活血止痛胶囊的质量检测方法

文档序号:6101581阅读:438来源:国知局
专利名称:活血止痛胶囊的质量检测方法
技术领域
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种活血止痛胶囊的质量检测方法。
背景技术
活血止痛胶囊是原国家中药四类新药,国家中药保护品种,处方当归400g、乳香 (制)80g、三七80g、冰片20g、土鳖虫200g、自然铜(煅)120g,收载于《中华人民共和国卫生部药品标准新药转正标准》第十册WS3-084(Z-74)-95(Z)。制法以上六味,除冰片外,其余当归等五味粉碎成细粉;将冰片研细,与上述粉末配制,过筛,混勻,装胶囊,制成1000粒 (0.5g/粒);或者装胶囊,制成2000粒(0.25g/粒)。即得。发明人对现行的质量标准进行分析,发现存在以下问题1)只对当归药材进行薄层鉴别,比较单一,不易准确;幻含量测定方法采用薄层扫描法,重现性较差,受点样环境的影响较大,其薄层展开时受外界温湿度的影响,干扰因素较多;且结构相似的物质较难有效分离,检验周期较长。因此,发明人对现有质量标准进行了提高,具体表现在1)增加了乳香、三七、冰片的薄层鉴别;幻采用高效液相色谱法对阿魏酸进行含量测定。3)增加了土鳖虫的分子鉴定方法。该质量控制方法在进行分离检测时,能够抵抗干扰因素,检测效率高、稳定性好、分析速度快、检验周期短,是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法,为活血止痛胶囊的质量检测建立了一个准确可行的控制标准。

发明内容
本发明的目的是提供一种能准确、快捷检测活血止痛胶囊质量的检测方法。本发明的目的是通过以下方式实现的—种活血止痛胶囊的质量检测方法,其特征在于该检测方法包括鉴别及含量测定,其中含量测定方法包括以下步骤a)供试品溶液的制备取活血止痛胶囊内容物,研细,取1.9 2. lg,加入5 15%醋酸水溶液50ml,超声提取20 40分钟,放冷,用5 15%醋酸水溶液补足减失的重量,离心,吸取上清液25ml,用醋酸乙酯萃取2 4次,每次10 30ml,合并醋酸乙酯液,减压回收溶剂,残渣加甲醇使溶解并定容至10ml,摇勻,在避光条件下,过微孔滤膜,即得;b)对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每Iml含 10 20 μ g的溶液,即得;c)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为沈 30 70 74的甲醇-质量百分比浓度为0. 05 0. 1 %的磷酸水为流动相;检测波长为321nm ;理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。该方法中含量测定方法具体包括以下步骤
a)供试品溶液的制备取活血止痛胶囊内容物,研细,取2. 0g,加入10%醋酸水溶液50ml,超声提取30分钟,放冷,用10%醋酸水溶液补足减失的重量,离心,吸取上清液 25ml,用醋酸乙酯萃取3次,每次20ml,合并醋酸乙酯液,减压回收溶剂,残渣加甲醇使溶解并定容至10ml,摇勻,在避光条件下,过0. 45um微孔滤膜,即得;b)对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每Iml含 10 20 μ g的溶液,即得;c)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 20ul,注入液相色谱仪,测定,即得;色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为 28 72的甲醇-0.085%磷酸水为流动相;检测波长为321nm;理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000 ;活血止痛胶囊内容物含当归以阿魏酸计,质量百分含量不得少于0. 01%。所述的鉴别方法中,包括乳香鉴别、三七鉴别、冰片鉴别,具体步骤如下a、以乳香对照药材为对照,薄层条件为薄层G板,采用体积比为15 25 1 3, 沸点为30 60°C的石油醚和醋酸乙酯混合溶液为展开剂,10%的硫酸乙醇溶液为显色剂, 105°C加热至斑点显色;b、以三七对照药材为对照,薄层条件为硅胶G薄层板,采用体积比为2 6:1: 3 8的正丁醇-醋酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂,10%硫酸乙醇溶液为显色剂,105°C加热至斑点显色;C、以冰片对照药材为对照,薄层条件为硅胶G薄层板,采用体积比为15 25 1 3,沸点为30 60°C的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为展开剂,5%香草醛硫酸溶液为显色剂,在105°C加热至斑点显色。乳香鉴别方法具体包括以下步骤取活血止痛胶囊内容物0. 2 0. 5g,研细,加乙醚10 40ml,超声处理5 15分钟,滤过,滤液浓缩至1 5ml,作为供试品溶液。另取乳香对照药材0. 3 0. Sg,同法制成对照药材溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 10 μ 1,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为19 2沸点为30 60°C的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂,展开,展距为6 10cm,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,105°C加热至斑点显色,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。