专利名称：一种人源trim25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学和抗病育种领域。更具体涉及一种抑制口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth DiseaseVirus, FMDV)增殖的TRIM25基因，同时还涉及一种抑制口蹄疫病毒增殖的TRIM25基因的制备方法，还涉及一种TRIM25基因在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。
背景技术：
我国是世界养猪第一大国。养猪业是我国畜牧业的主导产业，猪肉占肉类的 67.7%，是我国人民动物蛋白质的最主要来源。猪病严重制约着我国养猪业发展。近年来， 口蹄疫、猪繁殖与呼吸道综合征等重大疾病频频爆发，对我国养猪业造成巨大损失。口蹄疫的暴发不但影响到经济发展、国际贸易，而且对社会的稳定构成威胁，因此又称之为“政治经济病”。联合国粮农组织(FAO)和世界动物卫生组织(OIE)都将该病列为重要动物传染病，并列入重大跨国动物疫病的全球消灭计划。在国际上，口蹄疫(Foot-and-Mouth disease, FMD造成的经济损失巨大。如2001年2月由英国引发的FMD使得法国、爱尔兰、荷兰等欧盟国家相继暴发该病，南美的阿根廷也暴发FMD。英国在此期间共宰杀动物达450万头，由此造成的全部经济损失高达90亿英磅，而且2007年英国又发生两起FMD疫情。有经济报告分析，如果畜牧业十分发达的美国暴发FMD，当年的直接和间接损失将分别是40亿美元和400亿美元。我国的FMD疫情非常严重。据统计资料表明，1999-2003年期间，我国发病动物总数达890616头(只)，遍及31个省、市、自治区，疫情暴发次数11 个，疫点数2375个。 2003年4月份以后，0型FMD出现了我国罕见的基因型毒株，泛亚毒株又卷土重来。青海和新疆分别发现了 A型和Asia I型FMD。新疆0型和Asia I型FMD同时流行，在病畜中还发现0型和Asia I型混合感染。2009-2010年猪0型FMD耿马毒在我国养猪场大面积的流行。而且各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。因此如果能培育出抗FMD的猪新品种，将能从根本上解决FMD防控问题，而其关键是发掘抗FMDV复制的抗性基因。目前研究表明，FMDV对干扰素非常敏感，干扰素处理的细胞能够很好的抑制FMDV的增殖，因而激活干扰素信号通路的宿主信号分子具有抗FMDV 复制的潜力。三基序CTripartite motif, TRIM)蛋白家族包括60多个成员，在生物学过程中发挥多种功能，如细胞分化、发育、发展、凋亡和免疫等(Quaderi et al. , 1997 ；Avela et al.，2000)。TRIM蛋白具有共同的特征性的三基序，三个锌指结合区，一个RING指以及1 2个B-Box和一个环状的环区，因而称为RBCC(Boxden，1998)。C末端在不同的分子间存在差异，大多有一个或更多的特异区域来决定该TRIM蛋白特异功能。TRIM RING区域具有E3 泛素化连接酶活性，介导不同底物的翻译后修饰。通过CC区自我关联，TRIM蛋白寡聚体化并充当支架组装成多蛋白复合物占特异的细胞层。最新研究表明，TRIM超家族中的多个成员由干扰素诱导表达，并且在参与了多种与天然免疫相关的生物过程。TRIM25RING E3泛素连接酶能使病毒RNA受体维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1) 的N段泛素化，进而与下游MAVS结合激活宿主干扰素信号通路，启动IFN-β的产生，发挥抗病毒作用(McNab et al. ,2011 ；Gack et al. ,2007 ；Gack et al. ,2008 ；Yoneyama and Fujita，2001)。动物病毒性疫病的预防传统上主要通过疫苗的免疫预防接种，在动物疫病预防与控制中发挥着极其重要的作用。由于FMDV各亚型之间无明显的交叉保护，增加了疫情的复杂性和控制难度，使防疫工作面临很大困难。近年来随着转基因等生物技术的快速发展，动物的分子抗病育种得到长足的进步，可以从源头上控制疫病尤其是病毒性疾病的发生。分子抗病育种是控制疾病有效的策略之一，如将疫苗免疫和分子抗病育种结合在一起必将有助于动物疫病的控制。以人源FMDV(hFMDV)蛋白为研究对象，利用过表达hTRIM25蛋白的细胞株来评价hTRIM25对FMDV增值的影响，为FMDV的抗病毒育种提供优良的候选基因奠定基石出。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种稳定表达人源TRIM25基因(hTRIM25)的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP。该细胞可以稳定表达hTRIM25和绿荧光蛋白eGFP，用于体外研究TRIM25蛋白抗病毒活性的优良材料。本发明的另一个目的是在于提供了一种稳定表达hTRIM25基因(hTRIM25)的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP的制备方法，利用自身携带的绿荧光eGFP和抗性基因nero的G418， 便于细胞株的筛选和建立。本发明另一个目的是在于提供了一种抑制口蹄疫病毒(FMDV)增殖的hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP在制备治疗或预防口蹄疫病毒(FMDV)药物(增殖上)中的应用。