专利名称：奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法
技术领域：
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体为奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法。
背景技术：
近年来，乳制品食品安全事件引起社会广泛关注，由于乳制品引发的食源性疾病明显增多，使得乳制品的质量安全问题受到广泛重视。食品科技的发展在丰富人类食品消费的同时，也给乳制品生产带来了安全问题。为了加强乳制品质量监管，《食品安全法》、《乳品质量安全监督管理条例》、《2010版企业生产乳制品许可条件审查细则》、《2010版企业生产婴幼儿配方奶粉许可条件审查细则》等法规相继出台，乳制品行业迫切需要更多的整体解决方案以满足日益增加的检测需求。众多的检测需求以及法规需求，同时也给乳制品分析实验室带来了如何提高实验室效率和降低分析成本的难题。针对氨基酸检测，现有的氨基酸测定方法，多数使用茚三酮染色或衍生，采用分光光度计或氨基酸分析仪进行氨基酸的分析，也有部分采用高效液相色谱仪，但也需要使用特殊的离子交换色谱柱。现行国家标准GB/T 5009. 1M-2003《食品中氨基酸的测定》用于测定食品中16种氨基酸(不包括色氨酸和(半)胱氨酸)，GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》能够测定全部18种水解氨基酸，但二者均采用全自动氨基酸分析仪； IS013903 2005 (E)《动物饲料-氨基酸含量的测定》使用氨基酸分析仪或高效液相色谱仪测定动物饲料中的17种氨基酸(不包括色氨酸，不能区分胱氨酸和半胱氨酸)；AOAC官方方法994. 12《饲料中氨基酸-过甲酸氧化与偏亚硫酸氢钠-酸水解法》适用于用氨基酸分析仪测定16种氨基酸(包括蛋氨酸和胱氨酸，不包括酪氨酸和色氨酸)。采用高效液相色谱仪检测氨基酸时，由于大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测的灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行柱前或柱后衍生，柱前衍生通常采用邻苯二甲醛(ΟΡΑ)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、丹酰氯 (DANSYL-C1)、2，4 -二硝基氟苯(DNFB)、氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC) 等，柱后衍生应用最广泛的是茚三酮，然而上述衍生试剂各有优劣。目前备受关注的衍生剂 4-氯-3，5- 二硝基三氟甲基苯(CNBF)，石天玉等(2009)使用CNBF衍生剂和柱前衍生法对 19种游离氨基酸(包括除谷氨酰胺(Gln)和精氨酸(Arg)的18种标准氨基酸)进行了测定， 是采用柱前衍生测定氨基酸含量的一种新的尝试。采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测法可不经过衍生对氨基酸进行测定。ELSD检测器是一种万能型检测器，不衍生即能够检测氨基酸和碳水化合物等物质， 检测的范围宽，使用较为方便。但该检测器对样品前处理要求比较严格，适用于成分比较单一或比较干净的样品的检测，成分复杂的样品则会对结果造成较大的干扰；在洗脱液雾化过程中需消耗大量的氮气，增加了测定成本；不能使用盐溶液作为流动相，会对检测造成干扰。因此，现有的氨基酸检测方法多数需采用分光光度计或者氨基酸自动分析仪，少数使用高效液相色谱仪也需特殊的离子交换色谱柱或者ELSD检测器或者氨基酸测定试剂包，不具有普遍实用性，成本也比较高，目前基于高效液相色谱仪的氨基酸测定方法并不能快速准确对蛋白水解后的18种标准氨基酸进行定性和定量分析。
发明内容
本发明为解决现有的氨基酸测定方法存在成本高、普适性差以及基于高效液相色谱仪的氨基酸测定方法不能满足快速准确地对18种蛋白水解标准氨基酸进行定性和定量分析的问题，提供奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤
(1)制备奶粉水解样品
采用三种不同的前处理方法即常规水解法、氧化水解法、碱水解法分别对奶粉进行水解，分别制得三种奶粉水解样品；