三七鉴别方法具体包括以下步骤取活血止痛胶囊内容物0. 2 0. 5g,研细,加乙醚20 60ml,超声处理5 15分钟,滤过,药渣挥去乙醚,加甲醇20 40ml,超声处理10 20分钟,滤过,滤液蒸干,加水 5 20ml溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2 3次,每次10 20ml,合并正丁醇液,用水洗涤2 3次,每次5 20ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇使溶解,作为供试品溶液;另取三七对照药材1 3g,加甲醇10 50ml,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 10 μ 1,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为4 1 5的正丁醇-醋酸乙酯-水溶液的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液, 105°C加热至斑点显色;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点ο冰片鉴别方法具体包括以下步骤
取活血止痛胶囊内容物0. 5 1. 5g,加沸点为30 60°C石油醚5 30ml,超声处理2 5分钟,滤过,滤液挥散至1 5ml,作为供试品溶液,另取冰片对照品,加沸点为 30 60°C石油醚制成每Iml含1 5mg的溶液,作为对照品溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 10 μ 1,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为19 2,沸点为 30 60°C石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,在105°C加热至斑点显色,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。该检测方法还可包括土鳖虫的分子鉴定,包括(1)活血止痛胶囊中土鳖虫基因组 DNA的提取纯化步骤;O) PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤;(3)扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤;其特征在于1)所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法先利用传统的蛋白酶K法初步提取活血止痛胶囊基因组DNA,然后加等体积的饱和酚三氯甲烷异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层,上清加等体积的三氯甲烷 异戊醇抽提,所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA ;2)所述的PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤是利用引物16Sra :SEQ ID NO. 1和16Srb SEQ ID NO. 2对步骤1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增;3)所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如果能扩增出420bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分。所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取具体步骤为取活血止痛胶囊内容物加勻浆缓冲液,50 60°C水浴4 6h,水浴结束后,冷至室温,加等体积的体积比为 25 24 1的饱和酚三氯甲烷异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层,上清加等体积的体积比为M 1的三氯甲烷异戊醇抽提一次,上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中,按照说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。所述的勻浆缓冲液组成由8份A液,1份B液,1份C液组成,其中A液pH8. 0的 Tris 0. 05mol 'T1jNaCl 0. Imol · ΛρΗ8· 0 的 EDTA 0. Imol .171 ;B 液5% SDS ;C 液:2mg/ mL蛋白酶K ;所述的PCR扩增体系为总体积25 μ L, 10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaqbuffer 2. 5μ L, Taq酶0.6U,5ymol/L引物16Sra禾口 16Srb各1 μ L,步骤(1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1 μ L,双蒸水补足体积至25 μ L,最后加10 μ L矿物油;反应程序为94°C预变性5min,94°C变性30s,50°C复性lmin,72°C延伸90s,35个循环后再72°C延伸 IOmin0与现有技术比较本发明的有益效果本发明质量控制方法分离效率高、稳定性好、 分析速度快,是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法,为活血止痛胶囊成品的质量控制建立了一个准确可行的控制标准。将现有标准进行了显著的提升。本发明通过以下试验例进行具体阐述。试验例1.含量测定方法参数选择实验活血止痛胶囊中当归为方中君药,其中阿魏酸为其主要活性成分,阿魏酸的结构式如下
