专利名称：鸭模拟小肠液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种动物模拟消化液的制备方法，尤指一种鸭模拟小肠液的制备方法。
背景技术：
我国的鸭饲养量占世界总量的70%以上。在鸭日粮的配制中，饲料原料的能量及氨基酸生物学效价一直是饲料配方首先需要了解的参数。然而，用生物学法测定饲料原料的代谢能及可消化氨基酸数据耗时、耗力、耗资，已成为生产中饲料原料基础数据更新的主要技术瓶颈。长期以来，各国营养学家试图通过模拟饲料在动物体内的消化来建立一种快速定量测定饲料能量、氨基酸生物学效价的技术体系，以实现对饲料养分生物学效价的实时监测。但是这种技术体系始终没有真正在产业上建立起来，一直处于实验阶段。上世纪90年代以来，欧美学者在家禽模拟小肠液的制备上是根据一定时间内饲料的水解率达到最大时所需要的最低猪胰液素(酶)量来确定的(见参考文献=Valdes, Ε. V. , S. Leeson. Measurement of metabolizable energy in poultry feeds by an in vitro system, Poultry Science，1992，71 :1493-1503)。由该方法制备的模拟小肠液，在消化活性上不仅难以完全重复，而且还脱离了动物体内单位体积肠液中消化酶活性的生理水平。此外，这种方法在酶的来源上采用试剂级猪胰液素，从而导致消化酶的酶学特性可能与家禽体内的相应消化酶不同源。近年来，一些学者在动物模拟消化液的制备上又将突破点转移到消化生理学的基础理论上，以家禽小肠液的制备为研究对象，获得了效果良好的模拟家禽小肠液。但是，这种模拟家禽小肠液的制备方法采用的是试剂级的单一消化酶，且消化酶多为猪源性或微生物来源，因此存在着酶学特性不同源的问题，而且实施成本很高，很难为畜牧企业进行饲料养分生物学效价检测的成本核算所接受。因此，开辟新的途径来制备家禽模拟小肠液势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭模拟小肠液的制备方法，该方法实施成本低，生产工艺高效快速，可制备出与真实鸭子体内小肠液α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4 种消化酶基本同源的鸭模拟小肠液。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案—种鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤一将从设定数量的制液用鸭子的鸭小肠中采集来的鸭小肠食糜放入一个试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入一个离心瓶中，在设定温度下通过离心机进行离心处理，在离心处理结束后，收集该离心瓶中的上清液；步骤二 将步骤一得到的上清液过滤后，经冷冻干燥机冷冻浓缩成混合浓缩液；步骤三将步骤二得到的混合浓缩液经透析袋透析去除杂质后，冷冻干燥成冻干粉；步骤四分别测定步骤三得到的冻干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，以及测定试剂级α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性、试剂级脂肪酶中脂肪酶的活性、试剂级胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性、试剂级糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性；步骤五根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向设定重量的冻干粉中加入相应容量的试剂级α -淀粉酶、相应重量的试剂级脂肪酶、相应重量的试剂级胰蛋白酶、相应重量的试剂级糜蛋白酶以及相应容量的水溶液，以制备出鸭模拟小肠液，该制备出的鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与目标鸭小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。本发明的优点是本发明制备出的鸭模拟小肠液中4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性(水解能力)与实际的鸭小肠液一样，可做为一种模拟饲料在鸭小肠内消化的消化液。本发明不是使用单一的试剂级消化酶(试剂级消化酶多为猪源性或微生物来源， 存在酶学特性不同源问题)来制备鸭模拟小肠液，而是主要使用真实鸭子的小肠液中的 4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)配以试剂级消化酶(试剂级 α -淀粉酶、试剂级脂肪酶、试剂级胰蛋白酶、试剂级糜蛋白酶，试剂级消化酶中所含消化酶的活性极小)来制备鸭模拟小肠液，这样使得制备出的鸭模拟小肠液的酶学特性与实际鸭体内小肠液基本同源。本发明采用提纯的鸭小肠液冻干粉为主要原料，大大降低了生产成本。本发明可通过控制4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性来控制鸭模拟小肠液的消化能力，从而使得可对鸭模拟小肠液进行标准化生产。本发明的实施成本低，生产工艺高效、快速，可进行鸭模拟小肠液的大规模生产。