在BHK-21细胞上过表达hTRIM25，通过细胞病变程度可以直接评价该蛋白抗病毒活性。本发明的还有一个目的是在于提供了一种hTRIM25基因在构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物中的应用。通过显微注射在体内稳定表达hTRIM25基因，为研究该蛋白的抗病毒活性提供材料。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法，其步骤是A、hTRIM25 基因的获取参照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，设计一对引物phTRIM25F (5，-TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3，)phTRIM25R(5’ -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3，)提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F 和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分别引入EcoRI和XhoI，便于进行亚克隆。其反应体系为模板 cDNA 5. 0 μ L，10XLA buffer 5. 0 μ L, phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (终浓度为 10pmol/L)，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0μ L，力口 ddH20 至 50. 0μ L。 按94°C作用3分钟；然后94°C作用30秒分钟，58°C退火30秒，72°C延伸3分钟，共35个循环，最后72°C延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8% (g/v) 的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小1893bp带为hTRIM25基因。B、真核表达载体pCA_hTRIM25eGFP的构建通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用Sail和 XhoI分别酶切pEGFP-Cl和pCA_hTRIM25，回收载体pEGFP-Cl和含有启动子和hTRIM25片段并用T41igaSe连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得 pCA-hTRIM25eGFP (见图 1B)。C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21_hTRIM25eGFP细胞株的构建通过脂质体法Lipofectamine 2000(Invitrogen)将 pCA-eGFP 和 pCA-hTRIM25eGFPG 转染 BHK-21(baby hamster kidney, ATCC CCL10)细胞，转染 36 小时后用SOOyg/μ L G418筛选，进行5轮后，通过间接免疫荧光和Wfestern blotting鉴定 hTRIM25蛋白的表达情况，并命名为BHK21-hTRIM25eGFP。①间接免疫荧光鉴定hTRIM25蛋白的表达将BHK-eGFP和转染人源TRIM25的BHK_TRIM2kGFP细胞接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层，进行间接免疫荧光。多聚甲醛固定，一抗为抗V5单克隆抗体 anvitrogen)，二抗为抗鼠的Ig-G-RFP FITC0由于绿荧光蛋白与hTRIM25融合，所以细胞直接在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光信号，初步表明外源基因表达情况。进而用抗V5 抗体进行间接免疫荧光，红色荧光信号表明hTRIM25的表达。一种分离的细胞株，其序列为 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，表明成功构建细胞株BHK21-hTRIM25eGFP。②Western blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达收集长满单层BHK-eGFP和BHK_hTRIM25eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和 Western blotting检测。所用一抗为抗V5单克隆抗体Qnvitrogen)，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体。结果在BHK21-hTRIM25eGFP细胞中有75KD的特异性阳性带，与hTRIM25 蛋白大小相符，而正常BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21_hTRIM25eGFP细胞株中hTRIM25有效表达(如图2B)。通过间接免疫荧光和Wfestern blotting表明所建立BHK21_hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白。