专利名称：一种全成分群同时测算方法
技术领域：
本发明属于多成分分析和免疫技术结合领域，属于化学、生物医药、中医药学的交叉学科，涉及一种全成分群同时测算方法。
背景技术：
现已报道的检测方法主要是用于单成分检测，很少有同时检测多成分的方法和产品出现，而对于同时检测全成分群的产品则更少。随着中医药现代化和系统生物学的代谢组学研究的兴起，解决中药多成分群与系统生物学的代谢成分群等全成分群的同步测定问题已迫在眉睫。近几年来，一些研究人员试图采用指纹图谱技术解决这一问题，但缘于色谱柱的分离能力、色谱峰的重现性及通用检测器的原因，很难实现中药及代谢组全成分群检测。纵观成分的检测方法可分化学方法与仪器方法，化学方法多用于无机化合物的分析，而有机化合物多采用仪器分析。目前常用的检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、色谱/ 质联用分析法、毛细管电泳法、薄层色谱法、荧光分析法、标记免疫分析法(酶联免疫方法、 放射免疫技术测定法和化学发光酶免疫测定法)等。气相色谱法适用于有挥发性的物质的分析；高效液相色谱法多用于有紫外吸收的成分分析，对于没有紫外吸收的化合物可采用折光示差、蒸发光散射等检测分析，但灵敏度低，对于能产生荧光的物质可采用荧光检测测分析，但产生荧光的物质较少，因此高效液相到目前为止还没有适用所有成分的通用检测器；色谱/质联仪采用离子峰进行分析，灵敏度高、特异性强，但对于同分异构型化合物也不适用，对于有机大分子化合物的含量测定也存在困难。总之，这些仪器分析方法的局限是集分离与测定于一身，只有当样品成分被分离后才能检测，同时所有的检测器只能检测特定的化学成分群，而不能进行全成分群分析，当遇到象中药、中药复方及代谢组这样复杂的有机成分群体系(分子量从几十到上万，成分群结构从简单的氨基酸到复杂的三萜皂苷类)检测时，因色谱柱或检测器的限制，不能将全成分完全分离或检测到是必然的。因此建立起一种“法于自然”的仿生全成分群检测技术是实现中药现代化、解决代谢组学与中药质量控制时全成分群测定国际性难题的客观需要。众所周知，机体对中药成分群或代谢组成分群的快速“辨识”却不按化学分析原理，而是将其当作“外源性”物质经免疫应答识别，蛋白质与多糖等大分子具有免疫原性，而中药或代谢组的成分多为小分子，一般不具备免疫原性，但可将小分子成分群作为半抗原， 通过与载体偶合成抗原，以抗原决定簇递呈而被辨识。分子量小的可以作为半抗原识别，分子量大可以作为全抗原识别，因此免疫识别可囊括自然界与人工合成所有的有机物分子类群，自然是中药与代谢组成分群绝好的检测方法。免疫标记技术是指用荧光素、酶、放射性同位素、化学发光物、胶体金或电子致密物质等标记的抗体或抗原进行抗原抗体反应测定的技术，其中酶联免疫技术应用最广。目前免疫标记技术及产品多针对具有免疫原性的蛋白质、多糖设计，主要用于病理或生理状态的细胞因子测定，少用于象中药或代谢组研究中所遇的成分群的测定，尽管已有专利申请与文献报道中药成分群的质量控制可采用特异性的抗体抗原反应，但目前仅有芍药苷等10余种小分子成分建立了酶联免疫测定(也有其它的标记免疫测定)，多按单成分测定模式成分分析，没有适合全成分群的同步芯片标记测定技术及相关芯片产品的面世。主要原因有五，一是传统成分测定多注重单成分的精确测定，少关注多成分的同步测定，测定方法多受单成分测定模式的影响，另者也没有学科研究的需要。近年来，随着中医药现代化与代谢组学研究的需要，全成分群的快速同步测定已是学科发展亟需解决的关键问题，引起了国内外广泛的关注与重视，已成为中药、生物医药、分析化学领域的国际难题；二是有大量高、精、尖测定的现代仪器，对单成分的测定研究细致深入，但对多成分的测定问题研究却不够深入，其缺点还没有引起足够的认识和重视，多认为凭借现代化的仪器可以解决小分子多成分群的测定难题，因此，近年来推动了指纹图谱测定多成分技术的兴起，但缘于指纹图谱测定技术具有与现代仪器分析一样的弱点亦在大多数情况下，要先分离才能分析，故极大地制约了对多成分群体系的同步快速分析；三是目前还没有能满足全成分群检测所需的通用检测器；四是对于大分子化合物目前有采用标记免疫芯片技术的报道，但所针对的物质数目不大，相互间一般不考虑交叉反应的干扰，而大多数小分子有机化合物本身没有免疫原性，要与载体结合才能有免疫原性，尽管目前有单个小分子酶联免疫测定方法的报道，也有利用特异性的抗体抗原反应来进行中药成分群的质量控制的专利申请，但要建立适合中药与代谢组全成分群成千上万大样测定方法，不得不解决成分间的交叉反应；五是由于抗原与抗体的结合专属性决定抗原表位的决定簇，而中药及代谢物成分往往又同母核群生，难免存在相似的抗原决定簇，因此当芯片中的特异抗体与成千上万成分反应时非常有可能发生交叉反应，如莱克多巴胺抗体对多巴酚丁胺有8. 