权利要求
1.一种活血止痛胶囊的质量检测方法,其特征在于该检测方法包括鉴别及含量测定, 其中含量测定方法包括以下步骤a)供试品溶液的制备取活血止痛胶囊内容物,研细,取1.9 2. lg,加入5 15%醋酸水溶液50ml,超声提取20 40分钟,放冷,用5 15%醋酸水溶液补足减失的重量,离心,吸取上清液25ml,用醋酸乙酯萃取2 4次,每次10 30ml,合并醋酸乙酯液,减压回收溶剂,残渣加甲醇使溶解并定容至10ml,摇勻,在避光条件下,过微孔滤膜,即得;b)对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每Iml含 10 20 μ g的溶液,即得;c)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液,注入液相色谱仪,测定,即得;色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为沈 30 70 74的甲醇-质量百分比浓度为0.05 0.1%的磷酸水为流动相;检测波长为 321nm ;理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2000。
2.根据权利要求1所述的活血止痛胶囊的质量检测方法,其特征在于该方法中含量测定方法具体包括以下步骤a)供试品溶液的制备取活血止痛胶囊内容物,研细,取2.0g,加入10%醋酸水溶液 50ml,超声提取30分钟,放冷,用10%醋酸水溶液补足减失的重量,离心,吸取上清液25ml, 用醋酸乙酯萃取3次,每次20ml,合并醋酸乙酯液,减压回收溶剂,残渣加甲醇使溶解并定容至10ml,摇勻,在避光条件下,过0. 45um微孔滤膜,即得;b)对照品溶液的制备取阿魏酸对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每Iml含 10 20 μ g的溶液,即得;c)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 20ul,注入液相色谱仪,测定,即得;色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以体积比为观72 的甲醇-0. 085%磷酸水为流动相;检测波长为321nm ;理论板数按阿魏酸峰计算应不低于 2000。
3.根据权利要求1或2所述的质量检测方法,其特征在于含量测定方法中,活血止痛胶囊内容物含当归以阿魏酸计,质量百分含量不得少于0.01 %。
4.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于所述的鉴别方法中,包括乳香鉴别、三七鉴别、冰片鉴别,具体步骤如下a、以乳香对照药材为对照,薄层条件为薄层G板,采用体积比为15 25 1 3,沸点为30 60°C的石油醚和醋酸乙酯混合溶液为展开剂,10%的硫酸乙醇溶液为显色剂, 105°C加热至斑点显色;b、以三七对照药材为对照,薄层条件为硅胶G薄层板,采用体积比为2 6 1 3 8的正丁醇-醋酸乙酯-水混合溶液的上层溶液为展开剂,10%硫酸乙醇溶液为显色剂, 105°C加热至斑点显色;c、以冰片对照药材为对照,薄层条件为硅胶G薄层板,采用体积比为15 25 1 3, 沸点为30 60°C的石油醚和乙酸乙酯混合溶液为展开剂,5%香草醛硫酸溶液为显色剂, 在105°C加热至斑点显色。
5.根据权利要求4所述的质量检测方法,其特征在于乳香鉴别方法具体包括以下步骤取活血止痛胶囊内容物0. 2 0. 5g,研细,加乙醚10 40ml,超声处理5 15分钟, 滤过,滤液浓缩至1 5ml,作为供试品溶液。另取乳香对照药材0. 3 0. Sg,同法制成对照药材溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 10 μ 1,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为19 2沸点为30 60°C的石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂,展开, 展距为6 10cm,取出,晾干,喷以10%的硫酸乙醇溶液,105°C加热至斑点显色,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