由于hTRIM25蛋白理论上通过RING E3泛素连接酶使病毒RNA 受体维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene-1，RIG-1)的N段泛素化，进而与下游MAVS结合激活宿主干扰素信号通路，启动IFN-β的产生，发挥抗病毒作用，进而通过抗病毒活性研究其生物功能。一种稳定表达人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株在制备治疗或预防口蹄疫病毒药物中的应用，其应用过程是为了研究hTRIM25基因对FMDV增殖的影响，在96孔细胞培养板中分别接种 BHK-eGFP 和 BHK-TRIM25-eGFP，0. 8X104cells/well。次日分别用 0 型 FMDV 进行病毒感染， 感染剂量为 IOOTCID5q (0.0125M0I)，每孔接种 100 μ 1, 37°C, 5% (v/v) C02 吸附 lh。Ih 后吸弃上清，补加200 μ 1维持液。分别在感染后不同的时间点观察病毒感染细胞情况并收集上清，进而测定TCID5tl(如图3)。一种抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是
为了在机体水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用PCA_hTRIM25eGFP，通过显微注射进行转基因猪的研究，图4为转基因猪第一代产仔猪的DNA检测结果。本发明的有益效果是1.本发明所构建的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白。2.本发明是稳定表达hTRHC5基因的细胞株BHK21_hTRIM25eGFP能够抑制口蹄疫
病毒复制。3.本发明的hTRIM25基因可以用来构建转基因猪等转基因动物。
图1为构建真核质粒pCA-eGFP和PCA_hTRIM25eGFPG的示意图以及酶切鉴定IA为构建真核质粒pCA-eGFP和pCA_hTRIM25eGFPG的示意图。图IB为利用EcoRI和HindIII分别进行酶切鉴定图。图2为一种人源TRIM25基因在BHK21细胞中表达图谱示意图。利用自身表达的绿荧光和抗V5标签的间接免疫荧光的鉴定BHK21_hTRIM25eGFP 细胞株(2A)；抗V5抗体进行Western-blotting进一步鉴定hTRIM25的表达，大小为 75KDa(2B)。图3为一种稳定表达人源TRIM25基因细胞株抑制口蹄疫病毒增殖的图谱示意图。将BHK-eGFP和BHK21_hTRIM25eGFP细胞分别接种96孔细胞培养板， 0. 8X104cells/welL·次日用0.0125M0I 0型和A型FMDV进行病毒感染，分别于感染后不同时间点观察细胞病变并取样测定病毒含量。结果表明在Mh时，BHK21-hTRIM25eGFP细胞细胞病变很少，而BHK-eGFP细胞病变程度很严重，表现为细胞变圆，脱落(A)。测定结果不同时间点病毒含量(半数组织培养感染计量TCID5tl，如B所示)，统计表明hTRIM25能显著抑制FMDV的增殖(C)。图4为转基因母猪所产第一代仔猪样品DNA检测图。通过显微注射胚胎于母猪受孕，所产仔猪耳部样品提取DNA进行PCR扩增外源基因hTRIM25结果图。
具体实施例方式实施例1 一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的构建1、人源TRIM25基因的合成参照人源TRIM25基因序列(NM_00508)，设计一对引物pTRIM25F (5， -TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3，)pTRIM25R (5， -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3，)提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F 和phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分别引入EcoRI和XhoI，便于进行亚克隆。其反应体系为模板质粒 cDNA5. 0yL，10XLAbuffer 5 μ L，phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L (终浓度为 10pmol/L)，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。按94°C作用3分钟；然后94°C作用30秒分钟，58°C退火30秒，72°C延伸3分钟，共35个循环， 最后72°C延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0.8% (g/v)的琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小1893bp为hTRIM25基因。2、真核表达载体pCA_hTRIM25eGFP的构建通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA_hTRIM25。