3 %交叉反应，链霉素抗体对双氢链霉素的交叉反应率达90. 6%，青霉素过敏病人与头孢菌素有17. 38%交叉过敏反应。 因此，怎样处理交叉反应是实现全成分群测定的最为关键的技术。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种全成分群同时测算方法。全成分群同时测算方法操作方便，重要的是能满足含各种多分子群的大批样本的同时测定需求，特别适合具有复杂组分的混合物的分析和测定，如中草药、药物代谢产物、生物代谢物组、作物、食品、农药、化工产品等等。针对大样本抗体与成分间的交叉反应有二种解决思路，第一种思路为传统的观点，亦追求抗原表位的决定簇的特异性，尽量地消除交叉反应。对于具有免疫原性的大分子物质，因不易出现表位决定簇完全相同，可直接注入到动物体内产生特异性抗体，其抗体抗原反应特异性强，在做成芯片时可以不考虑抗体与成分间的交叉反应，目前很多生物试剂盒就是据此原理设计制而成；但对于中药及代谢组学中的小分子有机物，没有免疫原性， 只能作为半抗原，与载体(蛋白质或高分子物)结合成抗原，注射到动物体内，才能产生所需特异性抗体，因此，抗体与小分子之间半抗原方间的作用程度处决于各小分子之间的相似程度以及与载体蛋白质的合成方法，随着半抗原成分间相似程度的增加，其交叉反应表现得越强，大量文献也报道了各成分标记免疫竞争法检测时所产生的交叉反应，因此要完全消灭成分间的交叉反应既不符合自然规律，也不现实与可能，故只按传统的消除交叉反应的思路来进行大样本特异性抗原抗体测定会变得棘手，为此，我们只能另辟蹊径，采用第二思路，亦在尽可能消除交叉反应的情况下，不畏惧、不特异回避交叉反应，而是掌握并充
5分利用交叉反应信息来全面分析所纳入成分，先获得各抗体与半抗原成分之间的交叉反应率，根据实验的精确度需要，先确定交叉反应率界值，对于大于界值的交叉成分可组成特异性与非特异性交叉成分浓度对数或浓度线性方程组来测算获得其浓度，从而实现全成分群抗体与抗原特异性与非特异性标记免疫反应分析的结合，建立起以芯片的形式进行快速、 高通量的定性定量分析，解决目前中药及代谢组学全成分群同步测定的国际性难题。本发明先将各成分群分离、鉴定，确定该成分的归属；然后对有免疫原性的大分子直接注入动物体内产生抗体，没有免疫原性的小分子与大分子载体直接反应或化学合成为全抗原，在合成时尽可能地增强抗体与各成分半抗原间的特异性反应，消除成分间的交叉反应。直接或以合成抗原注入动物体内，产生抗体，分离抗体；再标记抗体或抗原；包被未标的抗体或抗原，制成多成分群的免疫芯片。通过抗体和抗原的竞争性的免疫标记反应获得全成分群的线性回归方程与交叉反应信息，再根据实验精确度的需要，将成分群分成需考虑交叉反应与不需考虑交叉反应两类，前者可直接依据芯片包埋抗原或抗体点阵的信号有、无、强、弱直接由线性回归方程读出含量，后者需建立对数浓度、浓度多元线性方程组， 求解计算获得各成分群的含量，从而实现中药、代谢组学乃至化学合成与半合成全成分群的定性定量分析，达到多把钥匙同时开多把锁的钥锁，相互关联匹配分析的检测分析目的。