图1是本发明的实现流程图。
具体实施例方式如图1所示，本发明鸭模拟小肠液的制备方法包括如下步骤一至五步骤一将从设定数量的制液用鸭子的鸭小肠中采集来的鸭小肠食糜放入一个试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入一个离心瓶(如选用250毫升离心瓶)中，在设定温度(如4°C)下通过离心机进行离心处理，在离心处理结束后，收集该离心瓶中的上清液；步骤二 将步骤一得到的上清液过滤后，经冷冻干燥机冷冻浓缩成混合浓缩液；步骤三将步骤二得到的混合浓缩液经透析袋透析去除杂质后，冷冻干燥成冻干粉；步骤四分别测定步骤三得到的冻干粉(又可称为肠液粉剂)中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(单位重量的活性)，以及测定本次制备鸭模拟小肠液所使
4用的试剂级α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性(单位毫升的活性)、试剂级脂肪酶中脂肪酶的活性(单位重量的活性)、试剂级胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(单位重量的活性)、试剂级糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性(单位重量的活性)；步骤五根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向设定重量(一般为3 9克即可)的冻干粉中加入相应容量的试剂级α-淀粉酶(视情况可为0，即不添加试剂级α-淀粉酶，分析见下述)、相应重量的试剂级脂肪酶(视情况可为0， 即不添加试剂级脂肪酶，分析见下述)、相应重量的试剂级胰蛋白酶(视情况可为0，即不添加试剂级胰蛋白酶，分析见下述)、相应重量的试剂级糜蛋白酶(视情况可为0，即不添加试剂级糜蛋白酶，分析见下述)以及相应容量的水溶液(可选用去离子水)，以制备出鸭模拟小肠液，且该制备出的鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。本发明中所涉及到的鸭子最好是年龄超过6周龄且体重在2公斤以上的鸭子。例如，步骤一中使用的鸭子优选年龄超过6周龄且体重在2公斤以上的鸭子，如果鸭子太小， 就不好采集鸭小肠食糜。在步骤一中，从鸭小肠中采集鸭小肠食糜可通过如下方法实现对鸭子进行手术， 在鸭的小肠内安装家禽肠道食糜采集套管(参见专利号为ZL2010202574M.3的中国实用新型专利“家禽肠道食糜采集套管”)，待手术恢复十几至几十天(如20天)后，通过家禽肠道食糜采集套管将鸭小肠食糜收集到样品瓶内，样品瓶优选处于4 10°C的低温条件下。 另外，对于步骤一，在实际实施中，可采用Sorvall RC-5C Plus离心机对摇勻后得到的混合物进行1250g离心，离心处理的时间控制在5 10分钟。在步骤二中，上清液可经由200目尼龙滤布进行过滤，冷冻干燥机对过滤后的上清液冷冻浓缩一定时间(一般为几小时至几十小时)，以使其冷冻浓缩1倍以上，变成混合浓缩液。在步骤三中，透析袋的截留分子量在20000道尔顿以下，混合浓缩液依次经由pH 值在7. 0 8. 4之间的磷酸盐缓冲液、去离子水进行透析(在磷酸盐缓冲液、去离子水中分别透析一定时间)，或者，混合浓缩液依次经由PH值在7. 0 8. 4之间的磷酸盐缓冲液、蒸馏水进行透析(在磷酸盐缓冲液、蒸馏水中分别透析一定时间)。混合浓缩液经透析后便会去除其内的杂质，如小分子蛋白等杂质，然后，将透析去除杂质的混合浓缩液冷冻干燥一定时间后，就可得到冻干粉。例如，透析袋的截留分子量可为20000道尔顿，磷酸盐缓冲液的pH值可为7. 0。又例如，透析袋的截留分子量可为14400道尔顿，磷酸盐缓冲液的pH值可为8. 4。又例如，透析袋的截留分子量可为100道尔顿，磷酸盐缓冲液的pH值可为8.0。需要提及的是，透析袋的截留分子量控制在20000道尔顿以下即可达到去除杂质的目的，若透析袋的截留分子量大于20000道尔顿，则在去除杂质的同时会导致消化酶的大量损失，是不可取的。对于步骤五，鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则是指制备出的鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(每毫升溶液中) 应分别与目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性(每毫升溶液中) 相等，这样才能用鸭模拟小肠液来模拟目标鸭的消化情况。上述目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性可以以步骤一中用到的所有制液用鸭子为对象分别进行α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定得出(得出上述4种消化酶的活性平均值)，这样，制备出的鸭模拟小肠液所模拟的目标鸭就是指步骤一中用到的制液用鸭子。另外，上述目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性也可以以大量鸭子为对象分别进行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定得出 (通过大量实验得出上述4种消化酶的活性平均值)，这样，制备出的鸭模拟小肠液所模拟的目标鸭就可指任意一只鸭子了。