然后用SalI和 XhoI分别酶切pEGFP-Cl和pCA_hTRIM25，回收载体pEGFP-Cl和含有启动子和hTRIM25片段并用T41igaSe连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定，结果表明成功获得 pCA-hTRIM25eGFP (见图 1B)。3、稳定表达人源TRIM25基因的BHK21hTRIM2kGFP细胞株的构建用pCA-eGFP 和 pCA_hTRIM25eGFPG 共转染 BHK-21 细胞，转染 36 小时后用 800 μ g/ μ LG418进行筛选，进行多轮筛选后，通过间接免疫荧光和Western-blotting鉴定外源基因hTRIM25的表达情况。(a)、间接免疫荧光鉴定hTRIM25的表达将BHK-eGFP和转染人源TRIM25的BHK_TRIM2kGFP细胞接种于M孔细胞培养板， 待细胞长满单层，进行间接免疫荧光，具体步骤如下1.吸弃培养液，用PBS洗细胞3次，每次5min ；2.吸弃PBS，每孔加Iml 4% (ν/ν)多聚甲醛，室温摇床作用30分钟；3.吸弃4% (ν/ν)多聚甲醛，用PBS洗细胞3次，每次IOmin ；4.吸干 PBS,每孔加 1ML0. 2% (v/v) TrotonX-IOO 的 PBSA,冰上作用 5min ；5.用PBS洗细胞3次，每次!Bmin ；6.每孔加Iml 1% (g/v) BSA的PBS，室温作用封闭Ih ；7.用PBS洗细胞1次，每次!Bmin ；8.加入一抗(anti-V antibody 1 200,) :300ul PBSA+1. 5ul anti-V antibody, IOOul/ 孔；9. 37°C 作用 Ih (CO2 培养箱)；10.用PBS洗细胞3次，每次!Bmin ；11.加入二抗(抗鼠的 Ig-G-RFP FITC antibody 1 100) :300ul PBSA+3. Oul FITC antibody+6. Oul DAPI (500ug/ml)，IOOul/ 孔；避光操作。12. 37°C 作用 Ih (C02 培养箱)；13.用PBS洗细胞3次，每次!Bmin ；14.荧光显微镜下观察红荧光情况，结果见附图2A。由于BHK-TRIM2MGFP细胞自身有绿荧光，所以在荧光显微镜下可以直接观察到绿色荧光信号。利用V5标签单克隆抗体，红荧光检测hTRIM25的表达，红色信号表明 hTRIM25有效表达。另外蓝色为细胞核的染色情况。(b)、Western blotting 鉴定 hTRIM25 的表达将长满单层BHK-eGFP和BHK_TRIM2kGFP细胞收集，提取蛋白，12 % SDS-PAGE 电泳后利用抗体为抗V5(Invitrogen)的单克隆抗体进行Wfestern blot检测。同时以 β -actin为内参，结果表明BHK-TRIM2MGFP细胞有一条特异性条带，大小为75KD，与预期结果一直，而BHK-eGFP细胞阴性(附图2B)。
实施例2 一种抑制FMDV增殖的TRIM25基因的细胞株BHK21_hTRIM25eGFP在制备治疗或预防FMDV药物中的应用，其应用过程是为了研究hTRIM25基因对FMDV增殖的影响，分别在感染后不同的时间点观察病毒感染细胞产生细胞病变(CPE)情况并收集上清，测定其病毒含量(TCID5tl)。1、FMDV感染细胞后形态学观察为了观察hTRIM25蛋白对FMDV增殖的影响，用相同剂量的FMDV(0. 0125M0I)感染BHK2 l-hTRIM25eGFP和ΒΗΚ-eGFP细胞，分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应(CPE)(附图3A)。结果表明感染后Mi可以发现BHK-eGFP细胞中有明显的细胞变圆，细胞间隙扩大。而BHK-hTRIM25eGFP细胞长势良好，直到感染后36h BHK-hTRIM25eGFP细胞才有的典型CPE。2、病毒滴度的测定为了量化hTRIM25蛋白对FMDV的抑制效果，测定病毒感染后不同时间点样品中 FMDV的滴度。具体操作如下将BHK-eGFP 和 BHK_hTRIM25eGFP 细胞以 0. 8 X 104cells/well 量分别接种 96 孔细胞培养板，次日用0.0125M0I 0型FMDV进行病毒感染，每孔接种100 μ 1，各3个重复。37°C， 5% CO2吸附lh。Ih后吸弃上清，补加200 μ 1 2%胎牛血清的DMEM。分别在感染后不同时间点观察病毒感染细胞所致细胞病变效应并收集上清，进而测定各个时间点样品中病毒的滴度。按Reed-Muench法测定病毒半数组织细胞感染剂量(TCID5tl)(结果见附图。统计结果表明感染BHK-hTRIM25eGFP细胞组病毒含量一直低于BHK-eGFP细胞感染组，滴度低 IO3倍，表明hTRIM25能显著抑制FMDV的增殖(附图3C)。实施例3 一种抑制FMDV增殖的hTRIM25基因在构建转基因猪等转基因动物中的应用，其应用过程是为了在机体水平研究hTRIM25基因的抗病毒活性，利用PCA_hTRIM25eGFP，通过显微注射进行转基因猪的研究，图4为转基因猪第一代产仔猪的DNA检测结果。尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。
权利要求