6.根据权利要求4所述的质量检测方法,其特征在于三七鉴别方法具体包括以下步骤取活血止痛胶囊内容物0. 2 0. 5g,研细,加乙醚20 60ml,超声处理5 15分钟, 滤过,药渣挥去乙醚,加甲醇20 40ml,超声处理10 20分钟,滤过,滤液蒸干,加水5 20ml溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取2 3次,每次10 20ml,合并正丁醇液,用水洗涤 2 3次,每次5 20ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇使溶解,作为供试品溶液;另取三七对照药材1 3g,加甲醇10 50ml,同法制成对照药材溶液;照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 10 μ 1,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为4 1 5的正丁醇-醋酸乙酯-水溶液的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105°C加热至斑点显色;供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
7.根据权利要求4所述的质量检测方法,其特征在于冰片鉴别方法具体包括以下步骤取活血止痛胶囊内容物0. 5 1. 5g,加沸点为30 60°C石油醚5 30ml,超声处理 2 5分钟,滤过,滤液挥散至1 5ml,作为供试品溶液,另取冰片对照品,加沸点为30 600C石油醚制成每Iml含1 5mg的溶液,作为对照品溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两种溶液各1 ΙΟμΙ,分别点于同一硅胶G薄层板上,以体积比为19 2,沸点为30 60°C石油醚-醋酸乙酯混合溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,在 105°C加热至斑点显色,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。
8.根据权利要求1所述的质量检测方法,其特征在于该检测方法还包括土鳖虫的分子鉴定,包括(1)活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤;( PCR扩增土鳖虫 IBSrRNA步骤;(3)扩增产物电泳鉴定和/或测序鉴定步骤;其特征在于1)所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取纯化步骤采用改良蛋白酶K结合吸附柱法先利用传统的蛋白酶K法初步提取活血止痛胶囊基因组DNA,然后加等体积的饱和酚三氯甲烷异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层,上清加等体积的三氯甲烷异戊醇抽提,所得上清转移至胶回收试剂盒的吸附柱中按照传统的吸附柱法纯化DNA ;2)所述的PCR扩增土鳖虫16SrRNA步骤是利用引物16Sra=SEQ ID NO. 1和16Srb =SEQ ID NO. 2对步骤1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA进行扩增;3)所述的扩增产物电泳鉴定步骤是将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,如果能扩增出420bp左右的条带则表示活血止痛胶囊中含有土鳖虫组分。
9.根据权利要求8所述的质量检测方法,其特征在于所述的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA的提取具体步骤为取活血止痛胶囊内容物加勻浆缓冲液,50 60°C水浴4 6h, 水浴结束后,冷至室温,加等体积的体积比为25 24 1的饱和酚三氯甲烷异戊醇抽提至水层与酚层中间无蛋白层,上清加等体积的体积比为M 1的三氯甲烷异戊醇抽提一次,上清转移至常规胶回收试剂盒的吸附柱中,按照说明书记载的方法获得纯化的活血止痛胶囊中土鳖虫基因组DNA溶液。
10.根据权利要求8所述的质量检测方法,其特征在于所述的勻浆缓冲液组成由8份 A 液,1 份 B 液,1 份 C 液组成,其中 A 液:pH8. 0 的 Tris 0. 05mol · Λ NaCl 0. Imol · Λ ρΗ8· 0的EDTA 0. Imol .Γ1 ;B液5% SDS ;C液:2mg/mL蛋白酶K ;所述的PCR扩增体系为 总体积 25μ L,10mmol/L dNTPs 2 μ L, IOXTaqbuffer 2· 5 μ L,Taq 酶 0. 6U,5 μ mol/L 引物 16Sra和16Srb各1 μ L,步骤(1)提取纯化的活血止痛胶囊基因组DNA溶液1 μ L,双蒸水补足体积至25 μ L,最后加10 μ L矿物油;反应程序为94°C预变性5min,94°C变性30s,50°C 复性lmin,72°C延伸90s, 35个循环后再72°C延伸IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种活血止痛胶囊的质量检测方法,该检测方法提供了乳香、三七、冰片的薄层鉴别,土鳖虫的分子鉴定,采用高效液相色谱法对阿魏酸进行含量测定。本发明质量控制方法在进行分离检测时,能够抵抗干扰因素,检测效率高、稳定性好、分析速度快、检验周期短,是控制活血止痛胶囊质量可靠的方法,为活血止痛胶囊的质量检测建立了一个准确可行的控制标准。
文档编号G01N30/06GK102288708SQ20111022703
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月9日 优先权日2011年8月9日
发明者徐云辉, 戴瑞, 濮存海, 王波, 赵开军, 陈磊 申请人:南京中山制药有限公司
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