通过以大量鸭子为对象测定出的目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的平均活性分别为401. 56U/ml (活性单位/毫升)、 1. 10U/ml、108. 75U/ml、39. 01U/ml。不论是对鸭子小肠液、冻干粉进行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定，还是对试剂级α-淀粉酶中α-淀粉酶、试剂级脂肪酶中脂肪酶、试剂级胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶、试剂级糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶进行活性测定，总之，对α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定均为公知技术，其中 α -淀粉酶的活性测定可参考文献“Dahlqvist A. A method for the determination of amylase in intestinal content[J].Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 1962，14 :145-151”中的相关描述；脂肪酶的活性测定可采用德国DiaSys公司的脂肪酶试剂盒测定方法；胰蛋白酶的活性测定可参考文献 "ffirnt R. Trypsin, measurement with η α -p-toluenesulfonyl-l-arginine methyl ester as substrate[A]. In :Bergmeyer H U. Methods of enzymatic analysis[M]. Weinheinm =Verlag chemie. 1974”中的相关描述；糜蛋白酶的活性测定可参考文献 "ffirnt R. Chymotrypsin, measurements with n-benzoyl-l-tyrosin ethyl ester as substrate[A]. In :Bergmeyer H U. Methods of enzymatic analysis[M]. Weinheinm Verlag chemie. 1974” 中的相关描述。在鸭模拟小肠液中，冻干粉提供的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性为主，试剂级α -淀粉酶、试剂级脂肪酶、试剂级胰蛋白酶和试剂级糜蛋白酶分别提供的相应消化酶的活性很小，为辅。并且，对于冻干粉中活性符合要求的消化酶，就不用添加相应的试剂级消化酶。例如，冻干粉中α-淀粉酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性分别与目标鸭小肠液中的α-淀粉酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶的活性相等，只是脂肪酶的活性达不到目标鸭小肠液中脂肪酶的活性的话，只需另外添加适量的试剂级脂肪酶，使配制出的鸭模拟小肠液中脂肪酶的活性等于目标鸭小肠液中脂肪酶的活性即可。也就是说，本发明制备出的鸭模拟小肠液是在真实鸭子的小肠液中的4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、 脂肪酶)的基础上补充适量的相应试剂级消化酶(试剂级α-淀粉酶、试剂级脂肪酶、试剂级胰蛋白酶或试剂级糜蛋白酶中的任一种或任几种，而补充的相应试剂级消化酶中的消化酶活性值很小)来制备鸭模拟小肠液的。实施例一在20只8周龄、平均体重在3. 0公斤以上的制液用鸭子的鸭小肠内安装家禽肠道食糜采集套管，待手术恢复20天后，通过家禽肠道食糜采集套管采集鸭小肠食糜，3升的鸭小肠食糜被收集到处于4°C低温条件下的样品瓶内。将收集到的3升鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入250毫升离心瓶中，在4°C条件下通过离心机进行10分钟的1250g离心处理，离心处理结束后收集离心瓶中的上清液。将得到的上清液经200目尼龙滤布过滤后，再经冷冻干燥机冷冻浓缩12小时，以使上清液冷冻浓缩1. 5倍，变为所需的混合浓缩液。将得到的混合浓缩液转移到截留分子量为14400道尔顿的透析袋中，先在pH7. 0 的磷酸盐缓冲液中透析2小时，然后在去离子水中透析2小时，在进行透析去除小分子蛋白等杂质后，再冷冻干燥48小时，得到冻干粉。根据上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种消化酶的活性测定方法， 测定上述得到的冻干粉中4种主要消化酶的活性为α -淀粉酶，9. 93U/mg(活性单位/毫克)；脂肪酶，0.012U/mg;胰蛋白酶，3.51U/mg;糜蛋白酶，0.63U/mg。测定本次制备鸭模拟小肠液所使用的试剂级α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性为22947.41U/ml，试剂级脂肪酶中含有的脂肪酶的活性为3. 