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种全成分群同时测算方法，包括以下步骤(1)根据成分的免疫原性与结构特点，对于具有免疫原性的大分子化合物直接作为抗原；将没有免疫原性的小分子采用直接或化学合成的方法与大分子载体制备成抗原；(2)上述抗原分别或混合注射到动物体内产生抗体，并分离出抗体；(3)对上述抗原或抗体进行标记；(4)将未标记的抗体或抗原按实验目的有规律地包被成芯片板；(5)获取交叉反应矩阵R、斜率矩阵B、同一抗体截距和的列向量A、浓度对数或浓度列向量C和总叠加抑制率列向量I :取与待测成分相应的免疫芯片板，采用固相吸附标记免疫竞争法测定芯片板点阵对各成分标准品液的特异与非特异性线性关系；依交叉反应公式计算成分间的交叉反应率，获得抗体与成分特异与非特异反应两两交叉反应率矩阵R，根据实验精度确定交叉反应率界值，根据界值确定需考虑与不考虑交叉反应成分类别，考虑交叉反应成分，需建立各抗体与成分间相互交叉作用的斜率矩阵B、 同一抗体截距和的列向量A及浓度对数或浓度列向量C ；取与待测成分相应的免疫芯片板，采用固相吸附标记免疫竞争法测定芯片点阵对待测样品液的总抑制率，再转换成总叠加抑制率列向量I ；(6)对于不考虑交叉反应的成分，直接依线性方程读出该成分的含量；需考虑交叉反应的成分，根据标准曲线与样品液的总叠加抑制率建立成分对数浓度的多元线性方程BC = I-A，求解获得成分的含量；从而获得所有成分的含量。所述的载体为蛋白质或其它具免疫原性的非蛋白质高分子化合物；所述的抗原所产生的抗体为IgA、IgD、IgG、IgE和IgM中的一种或多种；所述的抗原或抗体的标记方法为荧光标记法、酶标记或放射性核素标记、胶体金及化学发光标记法；
所述的有规律包被为按化学类型、中文编码、英文编码、药材所含成分类群、功效、 功能团、生物物种、同类化合物或同一组分代谢产物针对不同检测目标要求而编排成各种芯片点阵，包被未标记的抗原或抗体。斜率矩阵为B j)，i为包被的抗体或抗原，j为竞争的成分，i与j的交叉作用超过了实验精度界限，b^·为B矩阵中的任一元素，亦任一抗体对任一成分作用线性方程的斜率；同一抗体截矩和的向量为
权利要求
1.一种全成分群同时测算方法，其特征在于，包括以下步骤(1)根据成分的免疫原性与结构特点，对于具有免疫原性的大分子化合物直接作为抗原；将没有免疫原性的小分子采用直接或化学合成的方法与大分子载体制备成抗原；(2)上述抗原分别或混合注射到动物体内产生抗体，并分离出抗体；(3)对上述抗原或抗体进行标记；(4)将未标记的抗体或抗原按实验目的有规律地包被成芯片板；(5)获取交叉反应矩阵R、斜率矩阵B、同一抗体截距和的列向量A、浓度对数或浓度列向量C和总叠加抑制率列向量I :取与待测成分相应的免疫芯片板，采用固相吸附标记免疫竞争法测定芯片板点阵对各成分标准品液的特异与非特异性线性关系；依交叉反应公式计算成分间的交叉反应率，获得抗体与成分特异与非特异反应两两交叉反应率矩阵R，根据实验精度确定交叉反应率界值，根据界值确定需考虑与不考虑交叉反应成分类别，考虑交叉反应成分，需建立各抗体与成分间相互交叉作用的斜率矩阵B、同一抗体截距和的列向量A及浓度对数或浓度列向量C ；取与待测成分相应的免疫芯片板，采用固相吸附标记免疫竞争法测定芯片点阵对待测样品液的总抑制率，再转换成总叠加抑制率列向量I ；(6)对于不考虑交叉反应的成分，直接依线性方程读出该成分的含量；需考虑交叉反应的成分，根据标准曲线与样品液的总叠加抑制率建立成分对数浓度的多元线性方程BC =I-A，求解获得成分的含量；从而获得所有成分的含量。
2.根据权利要求1所述的全成分群同时测算方法，其特征在于，所述的载体为蛋白质或其它具免疫原性的非蛋白质高分子化合物；所述的抗原所产生的抗体为IgA、IgD、IgG、IgE和IgM中的一种或多种；所述的抗原或抗体的标记方法为荧光标记法、酶标记或放射性核素标记、胶体金及化学发光标记法；所述的有规律包被为按化学类型、中文编码、英文编码、药材所含成分类群、功效、功能团、生物物种、同类化合物或同一组分代谢产物针对不同检测目标要求而编排成各种芯片点阵，包被未标记的抗原或抗体。斜率矩阵为B ，i为包被的抗体或抗原，j为竞争的成分，i与j的交叉作用超过了实验精度界限，b^·为B矩阵中的任一元素，亦任一抗体对任一成分作用线性方程的斜率；η同一抗体截矩和的向量为A ( >' η为需考虑交叉反应成分的数目，\ j表示截矩；=1矩阵的任一元素，即任一抗体对任一成分作用线性方程的斜率。
