐的用量为1 50mmol/L，较佳的为1 20mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶的用量为0. 1 lmmol/L，较佳的为0. 2 0. 3mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶为NADH、NADPH^R NADH或硫代NADPH。
7.一种非对称二甲基精氨酸的测定试剂，其特征在于其包括下述成分二甲基精氨酸二甲胺水解酶、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、以及氨基甲酰磷酸或其盐。
8.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂还包含α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶；所述的谷氨酸脱氢酶的用量较佳的为0. 1 50kU/L ；和/或，所述的α -酮戊二酸或其盐的用量较佳的为1 50mmol/L，更佳的为1 20mmol/L ；和/或，所述的还原型辅酶较佳的为0. 1 lmmol/L，更佳的为0. 2 0. 3mmol/L ； 和/或，所述的还原型辅酶较佳的为NADH、NADPHjIHf NADH或硫代NADPH。
9.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂还包含酶稳定剂和/ 或缓冲成分；所述的酶稳定剂较佳的为甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、钾离子、钠离子、牛血清白蛋白、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种；所述的缓冲成分较佳的为能形成PH6 9的缓冲液的成分；所述的缓冲液较佳的为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙基磺酸)缓冲液；所述的缓冲液的浓度较佳的为20 300mmol/L。
10.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂为固体干粉形式，或者还包括水，为水溶液形式；所述的水溶液形式为能直接使用的水溶液形式，或需经稀释才使用的浓缩液形式。
11.如权利要求10所述的测定试剂，其特征在于 所述的测定试剂为能直接使用的水溶液形式时，所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的瓜氨酸水解酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的鸟氨酸氨甲酰转移酶的用量为1 100kU/L ； 和/或，所述的氨基甲酰磷酸或其盐的用量为0. 1 50mmol/L ； 所述的测定试剂为固体干粉形式或需经稀释才使用的浓缩液形式，各所述成分的含量以能溶解和/或稀释为能直接使用的水溶液形式中各成分的含量进行选择。
12.如权利要求7所述的测定试剂，其特征在于所述的测定试剂为所有成分混合的单一试剂形式，或者为包含独立包装各成分的成套试剂盒形式，或者为将各成分分为若干独立包装组分的成套试剂盒形式。
13.如权利要求7 12任一项所述的测定试剂，其特征在于 所述的测定试剂为下述中的任一种(1)所述的测定试剂为单一试剂，其包含二甲基精氨酸二甲胺水解酶、瓜氨酸水解酶、 鸟氨酸氨甲酰转移酶、氨基甲酰磷酸或其盐、α-酮戊二酸或其盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶；(2)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1和2的双组份成套试剂盒，试剂1包含还原型辅酶、α -酮戊二酸或其盐、谷氨酸脱氢酶、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸或其盐，试剂2包含二甲基精氨酸二甲胺水解酶；以及(3)所述的测定试剂为包含独立包装的试剂1、2和3的三组份成套试剂盒，试剂1包含α -酮戊二酸或其盐、还原型辅酶和谷氨酸脱氢酶，试剂2包含瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶和氨基甲酰磷酸或其盐，试剂3包含二甲基精氨酸二甲胺水解酶。
全文摘要
本发明公开了一种非对称二甲基精氨酸浓度的测定方法将待测样本在酶循环反应系统中，进行反应，测定酶循环反应生成的氨的生成速率并计算，即得待测样本中非对称二甲基精氨酸含量；所述的酶循环反应系统包括二甲基精氨酸二甲胺水解酶、瓜氨酸水解酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶、以及氨基甲酰磷酸或其盐。本发明还公开了与该方法相应的测定试剂。本发明首次建立了非对称二甲基精氨酸的酶学测定方法及测定试剂。本发明方法无需特殊仪器、操作简便、灵敏度高且成本低廉，可实现临床快速、大流量的样本检测，使非对称二甲基精氨酸成为临床上常规检测项目成为可能，具有极高的科学和经济价值。
文档编号G01N33/52GK102243227SQ20111008152
公开日2011年11月16日 申请日期2011年3月24日 优先权日2010年12月16日
发明者王学忠 申请人:浙江亚太药业股份有限公司