27U/mg，试剂级胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性为 170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性为0. 67U/mg，试剂级糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性为63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性为2. 34U/mg。将本次制备鸭模拟小肠液所用到的20只制液用鸭子作为目标鸭小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定对象，测定这20只制液用鸭子体内小肠液中的4种主要消化酶的活性平均值为α-淀粉酶，460. 92U/ml ；脂肪酶，0. 18U/ml ；胰蛋白酶，133. 44U/ml ；糜蛋白酶，35. 01U/ml。根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向3. 78克冻干粉中加入3. 39毫升的试剂级α-淀粉酶、0. 12克试剂级胰蛋白酶、0. 10克试剂级糜蛋白酶以及相应容量的去离子水，最终得到250毫升鸭模拟小肠液 (在该鸭模拟小肠液中，α -淀粉酶460. 92U/ml，脂肪酶0. 18U/ml，胰蛋白酶133. 44U/ml， 糜蛋白酶35.01U/ml。)，该鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与本次制备鸭模拟小肠液所用到的20只制液用鸭子体内的α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用来模拟这20只制液用鸭子的消化能力。验证在单胃动物仿生消化系统(参见专利申请号为200910078147. 1的中国发明专利申请“单胃动物仿生消化系统及基于该系统模拟单胃动物消化的方法”中的相关描述) 中，分别用100毫升制得的鸭模拟小肠液、本次制备该鸭模拟小肠液所用到的20只制液用鸭子体内的100毫升小肠液对10克玉米进行15小时的消化，消化实验结果为该鸭模拟小肠液与20只制液用鸭子体内的小肠液对玉米的干物质的消化率差异仅为0. 07%，这就证实了制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代这20只制液用鸭子来模拟这20只制液用鸭子的消化能力。实施例二在30只12周龄、平均体重在3. 2公斤以上的制液用鸭子的鸭小肠内安装家禽肠道食糜采集套管，待手术恢复25天后，通过家禽肠道食糜采集套管采集鸭小肠食糜，5升的鸭小肠食糜被收集到处于8°C低温条件下的样品瓶内。将收集到的5升鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入250 毫升离心瓶中，在4°C条件下通过离心机进行8分钟的1250g离心处理，离心处理结束后收集离心瓶中的上清液。将得到的上清液经200目尼龙滤布过滤后，再经冷冻干燥机冷冻浓缩36小时，以使上清液冷冻浓缩10倍，变为所需的混合浓缩液。将得到的混合浓缩液转移到截留分子量为1M00道尔顿的透析袋中，先在pH7. 5 的磷酸盐缓冲液中透析2小时，然后在去离子水中透析2小时，在进行透析去除小分子蛋白等杂质后，再冷冻干燥48小时，得到冻干粉。根据上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种消化酶的活性测定方法，测定上述得到的冻干粉中4种主要消化酶的活性为α -淀粉酶，10. 25U/mg ；脂肪酶，0. 015U/ mg ；胰蛋白酶，4. 12U/mg ；糜蛋白酶，0. 84U/mg。测定本次制备鸭模拟小肠液所使用的试剂级α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性为22947. 41U/ml，试剂级脂肪酶中含有的脂肪酶的活性为3. 27U/mg，试剂级胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性为170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性为0. 67U/mg，试剂级糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性为63.31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性为2. 34U/mg。将本次制备鸭模拟小肠液所用到的30只制液用鸭子作为目标鸭小肠液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定对象，测定这30只制液用鸭子体内小肠液中的4种主要消化酶的活性平均值为α -淀粉酶，420. 53U/ml ；脂肪酶，0. 20U/ml ；胰蛋白酶，130. 24U/ml ；糜蛋白酶，41. 50U/ml。根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向3. 33克冻干粉中加入3. 09毫升的试剂级α-淀粉酶、0. 11克试剂级胰蛋白酶、0. 