一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法

文档序号:6008924阅读:510来源:国知局
专利名称:一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法
技术领域
本发明属于生物分析化学领域,涉及一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法。
背景技术
脂质化合物都是小分子化合物,它们都具有相近的物理和化学性质,它们的存在和丰度对于细胞代谢调控、能量控制、信号传导等重要生理活动至关重要。通过研究从单细胞藻类中得到的总脂提取物,可以获得脂代谢物组(Iipidome)的信息(脂代谢谱),包括了细胞内所有脂类物质的组成、相互作用和功能信息,它反映了在特定生理状态下单细胞藻类细胞内脂代谢物的整体变化,能够更详细地了解细胞受外界干扰因素所引起的脂质代谢通路和网络的改变,发现和鉴定脂质生物标志物,能够确定具有关键作用的生物分析,并有助于推测关键代谢途径的调控模式。脂代谢物谱的分析要求高灵敏度、高通量和无偏向性的分析方法。由于脂代谢物和生物体系的复杂性,至今为止,尚无一种能满足上述所有要求的代谢组学分析技术。现有的核磁共振技术(NMR)具备快速和无偏向性的特点,但其灵敏度太低。色谱/质谱联用技术将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,实现对复杂混合物更准确的定性定量分析,也简化了样品的前处理过程。气相色谱/质谱联用(GC-MQ灵敏度较高,但其研究范围仅限于分析挥发性的物质,无法分析热不稳定性和分子量较大的代谢产物。这一缺陷正好可由液相色谱/质谱联用(LC-MQ技术来弥补。因此,LC-MS使得快速发现、灵敏检测和证实新的和不寻常的脂族化合物和脂肪酸(包括生物膜主要组分、脂类信号分子)的效率明显提高。超高效液相色谱(UPLC)耦合四级杆串联飞行时间质谱Oi-TOF),两者的联用适合于复杂体系的分离分析和未知物的结构鉴定。样品分型常用模式识别方法,即基于检测到的代谢物信息来建立多变量统计模型,一方面表征样品之间的关系,另一方面筛选对样品分类有重要贡献的潜在标志物。现有的常用模式识别方法是主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。主成分分析 (PCA)是一种现有的常用无师监督模式识别方法,可以直观地在多维空间上描述样品间的差异。在PCA模型中,两组之间的区别不太明显,模型仅能解释部分原始数据。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)判别能力优于PCA,而正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)是一种该进的偏最小二乘判别分析,其分析效果比常规的PLS-DA更有优势。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足,提供一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法。本发明的技术方案如下发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法,其特征包括下述步骤(1)单细胞藻类细胞内脂质化合物的提取和抗氧化保护;( 超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱(UPLC/Q-T0F-MS)分析脂质化合物;(3)用Markerlynx提取分析数据并导入到Simca-p软件中进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA) ; (4)对OPLS-DA模型进行验证(5)由OPLS-DA模型的结果筛选出潜在脂质生物标志物;(6)对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定。上述的方法中,用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取单细胞藻细胞内脂质化合物,提取液中加入抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)。其中提取液甲醇、三氯甲烷、水的体积比为1 1 0.5,抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)与提取液的质量体积比为0.01% -0. 05% g/mi。样品与提取液混合后,用振荡器震荡5-lOmin后,在4-10°C下离心后取下层溶液,用氮气吹干,再用0. 5-lml色谱甲醇溶解;所述样品为单细胞藻粉。上述的方法中,步骤(1)中单细胞藻中提取的脂质化合物采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪测定。上述的方法中,步骤O)中采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪分析脂质化合物,超高效液相色谱方法中,流动相A为水、异丙醇和甲酸的混合液,其中水、 异丙醇的体积比为95/5 70/30,甲酸的含量始终为流动相A的0.1% (ν/ν);流动相B 为乙腈、异丙醇和甲酸的混合液,其中乙腈、异丙醇的体积比为95/5 70/30,甲酸的含量始终为流动相B的0. (ν/ν);色谱柱温为35°C -40°C,样品室温为4°C -10°C,流速为 0. 