(通过不同的前处理分离和测定18种蛋白水解氨基酸，其中常规(酸)水解法适用于分离和测定除含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)和色氨酸以外的水解氨基酸，包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸15种氨基酸；氧化(酸)水解法适用于分离和测定蛋氨酸和半胱氨酸两种含硫氨基酸；碱水解法适用于分离和测定色氨酸。对于本领域普通技术人员而言，上述三种不同的水解方法是容易实现的。)
(2)三种奶粉水解样品的衍生
衍生剂为4-氯-3，5-二硝基三氟甲基苯(CNBF)，其浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，衍生时间为40min，衍生温度为65°C，同时以上述衍生条件对18种混合氨基酸标准溶液进行衍生；
(所述的衍生剂4-氯-3，5- 二硝基三氟甲基苯即CNBF，能与一级或二级氨基酸反应生成既具有强的紫外吸收、又具有荧光吸收的稳定产物。该衍生剂反应条件温和，与氨基酸反应生成稳定的N-代-2，6- 二硝基-4-三氟甲基-苯胺，衍生产物在室温下稳定保存3天以上，在MOnm能够将18种氨基酸的波峰充分分离，而有利于进行准确有效的检测。CNBF的浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，理论上讲有多种可能，然而还要考虑到费用问题，尽可能做到经济高效。过量的CNBF衍生剂与水反应生成不干扰测定的稳定的副产物4-氨-3，5- 二硝基氟苯和3，5- 二硝基对三氟苯酚。该衍生剂的特点和优势有利于准确有效的氨基酸测定，作为一种精细化工原料，价格便宜，容易购得，有利于方法的推广应用。)
(3)色谱分离检测条件
检测仪器Waters Alliance 2690Λ695高效液相色谱系统，120孔自动进样装置， Waters M87紫外检测器，Waters 二极管阵列检测器(PDA)(用于对CNBF氨基酸衍生物的吸收波长的紫外扫描和氨基酸的定性)；
色谱柱通用的C18 (250 mm X 4. 6 mm, 5 μ m)液相色谱柱； 流动相流动相A为乙腈，流动相B为50mmol/L乙酸钠缓冲液与0. 24%的三乙胺，流速为 0. 32ml/min, pH 为 5. 8 ；检测波长设定吸收波长为240nm ； (4)测定
对衍生后的18种混合氨基酸标准溶液进行紫外光谱扫描和色谱检测，得到18种标准氨基酸CNBF衍生物光谱扫描图和色谱图；对衍生后的三种不同前处理的奶粉水解样品进行高效液相色谱分析，得到奶粉中18种氨基酸HPLC测定曲线图谱。本方法通过三种不同的水解方法对奶粉进行前处理，采用HPLC和通用的C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m)液相色谱柱，能够对奶粉中蛋白水解的全部18种氨基酸进行分离和测定，该方法普适性更强，而且不需要贵重的氨基酸分析仪和/或贵重的氨基酸测定试剂包，适用于更多的常规实验室。
图1为18种标准氨基酸CNBF衍生物的光谱扫描图2为浓度为2 mmol/ L的18种蛋白水解氨基酸CNBF衍生物色谱图； 图3为采用常规酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A;
图4为采用常规酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱B;
图5为采用氧化酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A;
图6为采用氧化酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱B;
图7为采用碱水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱A ； 图8为采用碱水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱B。图1中横坐标为吸收波长，单位为nm，纵坐标为峰高，单位为AU ；图2_8中横坐标为保留时间，单位为min，纵坐标为峰高，单位为AU。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步地说明。奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤 (1)制备奶粉水解样品
采用三种不同的前处理方法即常规水解法、氧化水解法、碱水解法分别对奶粉进行水解，分别制得奶粉水解样品；奶粉选用婴幼儿成长奶粉，具体实施时可采用下述方案