12克试剂级糜蛋白酶以及相应容量的去离子水，最终得到250毫升鸭模拟小肠液 (在该鸭模拟小肠液中，α -淀粉酶420. 53U/ml，脂肪酶0. 20U/ml，胰蛋白酶130. 24U/ml, 糜蛋白酶41.50U/ml。)，该鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与本次制备鸭模拟小肠液所用到的30只制液用鸭子体内的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用来模拟这30只制液用鸭子的消化能力。验证在单胃动物仿生消化系统中，分别用100毫升制得的鸭模拟小肠液、本次制备该鸭模拟小肠液所用到的30只制液用鸭子体内的100毫升小肠液对5克豆粕进行15小时的消化，消化实验结果为该鸭模拟小肠液与30只制液用鸭子体内的小肠液对豆粕的干物质的消化率差异仅为1. 02%，这就证实了制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代这30只制液用鸭子来模拟这30只制液用鸭子的消化能力。实施例三在60只18周龄、平均体重在3. 2公斤以上的制液用鸭子的鸭小肠内安装家禽肠道食糜采集套管，待手术恢复30天后，通过家禽肠道食糜采集套管采集鸭小肠食糜，5升的鸭小肠食糜被收集到处于5°C低温条件下的样品瓶内。将收集到的5升鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入250 毫升离心瓶中，在4°C条件下通过离心机进行5分钟的1250g离心处理，离心处理结束后收集离心瓶中的上清液。将得到的上清液经200目尼龙滤布过滤后，再经冷冻干燥机冷冻浓缩48小时，以使上清液冷冻浓缩20倍，变为所需的混合浓缩液。将得到的混合浓缩液转移到截留分子量为14400道尔顿的透析袋中，先在pH7. 8 的磷酸盐缓冲液中透析2小时，然后在蒸馏水中透析2小时，在进行透析去除小分子蛋白等杂质后，再冷冻干燥48小时，得到冻干粉。根据上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种消化酶的活性测定方法，测定上述得到的冻干粉中4种主要消化酶的活性为α -淀粉酶，12. 04U/mg ；脂肪酶，0. 015U/ mg ；胰蛋白酶，3. 85U/mg ；糜蛋白酶，0. 78U/mg。测定本次制备鸭模拟小肠液所使用的试剂级α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性为22947. 41U/ml，试剂级脂肪酶中含有的脂肪酶的活性为3. 27U/mg，试剂级胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性为170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性为0. 67U/mg，试剂级糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性为63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性为2. 34U/mg。将本次制备鸭模拟小肠液所用到的60只制液用鸭子作为目标鸭小肠液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定对象，测定这60只制液用鸭子体内小肠液中的4种主要消化酶的活性平均值为α-淀粉酶，410. 25U/ml ；脂肪酶，0. 19U/ml ；胰蛋白酶，125. 50U/ml ；糜蛋白酶，36. 47U/ml。根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向3. 15克冻干粉中加入2. 88毫升的试剂级α-淀粉酶、0. 13克试剂级胰蛋白酶、0. 08克试剂级脂肪酶以及相应容量的去离子水，最终得到250毫升鸭模拟小肠液(在该鸭模拟小肠液中，α -淀粉酶410. 25U/ml，脂肪酶0. 19U/ml，胰蛋白酶125. 50U/ml，糜蛋白酶36. 47U/ml。)，该鸭模拟小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与本次制备鸭模拟小肠液所用到的60只制液用鸭子体内的α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、 糜蛋白酶的活性平均值相等，可用来模拟这60只制液用鸭子的消化能力。验证在单胃动物仿生消化系统中，分别用100毫升制得的鸭模拟小肠液、本次制备该鸭模拟小肠液所用到的60只制液用鸭子体内的100毫升小肠液对10克玉米-豆粕日粮进行15小时的消化，消化实验结果为该鸭模拟小肠液与60只制液用鸭子体内的小肠液对玉米-豆粕日粮的干物质消化率差异仅为1. 07%，这就证实了制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代这60只制液用鸭子来模拟这60只制液用鸭子的消化能力。实施例四在25只15周龄、平均体重在3. 0公斤以上的制液用鸭子的鸭小肠内安装家禽肠道食糜采集套管，待手术恢复30天后，通过家禽肠道食糜采集套管采集鸭小肠食糜，4升的鸭小肠食糜被收集到处于4°C低温条件下的样品瓶内。