3-0. 4ml/min,进样体积为 1-5 μ 1。上述的方法中,质谱分析过程分别采用电喷雾(ESI)离子源正离子和负离子两种模式进行检测。正、负离子模式下的质谱参数如下毛细管电压为^00V-3000V,锥孔电压为40-60V,离子源温度为95-105°C,电喷雾气(脱溶剂气)温度为340_360°C,电喷雾气流量(脱溶剂气流量)为580-6201/h,锥孔气流量为58-621/h,数据采集范围在IOO-IOOOmZo上述的方法中,用Markerlynx提取步骤O)由超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱仪所采集到的数据,并将提取的数据进行归一化处理,再导入到Simca-p软件中进行Pareto标尺化处理,然后经Pareto标尺化后的数据进行正交偏最小二乘判别分析。上述的方法中,对步骤C3)所建立的OPLS-DA模型进行验证。验证方法为随机抽取80%由Markerlynx所提取的数据来建立OPLS-DA模型,由该模型来预测剩下20%数据的分类情况。上述的方法中,由步骤(3)正交偏最小二乘判别分析的结果,即变量重要因子(Variable Importance for the Pro jection,VIP)值和 s 载荷图,筛选出潜在的脂质生物标志物;其中,变量重要因子值(VIP)大于1,同时在s载荷图中纵坐标的绝对值 (|p(COrr) I),即变量投影置信水平,大于0. 6的化合物作为潜在的脂质生物标志物。上述的方法中,对步骤(5)中潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定,其依据是Masslynx软件给出的精确分子量、可能元素组成、一级质谱母离子的保留时间以及二级质谱(MS/MS)特征碎片离子分析。相比现有技术,本发明具有的优势如下1、本发明使用超高效液相色谱(UPLC)耦合四级杆串联飞行时间质谱仪0MOF) 为分析检测手段,两者的联用适合于复杂体系的分离分析和未知物的结构鉴定。UPLC使用小颗粒色谱填料(< 2 μ m)和超高压输液单元(能达到15,OOOpsi),与常规HPLC相比峰容
4量增加2倍,分离速度提高10倍,灵敏度提高3 5倍,反压提高8倍,提高了样品的分析通量,灵敏度、分离度和分析速度,再和质谱联用时有助于目标化合物与竞争性电离杂质的分离,从而减弱离子抑制作用。Q-TOF检测器灵敏度高、分辨率高,能够达到20X10_6的质量准确度,能够区分分子质量很接近的不同脂类分子的质量峰。通过TOF-MS能获取较高的质量准确度的碎片离子信息,同时具有的MS/MS 二级碎片解析功能对于鉴定未知或者尚未鉴定的脂类代谢分子也非常有帮助。2、本发明采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)的模式识别方法,是一种改进的偏最小二乘判别分析(PLS-DA),横坐标体现了样品组间差异(外界干扰因素引起),纵坐标体现了样品组内差异,其判别能力优于常规的PCA和PLS-DA,其分析结果将与分类变量相关的变量和与分类变量正交(无关)的变量分开,仅筛选出与分类变量相关的标志物,从而提高可靠性和准确性。3、本发明所建立的发现和鉴定单细胞藻类脂类生物标志物的通用技术体系,可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。


图1是0. 5% NaCl胁迫培养的雪地衣藻和无NaCl培养的雪地衣藻对照的OPLS-DA 模型,其中图Ia为ESI正离子模式的OPLS-DA模型,图Ib为ESI负离子模式的OPLS-DA模型。三角形为0. 5% NaCl胁迫培养的雪藻,方块为无NaCl培养的对照雪藻,每个点表示一个样品。图2是0. 5% NaCl胁迫培养的雪地衣藻和无NaCl培养的雪地衣藻对照的OPLS-DA 模型验证图,图加为ESI正离子模式的OPLS-DA模型验证图,图2b为ESI负离子模式的 OPLS-DA模型验证图。黑色圆点表示用来塑造OPLS-DA的80%已知样品;+符号表示用 OPLS-DA来预测的20%未知样品,每个点表示一个样品。图3是s载荷图和VIP值的结合图,其中图3a为ESI正离子模式下图,图北为 ESI负离子模式下图。每个点表示一个质谱检测到的离子,空白三角形表示变量载荷投影值的置信水平,黑色三角形表示变量投影的重要因子(VIP)值。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例1发现和鉴定雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)适应NaCl胁迫环境的脂质生物标志物1、雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)培养和收获雪地衣藻在培养6天后,添加已灭菌的NaCl溶液,使终浓度达到0.5% (w/v) 0继续培养Oh、IhJhU^i即取样,每个时刻设置四个平行样。藻液离心(5000r/min,5min),去上清,藻泥用纯净水洗涤三次后置于超低温冰箱中预冻后,冷冻干燥得藻粉。