1.一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法，其步骤是A、hTRIM25基因的获取参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物phTRIM25F :5’ -TTTGAATTCCACCATGGCAGAGCTGTGC-3’ ；phTRIM25R 5' -TTTCTCGAGTCACGTAGTAGAATCGAGACCGAG-3’ ；提取Hela细胞RNA为模板，以通用引物扩增获得cDNA后，用特异引物phTRIM25F和 phTRIM25R扩增hTRIM25基因，在其5 ‘端和3，端分别弓|入feoRI和XhoI，进行亚克隆，其反应体系为模板 cDNA 5. 0 μ L, 1 OXLA buffer 5. 0 μ L, phTRIM25F、phTRIM25R 引物各 1. 0 μ L 终浓度为 10pmol/L，LA 酶 0. 25 μ L, dNTPS 1. 0 μ L，加 ddH20 至 50. 0 μ L，按 94°C 作用3分钟；然后94°C作用30秒分钟，58 °C退火30秒，72 °C延伸3分钟，共35个循环，最后72°C延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增，扩增的PCR产物经0. 8%g/v的琼脂糖凝胶电泳，一条大小1893bp带为hTRIM25基因；B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建通过和ZAoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA_hTRIM25，然后用Sal\和损οI 分别酶切pEGFP-Cl和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-Cl和含有启动子和hTRIM25片段并用T4 Iigase连接，提取重组质粒，分别通过和历^dIII酶切鉴定，结果表明成功获得 pCA-hTRIM25eGFP ；C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建通过脂质体法 Lipofectamine 2000 将 pCA-eGFP 和 pCA_hTRIM25eGFPG 转染 BHK-21 细胞，转染36小时后用800 μ g/μ L G418筛选，进行5轮后，通过间接免疫荧光和Western blotting 鉴定 hTRIM25 蛋白的表达，为 BHK21- hTRIM25eGFP ；①间接免疫荧光鉴定hTRIM25蛋白的表达将BHK-eGFP和转染人源TRIM25的BHK-TRIM2MGFP细胞接种于M孔细胞培养板， 待细胞长满单层，进行间接免疫荧光，多聚甲醛固定，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗为抗鼠的Ig-G-RFP FITC，绿荧光蛋白与hTRIM25融合，细胞直接在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号，用抗V5抗体进行间接免疫荧光，红色荧光信号表明hTRIM25的表达，构建细胞株 BHK21-hTRIM25eGFP ；②Westernblotting鉴定外源基因hTRIM25的表达收集长满单层BHK-eGFP和BHK_hTRIM25eGFP细胞，提取蛋白，进行SDS-PAGE和 Western blotting检测，一抗为抗V5单克隆抗体，二抗是HRP标记的鼠抗兔单克隆抗体，结果在BHK21- hTRIM25eGFP细胞中有75KD的特异性阳性带，与hTRIM25蛋白大小相符，正常 BHK-eGFP细胞阴性，表明BHK21- hTRIM25eGFP细胞株中hTRIM25有效表达。
2.权利要求1所述的一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株在制备治疗或预防 FMDV药物中的应用。
3.权利要求1所述的一种人源TRIM25基因在构建转基因猪中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人源TRIM25基因抑制口蹄疫病毒细胞株的制备方法和应用，其步骤A、hTRIM25基因的获取参照人源TRIM25基因序列，设计一对引物；B、真核表达载体pCA-hTRIM25eGFP的构建通过EcoRI和XhoI将hTRIM25连入pCA载体，获得pCA-hTRIM25。然后用SalI和XhoI分别酶切pEGFP-C1和pCA-hTRIM25，回收载体pEGFP-C1和含有启动子和hTRIM25片段并用T4ligase连接，提取重组质粒，分别通过EcoRI和HindIII酶切鉴定；C、稳定表达hTRIM25基因的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株的构建通过脂质体法Lipofectamine2000将pCA-eGFP和pCA-hTRIM25eGFPG转染BHK-21细胞，转染后筛选，通过间接免疫荧光和Westernblotting鉴定hTRIM25蛋白的表达，为BHK21-hTRIM25eGFP。该株在制备治疗或预防FMDV药物中的应用。构建的BHK21-hTRIM25eGFP细胞株能稳定表达hTRIM25蛋白；稳定表达hTRIM25基因的细胞株BHK21-hTRIM25eGFP能够抑制口蹄疫病毒复制；hTRIM25基因用来构建转基因小鼠和转基因猪等转基因动物。
文档编号G01N33/53GK102321627SQ20111019107
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者刘莎莎, 周锐, 李祥敏, 许晋芳, 金梅林, 钱平, 陈焕春 申请人:华中农业大学