将收集到的4升鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入250 毫升离心瓶中，在4°C条件下通过离心机进行8分钟的1250g离心处理，离心处理结束后收集离心瓶中的上清液。将得到的上清液经200目尼龙滤布过滤后，再经冷冻干燥机冷冻浓缩30小时，以使上清液冷冻浓缩9倍，变为所需的混合浓缩液。将得到的混合浓缩液转移到截留分子量为14400道尔顿的透析袋中，先在pH7. 9 的磷酸盐缓冲液中透析2小时，然后在去离子水中透析2小时，在进行透析去除小分子蛋白等杂质后，再冷冻干燥48小时，得到冻干粉。根据上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种消化酶的活性测定方法，测定上述得到的冻干粉中4种主要消化酶的活性为α -淀粉酶，11. 02U/mg ；脂肪酶，0. 016U/ mg ；胰蛋白酶，4. 23U/mg ；糜蛋白酶，0. 90U/mg。测定本次制备鸭模拟小肠液所使用的试剂级α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性为22947. 41U/ml，试剂级脂肪酶中含有的脂肪酶的活性为3. 27U/mg，试剂级胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性为170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性为0. 67U/mg，试剂级糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性为63. 31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性为2. 34U/mg。将本次制备鸭模拟小肠液所用到的25只制液用鸭子作为目标鸭小肠液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定对象，测定这25只制液用鸭子体内小肠液中的4种主要消化酶的活性平均值为α -淀粉酶，440. 50U/ml ；脂肪酶，0. 205U/ml ；胰蛋白酶，130. 29U/ml ；糜蛋白酶，35. 08U/ml。根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向3. 20克冻干粉中加入3. 26毫升的试剂级α -淀粉酶、0. 11克试剂级胰蛋白酶、0. 09克试剂级糜蛋白酶以及相应容量的去离子水，最终得到250毫升鸭模拟小肠液(在该鸭模拟小肠液中，α -淀粉酶440. 50U/ml，脂肪酶0. 205U/ml，胰蛋白酶130. 29U/ ml，糜蛋白酶35.08U/ml。)，该鸭模拟小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与本次制备鸭模拟小肠液所用到的25只制液用鸭子体内的α -淀粉酶、脂肪酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用来模拟这25只制液用鸭子的消化能力。验证在单胃动物仿生消化系统中，分别用100毫升制得的鸭模拟小肠液、本次制备该鸭模拟小肠液所用到的25只制液用鸭子体内的100毫升小肠液对5克棉粕进行15小时的消化，消化实验结果为该鸭模拟小肠液与25只制液用鸭子体内的小肠液对棉粕的干物质的消化率差异仅为0. 53%，这就证实了制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代这25只制液用鸭子来模拟这25只制液用鸭子的消化能力。实施例五在40只10周龄、平均体重在3. 0公斤以上的制液用鸭子的鸭小肠内安装家禽肠道食糜采集套管，待手术恢复40天后，通过家禽肠道食糜采集套管采集鸭小肠食糜，8升的鸭小肠食糜被收集到处于10°C低温条件下的样品瓶内。将收集到的8升鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入250 毫升离心瓶中，在4°C条件下通过离心机进行10分钟的1250g离心处理，离心处理结束后收集离心瓶中的上清液。将得到的上清液经200目尼龙滤布过滤后，再经冷冻干燥机冷冻浓缩M小时，以使上清液冷冻浓缩4倍，变为所需的混合浓缩液。将得到的混合浓缩液转移到截留分子量为1M00道尔顿的透析袋中，先在pH8. 0 的磷酸盐缓冲液中透析2小时，然后在蒸馏水中透析2小时，在进行透析去除小分子蛋白等杂质后，再冷冻干燥48小时，得到冻干粉。根据上述α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种消化酶的活性测定方法，测定上述得到的冻干粉中4种主要消化酶的活性为α -淀粉酶，15. 18U/mg ；脂肪酶，0. 012U/ mg ；胰蛋白酶，5. 14U/mg ；糜蛋白酶，0. 75U/mg。测定本次制备鸭模拟小肠液所使用的试剂级α-淀粉酶中含有的α-淀粉酶的活性为22947. 41U/ml，试剂级脂肪酶中含有的脂肪酶的活性为3. 27U/mg，试剂级胰蛋白酶中含有的胰蛋白酶的活性为170. 87U/mg，且含有的糜蛋白酶的活性为0. 67U/mg，试剂级糜蛋白酶中含有的糜蛋白酶的活性为63.31U/mg，且含有的胰蛋白酶的活性为2. 34U/mg。