①常规水解法称取0.0500g (准确至0. OOOlg)奶粉转移至安培瓶或水解管中，加入 6mol/L盐酸10ml，滴加2_3滴溶解后的新鲜苯酚，充入高纯氮气15min，在充氮气状态下对安培瓶封口或迅速拧紧水解管螺帽，将安培瓶或水解管置于110 士 1 °C的恒温干燥箱水解 20士 Ih ；取出安培瓶或水解管，冷却，混勻，开管，将水解液用pH7. 0磷酸盐缓冲溶液转移至 50. Oml的容量瓶，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用；
②氧化水解法称取0.0500g (准确至0. OOOlg)奶粉转移至安培瓶或水解管中，于冰浴中冷却30min，加入预冷的过甲酸溶液2. 0ml，加液时将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一起置于4°C冰箱中，反应16h ；加入氢溴酸0. :3ml，振摇，放回冰浴，于通风柜中静置30min，用氮吹仪或旋转蒸发在不高于60°C的温度下浓缩至干(旋转蒸发时压力低于3. 3X103 1 );取6. Omol/L盐酸IOml将残渣定量转移至安培瓶或水解管中，封口，置 110士 1°C的恒温干燥箱水解20士 Ih ；取出安培瓶或水解管，冷却，用去离子水将水解液定量转移至50. 0 ml容量瓶中，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用；
③碱水解法称取0. 0500g (准确至0. OOOlg)奶粉，转移至聚四氟乙烯衬管中，加10 ml碱解剂，于液氮或干冰乙醇中冷冻，将聚四氟乙烯衬管插入安培瓶或水解管，充入高纯氮气15 min，在充氮气状态下对安培瓶封口或迅速拧紧水解管螺帽，将安培瓶或水解管置于 110士 1°C恒温干燥箱水解20士 Ih ；取出安培瓶或水解管，冷至室温，开管，用pH 7.0磷酸盐缓冲溶液将水解液转移到50. 0 ml容量瓶中，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用；
上述三种水解方法是针对HPLC方法的前处理方法，对原有的方法进行了部分的改进， 其优势在于能够以较少的样品量得到准确的检测结果，节约了操作费用和时间；
(2)三种奶粉水解样品的衍生
衍生剂为4-氯-3，5- 二硝基三氟甲基苯(CNBF)，其浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，衍生时间为40min，衍生温度为65°C，同时以上述衍生条件对18种混合氨基酸标准溶液进行衍生；具体实施时可采用下述方案
在10 ml磨口塞试管中加入1. 0 ml奶粉水解样品，加入5. 0 ml pH 9. 0硼酸缓冲溶液，用旋涡振荡器振荡30 s混勻，加入2.0 ml CNBF溶液(CNBF的浓度为50-100 mmol/L, 根据每种奶粉水解样品中氨基酸的浓度确定，保证CNBF的总浓度大于每种奶粉水解样品中氨基酸总浓度的三倍以上)，旋涡振荡器充分振荡混勻后，封口膜密封后，放入65°C水浴中衍生40 min，衍生后放置至室温，转移至25ml刻度试管中，加入pH7. 0磷酸盐缓冲溶液至 25mL，用旋涡振荡器振荡30 s混勻，静至lOmin，取适量溶液用0. 22Mm滤膜过滤；该具体衍生方案针对HPLC方法作了部分改进，能够得到最佳的衍生效果；
(3)色谱分离检测条件
检测仪器Waters Alliance 2690Λ695高效液相色谱系统，120孔自动进样装置， Waters 2487紫外检测器，Waters 二极管阵列检测器(PDA)；
色谱柱通用的C18(250 mm X 4. 6 mm,5 μ m)液相色谱柱，可选用日本Siiseido ODS C18 色谱柱(250 X 4. 6mm ID，5Mm)，瑞典 Kromasil ODS C18 色谱柱(250X4. 6mm ID，5Mm);
流动相流动相A为乙腈，流动相B为50mmol/L乙酸钠缓冲液与0. 24%的三乙胺，流速为 0. 32ml/min, pH 为 5. 8 ；
检测波长设定吸收波长为240nm ；
(4)测定