2、细胞脂质化合物的提取藻粉用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取。先在2.5ml的甲醇-三氯甲烷-水 (1/1/0.5, ν/ν/ν)提取溶液中加入0.025 % (w/v, g/ml)抗氧化剂BHT,然后准确称取 10. Omg的藻粉,加入提取液,用振荡器震5min后,在10°C和5500rpm转速下离心IOmin后,取下层溶液,用氮气吹干,再用0. 8ml色谱甲醇溶解后用于UPLC-Q-T0F/MS分析。3、脂代谢谱的UPLC-Q-T0F/MS分析液相分析采用美国Waters公司Acquity超高效液相色谱系统(UPLC);色谱柱采用BEH C18柱(2. ImmX 50mm, 1.7 μ m);流动相A为水/异丙醇70/30 (含0· 甲酸);流动相B为乙腈/异丙醇70/30 (含0. 1 %甲酸);流速为0. 4ml/min ;进样量为1 μ 1 ;柱温 40°C,样品室温度4°C。正离子模式下,流动相洗脱程序为初始A B比例为(50 50), IminA B 比例为(15 85),l_5min A B 比例为(15 85),9min A B 比例为(0 100), 9-14min A B 比例为(0 100),15minA B 比例为(50 50),15_17minA B 比例为 (50 50);负离子模式下,流动相洗脱程序为初始A B比例为(60 40), 2min A B比例为(20 80),2-7min A B 比例为(20 80),9min A B 比例为(0 100),9_14min A B 比例为(0 100),15min A B 比例为(50 50),15_17min A B 比例为(50 50)。质谱分析采用美国Waters公司Micromass Q-TOF串联四极杆-飞行时间质谱仪, 配有电喷雾离子源(ESI)。质谱分析过程分别采用ESI源正离子和负离子两种模式进行检测。正、负离子模式下的质谱参数如下毛细管电压为3000V,锥孔电压为50V,离子源温度为100°C,电喷雾气(脱溶剂气)温度为350°C,电喷雾气流量(脱溶剂气流量)为6001/h, 锥孔气流量为601/h,数据采集范围在lOO-lOOOm/z。4、OPLS-DA 分析用Markerlynx将得到的总离子流图进行峰提取、峰匹配。提取后的数据,进行归一化处理,再将数据导入到Simca-p中进行Pareto标尺化处理,然后再进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。用OPLS-DA方法对0. 5% NaCl胁迫培养的雪地衣藻和无NaCl胁迫的对照雪地衣藻的数据进行建模,结果如图1所示。据此建立的ESI正离子模式的OPLS-DA 模型(图la)可以解释98. 2%的分类信息,并且模型的预测能力达到91. 2%;ESI负离子模式的OPLS-DA模型(图lb)可以解释99. 4%的分类信息,并且模型的预测能力达到86. 2%0 图1中,X轴方向(线性第一主成分)体现了组间差异,即盐浓度对雪藻脂代谢谱的差异性影响;Y轴方向(正交第一主成分)体现了组内差异,即同一盐浓度,不同胁迫时间(lh,7h, 15h)对雪藻脂代谢谱的差异性影响。从图1中可以看出,0. 5% NaCl胁迫的雪地衣藻和无 NaCl胁迫的对照雪地衣藻的脂代谢谱有比较显著的区别,在图中横坐标方向上有明显的分类;对同一盐浓度、不同胁迫时间的样品无明显的分类。5、OPLS-DA 模型验证随机抽取由Markerlynx提取的80 %数据作为训练集建立OPLS-DA模型,剩下 20%数据作为预测集导入到所建立的模型中来评价模型的准确性。由图加和图2b,可以看出,两种模式所建立的模型都能正确预测未知数据的分类,故表明所建的模型未发生过拟合,是稳健的。6、潜在脂质生物标志物的筛选图3a和图北分别表示了正、负离子模式下变量的s载荷图和VIP值的结合图。分别在两个图中筛选出变量重要因子(VIP)值> 1,同时在S载荷图中载荷投影值置信水平 (|p(corr) ) > 0.6的化合物作为雪地衣藻适应0. 5% NaCl的潜在脂质生物标志物,并对潜在标志物进行结构鉴定。7、标志物的结构鉴定
结构鉴定的主要依据是Masslynx软件给出的精确分子量、可能元素组成 (< IOppm)、一级质谱母离子的保留时间以及二级质谱(MS/MS)特征碎片离子片断的分析而得到。表1给出了正离子模式下鉴定的14种脂质生物标志物,表2给出了负离子模式下鉴定的7种脂质生物标志物。它们是甜菜碱-1,2-二酰基甘油-0-4 ‘ -(N,N,N-三甲基)高丝氨酸(DGTS,1, 2-diacylglyceryl-3-0-4‘ - (N, N, N-trimethyl)-homoserine);单半乳糖二酰甘油酯(MGDG,Monogalactosyl-diacylglycerol);双半乳糖二酰甘油酯(DGDG,Digalactosyl-diacylglycerol);磷脂酰乙醇胺(PE,Phosphatidylethanolamine);磺酸基异鼠李糖基二脂酰基甘油(SQDG,sulfoquinovosyldiacylglycerol);磷脂酰甘油(PG,Phosphatidylglycerol);磷脂酰肌醇(PI,Phosphatidylinositiol)。表1正离子模式下鉴定的14种脂质生物标志物
权利要求