将本次制备鸭模拟小肠液所用到的40只制液用鸭子作为目标鸭小肠液中α _淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定对象，测定这40只制液用鸭子体内小肠液中的4种主要消化酶的活性平均值为α -淀粉酶，455. 20U/ml ；脂肪酶，0. 204U/ml ；胰蛋白酶，148. 40U/ml ；糜蛋白酶，42. 52U/ml。根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向4. 25克冻干粉中加入2. 15毫升的试剂级α-淀粉酶、0. 09克试剂级胰蛋白酶、0. 12克试剂级糜蛋白酶以及相应容量的去离子水，最终得到250毫升鸭模拟小肠液 (在该鸭模拟小肠液中，α -淀粉酶，455. 20U/ml ；脂肪酶，0. 204U/ml ；胰蛋白酶，148. 40U/ ml ；糜蛋白酶，42. 52U/ml。)，该鸭模拟小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与本次制备鸭模拟小肠液所用到的40只制液用鸭子体内的α -淀粉酶、脂肪酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性平均值相等，可用来模拟这40只制液用鸭子的消化能力。验证在单胃动物仿生消化系统中，分别用100毫升制得的鸭模拟小肠液、本次制备该鸭模拟小肠液所用到的40只制液用鸭子体内的100毫升小肠液对10克玉米-豆粕日粮进行15小时的消化，消化实验结果为该鸭模拟小肠液与40只制液用鸭子体内的小肠液对玉米-豆粕日粮的干物质消化率差异仅为0. 85%，这就证实了制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代这40只制液用鸭子来模拟这40只制液用鸭子的消化能力。目前，在家禽小肠中，可通过有效方法检测并了解其酶学基本特性的消化酶约19 种，其中的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶所占比例就约占全部酶蛋白含量的60% (参见文献"Pubols, M. H. Ratio of enzymes in the chick pancreas [J], Poultry Science, 1991,70 :337-342”中的描述)。而且，从分泌量和水解能力来看，鸭小肠液中α -淀粉酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的每小时分泌量分别为7235. 74UU780. 43U、811. 43U、20. 30U， 可水解140g淀粉、19.9g蛋白质、0.3g脂肪。而日粮中淀粉、蛋白质和脂肪三者含量的总和占到有机物总量的80%以上。根据以上数据可以看到，鸭小肠内的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶这四种消化酶的分泌及水解活性完全可以水解饲料中绝大多数的有机物，因此，制备的鸭模拟小肠液中只要有α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶这四种消化酶，并且令鸭模拟小肠液中的α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶这四种消化酶的活性分别与实际的鸭小肠液(指设定数量的制液用鸭子或任意鸭子)中的α-淀粉酶、 胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶的活性一样，就可以用鸭模拟小肠液来模拟鸭子(指设定数量的制液用鸭子或任意鸭子)对各种日粮的消化能力。而且，从上述各个实施例可以看到，本发明制备出的鸭模拟小肠液对各种日粮的消化率非常接近实际的鸭小肠液，消化率差异极小，也就是说，本发明制备出的鸭模拟小肠液完全可以替代实际的鸭小肠液来对各种日粮的消化能力进行实验。在本发明中，离心机、冷冻干燥机、透析袋等均为公知设备，且涉及到的离心、冷冻干燥、透析等处理以及固液转换的计算方法均为公知技术。本发明的优点是本发明制备出的鸭模拟小肠液中4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性(水解能力)与实际的鸭小肠液一样，可做为一种模拟饲料在鸭小肠内消化的消化液。本发明不是使用单一的试剂级消化酶(试剂级消化酶多为猪源性或微生物来源， 存在酶学特性不同源问题)来制备鸭模拟小肠液，而是主要使用真实鸭子的小肠液中的 4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)配以试剂级消化酶(试剂级 α -淀粉酶、试剂级脂肪酶、试剂级胰蛋白酶、试剂级糜蛋白酶，试剂级消化酶中所含消化酶的活性极小)来制备鸭模拟小肠液，这样使得制备出的鸭模拟小肠液的酶学特性与实际鸭体内小肠液基本同源。
本发明采用提纯的鸭小肠液冻干粉为主要原料，大大降低了生产成本。本发明可通过控制4种主要消化酶(α-淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)的活性来控制鸭模拟小肠液的消化能力，从而使得可对鸭模拟小肠液进行标准化生产。本发明的实施成本低，生产工艺高效、快速，可进行鸭模拟小肠液的大规模生产。上述是本发明的较佳实施例及其所运用的技术原理，对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案基础上的等效变换、 简单替换等显而易见的改变，均属于本发明保护范围之内。