3.根据权利要求1所述的全成分群同时测算方法，其特征在于，获得斜率矩阵B、同一抗体截距和的列向量A以及浓度对数列向量C的具体过程为取与待测成分数目5 6倍的芯片板，在包被有多种抗原或抗体的芯片板每个微孔内分别两两交叉加入1 4数量级梯度的标准品溶液，每一块板只加呈梯度浓度标准品液中的一个浓度标准品液，5 6块板完成一个成分对特异性抗原抗体交叉影响反应的线性考察实验；标准品液加完后再在每个微孔内分别对应加入标记多克隆抗体或标记抗原反应， 洗涤后，加入底物显色测定或直接测定荧光、放射性强度、发光强度；先计算抑制率，再建立各成分标准品液对抗原抗体反应抑制率的线性方程；计算出IC5tl，再按特异性反应的IC5tl除以非特异性的IC5tl计算交叉率，获得交叉信息，根据实验的精密度确定交叉反应率的界值， 取大于交叉反应率界值的成分组成交叉率矩阵R P，根所交叉率矩阵R组成对应的斜率矩阵B(bq)与同一抗体截矩和向量
4.根据权利要求1所述的全成分群同时测算方法，其特征在于，获得总叠加抑制率列向量I的具体过程为取包被有多种抗体或抗原的芯片板，每个微孔内加入待测样品溶液，在每个微孔内加入标记的抗原或标记抗体，反应，洗涤后，加入底物显色测定或直接测定荧光、放射性强度、 发光强度，读出样品液对抗原抗体竞争反应吸收值，采用DzDtl计算抑制率时，则应乘上100， 再加上(η-1) X 100构成总叠加抑制率列向量I ；采用(Dtl-D)/Dtl计算抑制率时，则乘上100 即可；D为样品或标准品的吸收值，D0为不加样品或标准品液的吸收值。
5.根据权利要求1所述的全成分群同时测算方法，其特征在于，免疫抗原的合成方法为对于具免疫原性的大分子可直接作抗原，各种类型小分子成分能与蛋白质反应的可直接合成全抗原；不能与蛋白质直接反应的通过下列化学反应合成全抗原(1)对于含氨基基团的半抗原成分，采用重氮化法或戊二醛法或多元酸酐法或二异氰酸酯法或偶氮苯甲酸法或亚胺酸酯法合成全抗原；(2)对于含糖基的半抗原成分，采用过碘酸盐氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成khiff氏碱法合成全抗原；(3)对于含羧基基团的半抗原成分，采用混合酸酐法或碳二亚胺法或活泼酯法合成全抗原；(4)含酮基基团半抗原成分，可采用0-羧甲基羟胺法或者对胼基苯甲酸法或者 Mannich反应法合成全抗原；(5)含羧酸甲酯衍生物的半抗原成分，采用叠氮化法，羧酸甲酯衍生物经胼解、亚硝化， 转变为叠氯化物，再与载体蛋白上的氨基反应合成全抗原；(6)对于含羟基基团半抗原成分，采用氯乙酸钠法或三氯三嗪试剂法合成全抗原；(7)含氨基、羟基、巯基的半抗原，可采用卤代硝基苯法或苯醌法合成全抗原； 合成所使用的载体蛋白有丙种球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、牛甲状腺球蛋白(TG)、血蓝蛋白(Hemocyanin)以及人、牛和鸡Y-球蛋白、卵黄蛋白，或者是人工合成的多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、多聚混合氨基酸；或者采用聚乙烯吡咯酮、羧甲基纤维素、聚甲基丙酸酯微粒、乳胶和炭末。
全文摘要
本发明公开了一种全成分群同时测算方法(1)根据成分的免疫原性与结构特点制备抗原；(2)上述抗原分别或混合注射到动物体内产生抗体，并分离出抗体；(3)对上述抗原或抗体进行标记；(4)将未标记的抗体或抗原有规律地包被成芯片板；(5)获取抗体与成分间的交叉反应信息，根据实验精度要求构建斜率矩阵B、同一抗体截距和的列向量A、浓度对数或浓度列向量C和总叠加抑制率列向量I；(6)对于不考虑交叉反应成分，直接依线性方程读出含量；需考虑交叉反应成分，根据BC＝I-A求解获得成分含量；从而获得全成分群含量。本测算方法操作方便，能满足含各种成分群大批量样本的同时测定需求，特别适合复杂组分群的分析和测定。
文档编号G01N33/53GK102353767SQ20111018941
公开日2012年2月15日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者贺琪珺, 贺福元, 邓凯文 申请人:贺福元