专利名称：小鼠Myogenin基因超表达载体的构建方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠Myogenin (mMyoG)基因超表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。
背景技术：
作为肌肉的基本组成单位，肌纤维的类型直接决定肉的品质，但是在成年动物中， 不通过肌纤维的新生即可改变原有肌纤维的特性。所以，成年动物肌纤维基因型转化的机制与肌肉分化、生长过程中的机制必定有所不同。肌细胞生成素MyoG是MRFs家族中最重要的成员之一，是一个肌性的bHLH结构的转录因子，在肌肉早期的生长分化过程中发挥着重要作用，在成年动物体内也有表达，但其作用尚不为人知。利用pTARGET 哺乳动物表达系统构建小鼠MyoG真核表达质粒，对开展MyoG在成年动物肌纤维转化中的作用及对动物肉品质调节功能研究具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，以及该表达载体的用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，包括以下步骤1、小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤1)、根据载体的信息和靶序列设计并合成2对MyoG mRNA全长引物；2)、表达载体的构建引物退火后与pTARGET 载体连接转化，得到小鼠MyoG表达载体的重组质粒。作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的改进步骤1)为根据Gene Bank上已知的MyoG基因的mRNA序列(即靶序列)及 pTARGET 哺乳动物表达载体的要求，设计2对引物，分别为引物I: 上游引物5 ‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘ 下游引物5 ‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II上游引物5‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5'-TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3‘。作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的进一步改进步骤2)为将引物退火延伸后得到的PCR产物割胶回收，与表达载体pTARGET 相连，采用热激转化大肠杆菌 JM109。作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的进一步改进对步骤2)所得的重组表达质粒进行鉴定通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定，测序引物为T7引物。鉴定目的是确定是否将靶序列正确地连接到载体上面，因为在连接的过程中会出现载体的自连以及连接方向错误等现象。本发明还同时提供了利用上述方法构建而得的小鼠MyoG表达载体的用途用于研究MyoG基因对肉质的调控作用。作为本发明的小鼠MyoG表达载体的用途的改进，其包括以下步骤(1)将含MyoG表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯无内毒素转染级质粒；( 将含MyoG表达载体的高纯无内毒素转染级质粒转染小鼠C2C12成肌细胞等细胞，37°C，5%的(X)2中保温4 他后更换不含抗生素的培养基；(3)转染4 后，分析mMyoG表达载体对mMyoG、肌纤维分型的影响，研究MyoG的功能。本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果本发明根据pTARGET 哺乳动物表达载体和NCBI上提供的基因信息，设计两对引物，通过RT-PCR得到mMyoG mRNA全长序列，然后连接到pTARGET 哺乳动物表达载体上，热激转化至大肠杆菌JM109，构建得到mMyoG重组表达质粒。本发明所用的表达载体pTARGET 方便易得，载体构建方法简单、可行，同时构建的表达质粒能高效地表达目的基因，是研究 mMyoG功能的一种较好的研究技术，对开展MyoG在成年动物肌纤维转化中的作用及对动物肉品质调节功能研究具有重要意义。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是RT-PCR扩增MyoG编码区全长电泳检测图；图中M-—DNA marker, 1-—引物1的扩增产物，2-—引物2的扩增产物；图2是阳性克隆PCR产物电泳检测图； 图中M-—DNA marker ； 1，2-—阳性克隆PCR产物电泳结果；图3是阳性克隆测序图谱；图4是重组表达质粒对mMyoG mRNA表达的影响图；(图中不同大写字母表示P< 0. 01)；图5是重组表达质粒对目的蛋白mMyoG表达影响的^festern Bloting检测结果；图6是重组表达质粒对四种肌球蛋白重链亚型基因mRNA表达的影响图；(图中不同小写字母表示P< 0. 05 ；不同大写字母表示P < 0. 01)；图中图6-1是重组表达质粒对MyHC-I mRNA表达的影响图；图6-2是重组表达质粒对MyHC-IIA mRNA表达的影响图；图6-3是重组表达质粒对MyHC-IIX mRNA表达的影响图；图6-4是重组表达质粒对MyHC-IIB mRNA表达的影响图；(不同大写字母表示P< 0.01)。
具体实施例方式(一)、小鼠Myogenin(MyoG)表达载体的构建与鉴定