对衍生后的18种混合氨基酸标准溶液进行紫外光谱扫描和色谱检测，得到18种标准氨基酸CNBF衍生物光谱扫描图(如图1所示)和色谱图(如图2所示);对衍生后的三种不同前处理的奶粉水解样品进行高效液相色谱分析，得到婴幼儿成长奶粉中18种氨基酸HPLC 测定曲线图谱(如图3-8所示)。 图1所示的18种标准氨基酸CNBF衍生物光谱扫描图谱，最大吸收光谱分别为 (1) CysA, 239. Onm ； (2) Asp, 240. 3nm ； (3) Glu, 240. 3 nm ； (4) His, 240. 3nm ;(5)Arg，239. 7nm ； (6) Ser, 239. 7nm ； (7) Thr, 240. 3nm ； (8) Pro, 215. 9nm_270. 3nm ； (9) Met (0) 2， 239. 0 ； (10) Gly,237. 8nm ； (11) Ala, 239. 7nm ； (12) Val,240. 3nm ； (13) Trp,219. 5nm ；Leu, 240. 3nm ;(15) lie, 240. 3nm ;(16) Phe，241. 5nm ； (17) Tyr,221. 9nm ;(18) Lys, 237. Snm0主要用于对每种氨基酸的定性，即确定样品中的氨基酸与标准品中的氨基酸是同一种物质，起到确认的作用。图2所示的18种标准氨基酸CNBF衍生物色谱图，出峰顺序依次为(1) CysA,磺基丙氨酸(半胱氨酸)；O)Asp，天门冬氨酸；(3)Glu，谷氨酸；(4)His，组氨酸；(5)Arg，精氨酸； (6)kr，丝氨酸；(7)Thr，苏氨酸；(8)ftx)，脯氨酸；(9)Met(0)2，蛋氨酸砜(蛋氨酸)；(10) Gly,甘氨酸；(Il)Ala,丙氨酸；(12) Val，缬氨酸；(13) Trp,色氨酸；(14) Leu,亮氨酸；(15) lie。异亮氨酸；(16) Wie,苯丙氨酸；(17) Tyr，酪氨酸；(18) Lys，赖氨酸。图3和图4分别为采用常规(酸)水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱及其放大，本方法用于测定本方法用于测定除含硫氨基酸(蛋氨酸和 (半)胱氨酸)和色氨酸之外的其他15种蛋白水解氨基酸，包括天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、，精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸。图5和图6分别为采用氧化酸水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC测定曲线图谱及其放大图谱，主要用于测定蛋氨酸(图中被其氧化产物蛋氨酸砜一Met (0)2代替)和(半)胱氨酸(图中被其氧化产物磺基丙氨酸-CysA代替)两种含硫氨基酸。图7和图8分别为采用碱水解法对婴幼儿成长奶粉前处理后得到的氨基酸HPLC 测定曲线图谱及其放大图谱，主要用于测定色氨酸。上述氨基酸HPLC测定曲线图谱是从高效液相色谱仪输出的某个浓度(本方法采用2mmol/L)的标准曲线，说明该方法对氨基酸的分离程度(不同的方法得到不同曲线)，是方法好坏的最直接的标志，但不作为具体的使用。在检测时要做标准曲线(通常选五个浓度)，并通过标准曲线得到样品的氨基酸含量(浓度)。
权利要求
1.奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备奶粉水解样品采用三种不同的前处理方法即常规水解法、氧化水解法、碱水解法分别对奶粉进行水解，分别制得奶粉水解样品；(2)三种奶粉水解样品的衍生衍生剂为CNBF，其浓度大于每种奶粉水解样品总氨基酸浓度的3倍，衍生时间为 40min，衍生温度为65°C，同时以上述衍生条件对18种混合氨基酸标准溶液进行衍生；(3)色谱分离检测条件检测仪器Waters Alliance 2690Λ695高效液相色谱系统，120孔自动进样装置， Waters 2487紫外检测器，Waters 二极管阵列检测器；色谱柱通用的C18液相色谱柱；流动相流动相A为乙腈，流动相B为50mmol/L乙酸钠缓冲液与0. 24%的三乙胺，流速为 0. 32ml/min, pH 为 5. 8 ；检测波长设定吸收波长为240nm ；(4)测定对衍生后的18种混合氨基酸标准溶液进行紫外光谱扫描和色谱检测，得到18种标准氨基酸衍生物光谱扫描图和色谱图；对衍生后的三种不同前处理的奶粉水解样品进行高效液相色谱分析，得到奶粉中18种氨基酸HPLC测定曲线图谱。