权利要求
1.一种鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤一将从设定数量的制液用鸭子的鸭小肠中采集来的鸭小肠食糜放入一个试剂瓶中摇勻，将摇勻后得到的混合物放入一个离心瓶中，在设定温度下通过离心机进行离心处理，在离心处理结束后，收集该离心瓶中的上清液；步骤二 将步骤一得到的上清液过滤后，经冷冻干燥机冷冻浓缩成混合浓缩液；步骤三将步骤二得到的混合浓缩液经透析袋透析去除杂质后，冷冻干燥成冻干粉；步骤四分别测定步骤三得到的冻干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，以及测定试剂级α-淀粉酶中α-淀粉酶的活性、试剂级脂肪酶中脂肪酶的活性、试剂级胰蛋白酶中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性、试剂级糜蛋白酶中糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性；步骤五根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向设定重量的冻干粉中加入相应容量的试剂级α -淀粉酶、相应重量的试剂级脂肪酶、相应重量的试剂级胰蛋白酶、相应重量的试剂级糜蛋白酶以及相应容量的水溶液，以制备出鸭模拟小肠液，该制备出的鸭模拟小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性分别与目标鸭小肠液中α -淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性相等。
2.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于在所述步骤二中，所述上清液经由200目尼龙滤布进行过滤。
3.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于在所述步骤三中，所述透析袋的截留分子量在20000道尔顿以下，所述混合浓缩液依次经由PH值在7. 0 8. 4之间的磷酸盐缓冲液、去离子水进行透析。
4.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于在所述步骤三中，所述透析袋的截留分子量在20000道尔顿以下，所述混合浓缩液依次经由PH值在7. 0 8. 4之间的磷酸盐缓冲液、蒸馏水进行透析。
5.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于在所述步骤五中，所述目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性是以所述步骤一中用到的所有制液用鸭子为对象分别进行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定得出的平均值。
6.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于在所述步骤五中，所述目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性是以大量鸭子为对象分别进行α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性测定得出的平均值，所述目标鸭小肠液中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的平均活性分别为 401. 56U/ml、l. 10U/ml、108. 75U/ml、39. 01U/ml。
7.如权利要求1所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于所述步骤五中的所述水溶液为去离子水。
8.如权利要求1或5或6所述的鸭模拟小肠液的制备方法，其特征在于所述鸭子的年龄超过6周龄且体重在2公斤以上。
全文摘要
本发明公开了一种鸭模拟小肠液的制备方法，包括将采集的鸭小肠食糜放入试剂瓶中摇匀，放入离心瓶中进行离心处理，收集上清液；将上清液过滤，冷冻浓缩成混合浓缩液；将混合浓缩液透析去除杂质后冷冻干燥成冻干粉；测定冻干粉中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性，测定试剂级α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中相应消化酶的活性；根据鸭模拟小肠液与目标鸭小肠液中各消化酶总活性相等的原则，向设定重量冻干粉中加入相应容量试剂级α-淀粉酶、相应重量试剂级脂肪酶、相应重量试剂级胰蛋白酶、相应重量试剂级糜蛋白酶及相应容量水溶液。本发明方法实施成本低，可制备出与真实鸭子体内4种消化酶基本同源的鸭模拟小肠液。
文档编号G01N33/02GK102313794SQ20111014004
公开日2012年1月11日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者侯水生, 张子仪, 张宏福, 赵峰 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所