1.发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法,其特征包括下述步骤(1)单细胞藻类细胞内脂质化合物的提取和抗氧化保护;(2)用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪分析脂质化合物;(3)用Markerlynx软件提取分析数据并导入到 Simca-p软件中进行正交偏最小二乘判别分析;(4)对正交偏最小二乘判别模型进行验证; (5)由正交偏最小二乘判别模型的结果筛选出潜在脂质生物标志物;(6)对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(1)用甲醇-三氯甲烷-水提取液提取单细胞藻类细胞内脂质化合物,提取液中加入抗氧化剂2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚,提取液中甲醇、三氯甲烷、水的体积比为1:1:0.5,抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚与提取液的质量体积比为0.01%-0.05% g/ml ;样品与提取液混合后,用振荡器震荡5-lOmin后,在 4-10°C下离心后取下层溶液,用氮气吹干,再用0. 5-lml色谱甲醇溶解;所述样品为单细胞藻粉。
3.如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(2)中采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪分析脂质化合物,超高效液相色谱方法中,流动相A为水、异丙醇和甲酸的混合液,其中水、异丙醇的体积比为95/5 70/30,甲酸的含量始终为流动相A的0. 1% (ν/ v);流动相B为乙腈、异丙醇和甲酸的混合液,其中乙腈、异丙醇的体积比为95/5 70/30,甲酸的含量始终为流动相B的0. 1% (ν/ν);色谱柱温为35°C -40°C,样品室温为4°C -10°C, 流速为0. 3-0. 4 ml/min,进样体积为1-5 μ 1。
4.如权利要求3所述方法,其特征在于质谱分析过程分别采用电喷雾离子源正离子和负离子两种模式进行检测;正、负离子模式下的质谱参数如下毛细管电压为 ^00V-3000V,锥孔电压为40-60V,离子源温度为95_105°C,电喷雾气温度为340_360°C,电喷雾气流量为580-6201/h,锥孔气流量为58-621/h,数据采集范围在lOO-lOOOm/z。
5.如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(3)用Markerlynx提取步骤(2)由超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪所采集到的数据,并将提取的数据进行归一化处理,再导入到Simca-p软件中进行Pareto标尺化处理,然后经Pareto标尺化后的数据进行正交偏最小二乘判别分析。
6.如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(4)对正交偏最小二乘判别模型进行验证, 验证方法为随机抽取80%由Markerlynx所提取的数据建立正交偏最小二乘判别模型,由该模型来预测剩下20%数据的分类情况。
7.如权利要求1所述方法,其特征在于由步骤(5)正交偏最小二乘判别分析的结果即变量重要因子值和s载荷图,筛选出潜在的脂质生物标志物;其中,变量重要因子值大于1, 同时在s载荷图中纵坐标的绝对值即变量投影置信水平大于0. 6的化合物作为潜在的脂质生物标志物。
8.如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(6)对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定,其依据是Masslynx软件给出的精确分子量、元素组成、一级质谱母离子的保留时间以及二级质谱特征碎片离子分析。
全文摘要
本发明公开了一种发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的方法,包括下述步骤(1)细胞内脂质化合物的提取和抗氧化保护;(2)超高效液相色谱/四级杆-飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)分析提取脂质化合物;(3)用Markerlynx提取分析数据并导入到Simca-p软件中进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA);(4)对OPLS-DA模型进行验证(5)由OPLS-DA模型的结果筛选出潜在脂质生物标志物;(6)对潜在脂质生物标志物进行结构推断和鉴定。本发明所建立的发现和鉴定单细胞藻类脂质生物标志物的通用技术体系,可辐射应用到植物和微生物代谢组学分析、食品安全代谢组学分析等领域。
文档编号G01N30/72GK102262139SQ20111010859
公开日2011年11月30日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者吕娜, 魏东 申请人:华南理工大学
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