1、根据GenBank上登录的小鼠MyoG基因序列设计并合成PCR引物引物I:上游引物5‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘下游引物5‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II:上游引物5‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5‘ -TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3 ‘；2、基因组总RNA提取及逆转录=Trizol法提取小鼠的基因组总RNA，并采用 琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测(验证其在提取过程中是否被降解，没有降解的情况 下才可以进行下一步的逆转录。)。然后以随机引物为逆转录引物逆转录合成cDNA(所得 的⑶NA用于下述步骤3)。反应体系为RNA 2 u g，随机引物1 y 1，逆转录酶1 P 1，buffer 4u 1, dNTP 24u 1, DEPC 水补至 20 yl 反应体积；反应条件为65°C，5min ； 25 °C, IOmin ； 42°C, Ih ；90°C, IOmin0随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，没 有明确的序列。3、目的基因片段的体外扩增及纯化引物I的目的片段长度为70恥？，引物II的目的片段长度为684bp，均含启动编 码序列ATG及终止编码序列TGA，并保证阅读框的完整。以cDNA为模板扩增MyoG，反应体 系为cDNA 1 u 1,10XPCR buffer 5 ii 1，MgCl2 Q5mM) 3 ii 1，dNTP (IOmM) 1 ii 1，上下游引物 (IOiiM)各 liil，Taq 酶 0. 5iil，DEPC 水 37. 5 u 1 ；PCR 反应条件为(1)94°C 预变性 2min ； (2)94°C变性 30sec，63°C 45sec，共 35 个循环；⑶ 72°C 10min，4°C保存。由引物 I、II 扩增 得到的PCR产物分别命名为MMGl与MMG2。4、小鼠MyoG表达质粒构建将纯化后的目的基因片段MMG1、MMG2与pTARGET 载体相连(重组质粒分别命名 为CMV-MMGl、CMV-MMG2)，4°C过夜，热激转化至感受态细胞JM109中，加入500 u 1 LB培养 基，37°C振荡培养2h，取200 ill涂于Amp/IPTG/X-Gal/LB平板上，37°C恒温培养箱过夜。5、重组质粒的鉴定将含步骤4构建所得的质粒的菌液经抗性初步筛选后(初步筛选具体为Amp/ IPTG/X-Gal/LB,Amp是抗生素筛选，IPTG/X-Gal是蓝白斑筛选)，挑取白色单菌落(经Amp/ IPTG/X-Gal/LB筛选得来)接种于細1液体LB培养基中(含Amp 100ng/ml)，37°C振荡培 养12h，进行PCR和克隆测序鉴定。菌液PCR反应体系如下表1所示表1、PCR反应体系
权利要求
1.小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤1)、根据载体的信息和靶序列设计并合成2对MyoGmRNA全长引物；2)、表达载体的构建引物退火后与PTARGET 载体连接转化，得到小鼠MyoG表达载体的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是所述步骤1)为根据Gene Bank上已知的MyoG基因的mRNA序列及pTARGET 哺乳动物表达载体的要求，设计2对引物，分别为引物I:上游引物5 ‘ -GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3 ‘下游引物5 ‘ -CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3 ‘引物II 上游引物5 ‘ -GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3 ‘下游引物5 ‘ -TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3 ‘。
3.根据权利要求2所述的小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是所述步骤2)为 将引物退火延伸后得到的PCR产物割胶回收，与表达载体pTARGET 相连，采用热激转化大肠杆菌JM109。
4.根据权利要求3所述的小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是对步骤幻所得的重组表达质粒进行鉴定通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定，测序引物为 T7引物。
5.利用如权利要求1 4所述方法构建而得的小鼠MyoG表达载体的用途，其特征是 用于研究MyoG基因对肉质的调控作用。
6.根据权利要求5所述的小鼠MyoG表达载体的用途，其特征是包括以下步骤(1)将含MyoG表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯无内毒素转染级质粒；(2)将含MyoG表达载体的高纯无内毒素转染级质粒转染小鼠C2C12成肌细胞等细胞， 37°C，5%的CO2中保温4 他后更换不含抗生素的培养基；(3)转染4 后，分析mMyoG表达载体对mMyoG、肌纤维分型的影响，研究MyoG的功能。
全文摘要
本发明公开了一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，包括以下步骤1)根据载体的信息和靶序列设计并合成2对MyoG mRNA全长引物；2)表达载体的构建引物退火后与pTARGETTM载体连接转化，得到小鼠MyoG表达载体的重组质粒。本发明的小鼠MyoG表达载体能用于研究MyoG基因对肉质的调控作用。
文档编号G01N33/53GK102344929SQ20111020270
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者冯杰, 朱琳娜, 汪以真, 王新霞, 郭佳, 韩菲菲 申请人:浙江大学