2.根据权利要求1所述的奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于三种不同的前处理方法具体方案为①常规水解法称取0.0500g奶粉转移至安培瓶或水解管中，加入6mol/L盐酸10ml， 滴加2-3滴溶解后的新鲜苯酚，充入高纯氮气15min，在充氮气状态下对安培瓶封口或迅速拧紧水解管螺帽，将安培瓶或水解管置于110士 1°C的恒温干燥箱水解20士 Ih ；取出安培瓶或水解管，冷却，混勻，开管，将水解液用PH7. 0磷酸盐缓冲溶液转移至50. Oml的容量瓶，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用；②氧化水解法称取0.0500g奶粉转移至安培瓶或水解管中，于冰浴中冷却30min，加入预冷的过甲酸溶液2. 0ml，加液时将样品全部润湿，但不要摇动，盖好瓶塞，连同冰浴一起置于4°C冰箱中，反应16h ；加入氢溴酸0. :3ml，振摇，放回冰浴，于通风柜中静置30min，用氮吹仪或旋转蒸发在不高于60°C的温度下浓缩至干；取6. Omol/L盐酸IOml将残渣定量转移至安培瓶或水解管中，封口，置110士 1°C的恒温干燥箱水解20士 Ih ；取出安培瓶或水解管， 冷却，用去离子水将水解液定量转移至50. 0 ml容量瓶中，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用；③碱水解法称取0.0500g奶粉，转移至聚四氟乙烯衬管中，加10ml碱解剂，于液氮或干冰乙醇中冷冻，将聚四氟乙烯衬管插入安培瓶或水解管，充入高纯氮气15 min，在充氮气状态下对安培瓶封口或迅速拧紧水解管螺帽，将安培瓶或水解管置于110 士 1 °C恒温干燥箱水解20士 Ih ；取出安培瓶或水解管，冷至室温，开管，用pH 7.0磷酸盐缓冲溶液将水解液转移到50. 0 ml容量瓶中，定容，充分混勻后用滤纸过滤，上清液贮于冰箱中备用。
3.根据权利要求1或2所述的奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于三种奶粉水解样品的衍生的具体方案为在10 ml磨口塞试管中加入1. 0 ml奶粉水解样品，加入5.0 ml pH 9. 0硼酸缓冲溶液，用旋涡振荡器振荡30 s混勻，加入 2.0 ml CNBF溶液，CNBF的浓度为50-100 mmol/L，根据每种奶粉水解样品中氨基酸的浓度确定，保证CNBF的总浓度大于每种奶粉水解样品中氨基酸总浓度的三倍以上，旋涡振荡器充分振荡混勻后，封口膜密封后，放入65°C水浴中衍生40 min，衍生后放置至室温，转移至 25ml刻度试管中，加入pH7. 0磷酸盐缓冲溶液至25mL，用旋涡振荡器振荡30 s混勻，静至 10 min,取适量溶液用0. 22Mm滤膜过滤。
4.根据权利要求1或2所述的奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法， 其特征在于通用的C18液相色谱柱，可选用日本Siiseido ODS C18色谱柱、瑞典Kromasil ODS C18色谱柱。
5.根据权利要求3所述的奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于通用的C18液相色谱柱，可选用日本Siiseido ODS C18色谱柱、瑞典Kromasil ODS C18色谱柱。
6.根据权利要求1所述的奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于得到的18种标准氨基酸衍生物色谱图，出峰顺序依次为(l)CysA，磺基丙氨酸； (2) Asp，天门冬氨酸；(3) Glu,谷氨酸；(4) His，组氨酸；(5) Arg,精氨酸；(6) Ser,丝氨酸； (7)Thr，苏氨酸；(8)ftx)，脯氨酸；(9)Met(0)2，蛋氨酸砜；(IO)Gly,甘氨酸；(ll)Ala，丙氨酸；(12) Val，缬氨酸；(13)Trp,色氨酸；(14)Leu,亮氨酸；(15) lie,异亮氨酸；(16)Phe,苯丙氨酸；(17) Tyr,酪氨酸；(18) Lys，赖氨酸。
全文摘要
本发明属于氨基酸检测技术领域，具体为奶粉中18种蛋白水解氨基酸的高效液相色谱检测方法。解决现有的氨基酸测定方法存在成本高、普适性差以及目前基于高效液相色谱仪不能快速准确对蛋白水解后的18种标准氨基酸进行定性和定量分析的问题。本方法通过三种不同的水解方法对奶粉进行前处理，通过CNBF衍生剂对奶粉水解样品进行柱前衍生，采用HPLC和通用的C18(250mm×4.6mm，5μm)液相色谱柱，并对衍生条件和色谱分离检测条件进行优化，能够对奶粉中蛋白水解的全部18种氨基酸进行分离和测定，该方法普适性更强，而且不需要贵重的氨基酸分析仪和/或贵重的氨基酸测定试剂包，适用于更多的常规实验室。
文档编号G01N30/06GK102323341SQ201110153138
公开日2012年1月18日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者傅英文, 宋欢, 张建军, 李卫华, 李玉玲 申请人:山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心